استخدام الرحلان الحراري المجهري لقياس التفاعلات بين البروتين والدهون

Robert P. Sparks; William Lawless; Andres  S. Arango; Emad Tajkhorshid; Rutilio  A. Fratti

doi:10.3791/60607

يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

استخدام الرحلان الحراري المجهري لقياس التفاعلات بين البروتين والدهون

7.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60607

⸱

فبراير 10, 2022

Robert P. Sparks^*¹ , William Lawless^*² , Andres S. Arango^*¹^,³^,⁴ , Emad Tajkhorshid¹^,³^,⁴ , Rutilio A. Fratti¹^,³

¹Department of Biochemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, ²Department of Chemistry, University of South Florida, ³Center for Biophysics and Quantitative Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, ⁴Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois at Urbana-Champaign

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يحصل الرحلان الحراري المجهري على ثوابت ربط بسرعة بتكلفة مادية منخفضة. إما الرحلان الحراري المجهري المسمى أو الخالي من التسمية متاح تجاريا. ومع ذلك ، فإن الرحلان الحراري الخالي من الملصقات غير قادر على تنوع قياسات التفاعل التي يمكن إجراؤها باستخدام ملصقات الفلورسنت. نحن نقدم بروتوكولا لقياسات الرحلان الحراري الموسومة.

الملخص

تعد القدرة على تحديد التقارب المرتبط للدهون بالبروتينات جزءا أساسيا من فهم التفاعلات بين البروتين والدهون في الاتجار بالأغشية ونقل الإشارات وإعادة تشكيل الهيكل الخلوي. وتشمل الأدوات الكلاسيكية لقياس هذه التفاعلات رنين البلازمون السطحي (SPR) وقياس كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC). في حين أن هذه الأساليب قوية ، إلا أنها تنطوي على انتكاسات. يتطلب مركز التجارة الدولية كميات كبيرة من البروتين النقي وكذلك الدهون ، والتي يمكن أن تكون مكلفة ويصعب إنتاجها. وعلاوة على ذلك، فإن مركز التجارة الدولية وكذلك SPR يستهلكان وقتا طويلا جدا، مما قد يضيف بشكل كبير إلى تكلفة إجراء هذه التجارب. إحدى الطرق لتجاوز هذه القيود هي استخدام تقنية جديدة نسبيا للرحلان الحراري المجهري (MST). MST سريع وفعال من حيث التكلفة باستخدام كميات صغيرة من العينة للحصول على منحنى تشبع لحدث ربط معين. يوجد حاليا نوعان من أنظمة MST المتاحة. يتطلب نوع واحد من MST وضع العلامات باستخدام الفلوروفور في الطيف الأزرق أو الأحمر. يعتمد النظام الثاني على التألق الجوهري للأحماض الأمينية العطرية في نطاق الأشعة فوق البنفسجية. يكتشف كلا النظامين حركة الجزيئات استجابة للتحريض الموضعي للحرارة من ليزر الأشعة تحت الحمراء. كل نهج له مزاياه وعيوبه. يمكن أن يستخدم MST الخالي من الملصقات بروتينات أصلية غير موسومة ؛ ومع ذلك ، فإن العديد من التحليلات ، بما في ذلك المستحضرات الصيدلانية ، الفلوريس في نطاق الأشعة فوق البنفسجية ، والتي يمكن أن تتداخل مع تحديد قيم KD الدقيقة. وبالمقارنة، يسمح MST المسمى بتنوع أكبر في التفاعلات الزوجية القابلة للقياس باستخدام مجسات تحمل علامات فلورسنت متصلة بالأربطة ذات الامتصاص القابل للقياس في النطاق المرئي بدلا من الأشعة فوق البنفسجية، مما يحد من إمكانية تداخل الإشارات من التحليلات.

المقدمة

الرحلان الحراري المجهري هو تقنية جديدة نسبيا في تحديد ثوابت فك الارتباط (KD) وكذلك ثوابت التثبيط (_IC50) بين الأربطة ذات الصلة كيميائيا حيويا. تقدم شركة التجزئة التجارية الرائدة في مجال MST (على سبيل المثال ، NanoTemper) تقنيتين شائعتين من تقنيات MST: 1) MST خالية من الملصقات تتطلب علامة فلورسنت ، و 2) الرحلان الحراري المسمى باستخدام التألق المتأصل للبروتينات التي تعتمد على عدد المخلفات العطرية الموجودة في كل بروتين ¹. من عيوب الرحلان الحراري الخالي من الملصقات أنه في معظم الحالات ، لا يسمح بقياس تفاعلات البروتين والبروتين. ومع ذلك ، قد يكون من الممكن هندسة البروتينات بدون أحماض أمينية عطرية مثل التربتوفان....