Summary
PD-1-bloke antikorların T hücrelerine bağlanmasını değerlendirmek için basit bir akış sitometrisi tsay geliştirdik ve kanser hastalarından sadece bir damla periferik kan almasını gerektiren bir çalışma sitometri sitometri sitometri sitometri sitometri sitometri sitometri geliştirdik.
Abstract
PD-1-bloke antikorlar da dahil olmak üzere bağışıklık kontrol noktası inhibitörleri, kanser çeşitli tedavi sonuçları önemli ölçüde iyileşmiştir. Bu immünoterapilerin farmakolojik etkinliği uzun ömürlüdür, kalıcı kan konsantrasyonları nedeniyle enjeksiyonlarının kesilmesinin bile ötesine uzanır. Burada PD-1-bloke antikorlar nivolumab ve pembrolizumab T hücre bağlama durumunu değerlendirmek için basit bir akış sitometri tsay geliştirdi. Glikoz testi gibi, bu tahlil sadece bir damla periferik kan gerektirir. T hücrelerinde antikor bağlanmasını görselleştirmek antikor kan konsantrasyonlarını ölçmekten daha güvenilirdir. Buna ek olarak, gerekirse, PD-1-bloke edici antikorlara bağlı T hücrelerinde bağışıklıkla ilgili birçok ayırt edici belirteçleri analiz edebiliriz. Bu nedenle, bu kanser hastalarında PD-1-bloke antikorların farmakolojik etkisini analiz etmek için basit ve minimal invaziv bir stratejidir.
Introduction
PD-1-bloke antikorlar kanser çeşitli tedavi için standart seçim haline gelmiştir, küçük hücreli dışı akciğer kanseri de dahil olmak üzere (NSCLC)1,2,3,4. Onlar konvansiyonel sitotoksik chemotherapies yanıt vermedi kanser hastalarının bir alt kümesinde dikkate değer bir terapötik etki göstermektedir. Ancak, pd-1-bloke antikorlar içeren bağışıklık kontrol noktası inhibitörleri (ICIs), advers olayların benzersiz ve farklı bir spektrum neden olabilir, immün ilişkili advers olaylar (irAEs) olarak adlandıran5. IrAEs hemen hemen tüm dokuları etkileyebilir rağmen, en sık gastrointestinal sistem gözlenen, endokrin bezleri, cilt, ve karaciğer, ve onlar kaşıntı neden olabilir, döküntü, mide bulantısı, ishal, ve tiroid bozuklukları6,7. Genel olarak, çoğu irAEs ICIs başlatılmasından sonra 1 ila 2 ay içinde görünür. Ancak, bazı durumlarda, onlar tedavinin başlamasından sonra 1 yıl daha sonra oluşabilir hatta tedavi kesilmesinden sonra6,7. Ayrıca diğer patolojilerden ayırt etmek zor olabilir çeşitli belirtilere neden olur. Bu nedenle, irAEs derhal teşhis etmek ve uygun şekilde tedavi etmek zor olabilir. irAE'ler tüm dokuları etkileyebilir ve bunların başlangıcı, özellikle PD-1-bloke edici antikorlara bağlı T hücreleri olmak üzere dolaşan bağışıklık hücrelerinden güçlü bir şekilde etkilenir. Bu nedenle, antikor hedefli T hücrelerini izlemek için basit ve minimal invaziv bir yöntem klinik ortamlarda önemlidir.
Burada, nivolumab veya pembrolizumab alan kanser hastalarından periferik tam kan damlası kullanarak PD-1-bloke antikorların T hücrelerine bağlanmasını değerlendirmek için basit bir yöntem geliştirdik. Bu yaklaşımı kullanarak, aşağıdakilerin her birini izleyebildik: 1) T hücrelerine bağlanma nın süresi, 2) T hücre PD-1 moleküllerinin terapötik antikorlar tarafından doluluğu ve 3) T hücrelerinin aktivasyon durumu ve immünolojik özellikleri. Bu yöntem, daha önce bildirilen teknik8bir değişikliktir. Gerekli kan miktarı bir glikoz testi için gerekli hemen hemen aynıdır, ve yaklaşım mononükleer hücre zenginleştirme veya PD-1-bloke antikorlar ile co-culturing gerektirmez. Bu yöntemin periferik kan mononükleer hücreleri (PBMCs) ve plevral efüzyon, perikardiyal efüzyon, bronkoalveoler lavaj sıvısı ve beyin omurilik sıvısı hücreleri de dahil olmak üzere dondurulmuş numuneler kullanılarak da uygulanabileceğini doğruladık ve bu stratejinin çok merkezli bir çalışma bağlamında yararlı olabileceğini öne sürdük. Bu yöntem irAE'lerin erken tanısını kolaylaştırabilir ve aynı zamanda semptomlarını kontrol etmek için uygun immünsupresif tedavilerin belirlenmesine ve PD-1 inhibitörlerinden sonra sonraki tedavilerin başlatılması için en uygun süreyi belirlemeye yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Rutin klinik işlemler sırasında örnekleme yapıldı. Tüm insan örnekleri, Helsinki Bildirgesi uyarınca ve Japonya Osaka Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik İnceleme Kurulu'nun (15383 ve 752) etik inceleme kurulunun onayı ile, denekler tarafından bilgilendirilmiş onay sağlandıktan sonra elde edilmiştir.
1. Tam Kan Örneği Hazırlama ve Boyama
- Etilen diamin tetra-asetik asit (EDTA) içeren kan toplama tüpleri içine tam kan örnekleri toplamak.
NOT: Kan toplama ya normal bir iğne ya da kan lancet kullanılarak yapılabilir. - 20 μL'lik tam kan örneğini 5 mL yuvarlak alt polistiren akış sitometri tüplerine aktarın.
NOT: Hücrelerin tüplere spesifik olmayan bağlanmasını azaltmak için, fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1 mL fetal sığır serumu (FBS) tüplere eklenir ve numunelere uygulanmadan önce 10 s'lik girdaplar eklenir. - PBS'de %2 FBS 20 μL ekleyin.
- 10 μL insana özel FcR engelleme reaktifi ekleyin. İyi bir şekilde karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Kırmızı kan hücresi lysis tampon 500 μL ekleyin. İyi bir şekilde karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.
- PBS'de %2 FBS'nin 4 mL'sini ekleyin ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g (1.500 rpm) ile hücreleri aşağı doğru döndürün. Aspirasyon tarafından supernatant kaldırın.
- Adım 1.6'da açıklanan yıkama ve aspirasyon işlemini tekrarlayın.
- PBS'de 100 μL 'lik 2 FBS'lik hücreler yeniden askıya alın ve her biri 50 μL'lik iki tüpe bölün.
- Yüzey marker antikorları ekleyin (Tablo 1). İyi bir şekilde karıştırın ve karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: T hücresi nin immün durumu profilleme, belirteçleri sayısı akış sitometri makine kalitesine göre artırılabilir. - 1.6 adımda açıklandığı gibi örnekleri 2kat yıkayın.
- PBS'de 200 μL ve %2 FBS'lik resuspend hücreleri.
2. Akış Sitometrik Analizi
- Akış sitometre içine tüpler takın ve temelde önerilen protokol9aşağıdaki hücreleri elde .
- 10.000 olayı lenfosit kapısı(Şekil 1A)olarak kaydedin ve akış verilerini analiz için .fcs dosyaları olarak dışa aktarın.
- Analiz yazılımındaki dosyaları açın. Hücreleri ileri dağılımda (FSC) (A) ve yan dağılım (SSC) (A) çizimi ve kapı lenfositlerini görselleştirin(Şekil 1A).
- FSC (H) ve SSC (H) ve SSC (H) ve SSC (W)(Şekil 1B)kullanarak tek hücreleri seçtikten ve cd3 vs. CD8 veya CD3 vs. CD4 çiziminde görüntüledikten sonra, sırasıyla CD8 T hücreleri ve CD4 T hücrelerini(Şekil 1C)açar.
- Kapılı hücreleri seçtikten ve pd-1 vs insan IgG4 çiziminde görüntüledikten sonra, izotip kontrolüne dayalı OLARAK PD-1-bloke edici antikor bağlı CD8 ve CD4 T hücrelerini tanımlayın (Şekil 1D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gating stratejisi ve akış sitometri analizi(Şekil 1)NSCLC hasta periferik kan damlasından elde edilen T hücrelerine bağlanan PD-1-bloke antikor ları saptayabiliyor. PD-1-bloke edici antikor verilmeden önce insan IgG4-pozitif CD8 veya CD4 T hücreleri bulunmaz ve PD-1 ekspresyonu PD-1-saptanan antikor (EH12.1) ile doğrulanabilir(Şekil 2A). Nivolumab veya pembrolizumab uygulamasından sonra, IgG4 (nivolumab, pembrolizumab) T hücrelerinde anti-IgG4 antikor (HP6025) ile tespit edilebilirken, PD-1-tespit antikor EH12.1 t hücrelerinde herhangi bir PD-1 tanımaz çünkü terapötik PD-1 antikorlar EH12.1 bağlayıcıyı bozar. Bu, PD-1-tespit antikor bağlama eksikliğine bağlı olarak PD-1-bloke edici antikor terapötik bağlayıcılığı dolaylı olarak ölçtüğüz anlamına gelir. Temsili veriler, PD-1-bloklayan antikorların farklı bağlama durumlarını göstermektedir (Şekil 2A). Nivolumab ve pembrolizumab bağlanması ve T hücrelerinde PD-1 doluluk zaman içinde azalır10, ve kısmi bağlama (PB), çift pozitif alanda gösterilir, ve nihayet tam bağlama kaybı (LB) (Şekil 2B).
Şekil 1: PD-1-bloke edici antikortif tperiferik kan damlası T hücrelerine bağlanmasını değerlendirmek için temsili gating stratejisi. (A) FSC (A) vs SSC (A) arsa ve lenfositlerin gating. (B) Çiftler, FSC (H) ve SSC (H) ve SSC (W) (W) arsalarında ana hücre popülasyonunun etrafına geçit ler çizilerek dışlanır. (C) CD3 vs. CD8 çizimi (üst) ve CD3 vs. CD4 çizimi (alt) ve CD8 T hücreleri ile CD4 T hücrelerinin sırasıyla gating'i. (D) PD-1 vs insan IgG4 arsa ve nivolumab (pd-1-bloke antikor) CD8 ve CD4 T hücrelerine bağlanmasının tespiti. Turuncu noktalar ve siyah noktalar sırasıyla anti-IgG4 antikor ve isotip kontrol boyama gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: PD-1-bloke antikorların bağlayıcı durumundaki değişikliği gösteren temsili akış sitometri analizi. (A) ICI-tedavi edilen hasta kanından CD8 T hücrelerinde PD-1 ve insan IgG4 boyama akış sitometrisi (solda) ile değerlendirildi. 15 dakika boyunca 15 dakika boyunca nivolumab ın seri seyreltilmesi ile on mikrolitre pretreated kan tedavi edildi ve protokolün 1.4 ila 1.10 adımları tamamlandı. Tam bağlama (CB) (kırmızı), kısmi bağlama (PB) (mavi) ve bağlama kaybı (LB) (yeşil) belirtilen kapılar tarafından tanımlanır. (B) NIVOLUMAB ve pembrolizumab'ı durduran NSCLC hastalarında, CD8 T hücrelerine bağlanan PD-1-bloke edici antikor ların durumu takip zaman noktalarında analiz edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Pe | BV421 | PE-Cy7 | APC-Cy7 | BV510 | |
| Bağlayıcı değerlendirme | IgG4 | CD3 | PD-1 | CD4 | CD8 |
| Isotip kontrolü | Isotip kontrolü | CD3 | Isotip kontrolü | CD4 | CD8 |
Tablo 1: Akış sitometrik analizinde kullanılan antikorlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, başlangıçta nivolumabtespitiiçin geliştirdiğimiz periferik kan damlasından elde edilen T hücrelerine bağlı PD-1-bloke edici antikorları tespit etmek için bir akış sitometresi kullanarak bir yöntem rapor ediyoruz. Bu teknik çok basit ve kolay bir şekilde gerçekleştirilebilmesine rağmen, doğru sonuçlar elde etmek için iki önemli noktaya dikkat edilmelidir. Bir PD-1 molekülleri tespit etmek için, nivolumab ve pembrolizumab ile rekabet uygun bir antikor kullanılmalıdır. Bu konu bir önceki çalışmada11olarak değerlendirilmiştir. Diğeri ise yüzey boyamadan önce RBC lysis'in iyice yapılması gerektiğidir. IgG4-pozitif kümenin kapısını belirlemek için her bir tetkik için bir iyotip denetimi kurulduğu sürece, frekans etkilenmez. Ancak bu protokol ile RBC lysis yetersiz olduğunda lenfosit kapısında hem T hücre sayısında hem de her bir yüzey belirtecinin yoğunluğunda azalma lar olabilir. Buna ek olarak, Yüzey boyama önce RBC lysis adımı yapılmalıdır, aksi takdirde anti-IgG4 antikor (HP6025) düzgün çalışmaz.
Bu yöntemin sınırlaması, PD-1-bloke antikorlara bağlı T hücrelerinin popülasyonunun terapötik etkilerden ve irAE'lerden sorumlu spesifik T hücre klonlarını içermesidir; ancak, antikora bağlı popülasyon da bu spesifik klonların frekansları oldukça düşüktür. Bu nedenle, cd3912gibi belirli işaretleri kullanarak belirli bir hedefi zenginleştirmemiz gerekir. Başka bir sınırlama igG4 floresan yoğunluğu bazı durumlarda yüksek değildir, hangi zor bağlayıcı durumu belirlemek için yapar (yani, PB ve LB).
Diğer çalışmalar farmakokinetik değerlendirmek için kanda terapötik PD-1 antikorları izlemiş. Nivolumab veya pembrolizumab plazma konsantrasyonunun ölçülmesi kanda bu antikorların kalıntı miktarı zaman ile ilişkili nasıl belirlemek için gereklidir. Ancak, daha önce nivolumab konsantrasyonunun T hücrelerine kalıntı bağlanma ile tamamen ilişkili olmadığınıbildirdi10. Plazma antikor konsantrasyonu ölçümü ile karşılaştırıldığında13,yöntemimiz anti-PD-1 antikorlarının T hücrelerine kalan bağlanmasını değerlendirmek için daha uygun olabilir. Kanda T hücrelerine bağlanan nivolumab bağlama izleme orijinal yöntem floresan etiketli nivolumab8ile kuluçka gerekli . Bu yaklaşımı basitleştirdik ve tahlil süresini ve analiz için gereken kan miktarını önemli ölçüde azaltmayı başardık.
Dondurulmuş hücreler de bu test kullanılarak analiz edilebilir, bu yöntem çok merkezli çalışmalar için iyi bir uyum olduğunu düşündürmektedir. Bu yaklaşımın kullanışlılığı, PD-1-bloke antikorlara bağlı T hücrelerinin Ki-67 gibi diğer immünolojik belirteçleri ile izleme bağlayıcılık durumunu birleştirerek daha da artırılacaktır10. Gelecekteki çalışmalar, PD-1-blokaj antikorlarına bağlı olan ve irAE'lerden sorumlu olan T hücrelerinin spesifik alt kümelerini belirlemek ve karakterize etmek için tek hücreli RNA dizilimi ve T hücre reseptör dizilimi ile birlikte metodumuzu kullanmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Japonya Bilim KAKENHI (JP17K16045) ve Japonya Tıbbi Araştırma ve Geliştirme Ajansı (JP18cm0106335 ve 19cm0106310) için Japonya Derneği'nden S.K.'ye verilen hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X RBC Lysis Buffer (Multi-species) | Thermo Fisher Scientific | 00-4300-54 | 50 mL |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 300518 | Clone RPA-T4 |
| BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD | ||
| Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody | BioLegend | 301048 | Clone RPA-T8 |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | nacalai tesque | 14249-95 | 500 mL |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | STEMCELL Technologies | 352058 | 5 mL |
| FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | 2 mL |
| FLOWJO | BD | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12676029 | 500 mL |
| Mouse IgG1 monoclonal - Isotype control | abcam | ab81200 | |
| Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc | abcam | ab99825 | Clone HP6025 |
| Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3 | BD | 558117 | Clone UCHT1 |
| PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1) | BD | 561272 | Clone EH12.1 |
| PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557646 |
References
- Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8 (2018).
- Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (17), 1627-1639 (2015).
- Brahmer, J., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (2), 123-135 (2015).
- Herbst, R. S., et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).
- Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. Immune-Related Adverse Events Associated with Immune Checkpoint Blockade. The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).
- Weber, J. S., et al. Safety Profile of Nivolumab Monotherapy: A Pooled Analysis of Patients With Advanced Melanoma. Journal of Clinical Oncology. 35 (7), 785-792 (2017).
- Champiat, S., et al. Management of immune checkpoint blockade dysimmune toxicities: a collaborative position paper. Annals of Oncology. 27 (4), 559-574 (2016).
- Brahmer, J. R., et al. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. Journal of Clinical Oncology. 28 (19), 3167-3175 (2010).
- Bommareddy, P. K., Lowe, D. B., Kaufman, H. L., Rabkin, S. D., Saha, D. Multi-parametric flow cytometry staining procedure for analyzing tumor-infiltrating immune cells following oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in intracranial glioblastoma. Journal of Biological Methods. 6 (2), 112 (2019).
- Osa, A., et al. Clinical implications of monitoring nivolumab immunokinetics in non-small cell lung cancer patients. JCI Insight. 3 (19), 59125 (2018).
- Zelba, H., et al. Accurate quantification of T-cells expressing PD-1 in patients on anti-PD-1 immunotherapy. Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (12), 1845-1851 (2018).
- Simoni, Y., et al. Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates. Nature. 557 (7706), 575-579 (2018).
- Chiu, H. H., et al. Development of a general method for quantifying IgG-based therapeutic monoclonal antibodies in human plasma using protein G purification coupled with a two internal standard calibration strategy using LC-MS/MS. Analytica Chimica Acta. 1019, 93-102 (2018).
