단백질-지질 상호작용을 측정하기 위한 마이크로스케일 열영동 사용

Robert P. Sparks; William Lawless; Andres  S. Arango; Emad Tajkhorshid; Rutilio  A. Fratti

doi:10.3791/60607

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방법 논문

단백질-지질 상호작용을 측정하기 위한 마이크로스케일 열영동 사용

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DOI:

10.3791/60607

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2022년 2월 10일

Robert P. Sparks^*¹ , William Lawless^*² , Andres S. Arango^*¹^,³^,⁴ , Emad Tajkhorshid¹^,³^,⁴ , Rutilio A. Fratti¹^,³

¹Department of Biochemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, ²Department of Chemistry, University of South Florida, ³Center for Biophysics and Quantitative Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, ⁴Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois at Urbana-Champaign

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

마이크로스케일 열영동은 낮은 재료 비용으로 결합 상수를 신속하게 획득한다. 표지 또는 라벨이 없는 마이크로스케일 열영동이 상업적으로 입수가능하거나; 그러나, 라벨 없는 열영동은 형광 표지를 사용하여 수행될 수 있는 상호작용 측정의 다양성을 할 수 없다. 우리는 라벨이 붙은 열영동 측정을위한 프로토콜을 제공합니다.

초록

단백질에 대한 지질의 결합 친화도를 결정하는 능력은 막 밀매, 신호 전달 및 세포 골격 리모델링에서 단백질-지질 상호작용을 이해하는 데 필수적인 부분이다. 이러한 상호 작용을 측정하기위한 고전적인 도구에는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및 등온 적정 열량계 (ITC)가 포함됩니다. 강력한 도구이지만 이러한 접근 방식에는 어려움이 있습니다. ITC는 지질뿐만 아니라 다량의 정제 된 단백질을 필요로하며, 이는 비용이 많이 들고 생산하기가 어려울 수 있습니다. 또한 ITC와 SPR은 매우 시간이 많이 걸리므로 이러한 실험을 수행하는 데 드는 비용이 크게 추가 될 수 있습니다. 이러한 제한을 우회하는 한 가지 방법은 마이크로스케일 열영동(MST)의 비교적 새로운 기술을 사용하는 것이다. MST는 주어진 결합 이벤트에 대한 포화 곡선을 얻기 위해 소량의 샘플을 사용하여 빠르고 비용 효율적입니다. 현재 사용할 수 있는 MST 시스템에는 두 가지 유형이 있습니다. MST의 한 유형은 파란색 또는 빨간색 스펙트럼의 형광단으로 라벨링해야합니다. 두 번째 시스템은 UV 범위에서 방향족 아미노산의 고유 형광에 의존합니다. 두 시스템 모두 적외선 레이저에서 열의 국부적 인 유도에 반응하여 분자의 움직임을 감지합니다. 각 접근 방식에는 장점과 단점이 있습니다. 라벨이 없는 MST는 태그가 지정되지 않은 천연 단백질을 사용할 수 있습니다. 그러나, 의약품을 포함한 많은 분석물은, UV 범위의 형광, 이는 정확한 KD 값의 결정을 방해할 수 있다. 비교해 보면, 표지된 MST는 UV와 반대되는 가시 범위에서 측정 가능한 흡수율을 갖는 리간드에 부착된 형광 표지된 프로브를 활용하여 측정 가능한 쌍 상호작용의 더 큰 다양성을 허용하여, 분석물로부터의 신호를 방해할 가능성을 제한한다.

서론

마이크로스케일 열영동은 생화학적으로 관련된 리간드 사이의 분해 상수 (KD) 및 억제 상수 (_IC50)를 결정하는 비교적 새로운 기술이다. MST (예를 들어, NanoTemper)에 대한 선도적 인 상업 소매 업체는 두 가지 인기있는 MST 기술을 제공합니다 : 1) 형광 태그를 필요로하는 라벨없는 MST 라벨 및 2) 각 단백질에 존재하는 방향족 잔기의 수에 의존하는 단백질의 고유 형광을 사용하는 표지 된 열 영동¹. 라벨이 없는 열영동의 단점은 대부분의 경우 단백질-단백질 상호작용의 측정을 허용하지 않는다는 것이다. 그러나, 라벨 프리 열영동2에 사용하기 위해 트립토판과 같은 방향족 아미노산 없이 단백질을 조작^{하는 것이 가능}할 수 있다.

MST는 현재 이용 가능한 기술에서 적외선 레이저에 의해 개시되는 미세한 온도 필드의 유도에 응답하여 입자의 이동을 측정한다¹. MST는 단백질-단백질 상호작용, 단백질-지질 상호작용, 단백질-소분자, 경쟁 실험, 심지어 소분자 간의 상호작용까지 측정하는데 사용될 수 있으며, 이는 충분한 신호 분리를 생성할....