Summary
我々は、婦人科および泌尿器科癌細胞株および患者由来腫瘍の生着のための代替、移植可能なインビボモデルとして鶏絨毛アラント膜モデルを提示する。
Abstract
マウスモデルは、インビボ癌研究のベンチマーク検査です。しかし、コスト、時間、倫理的配慮により、生体内がんモデルの代替が求められています。鶏絨毛性膜(CAM)モデルは腫瘍の発生の直接視覚化を可能にし、生体内のイメージ投射のために適している安価で、急速な代わりの代わりを提供する。そこで、婦人科腫瘍と泌尿器科腫瘍をこのモデルに移植するための最適化されたプロトコルを開発しようとしました。受精後約7日間、空気細胞は卵の血管化側に移動し、そこで開口部がシェルに作成される。マウスおよびヒト細胞株および一次組織からの腫瘍は、その後生着することができる。これらは、通常、細胞外マトリックスと培地の混合物に播種され、細胞の分散を回避し、細胞が血管供給を募集するまで栄養補助を提供する。腫瘍は、卵が孵化する前にさらに14日間まで成長し得る。ホタルルシフェラーゼを安定してトランスキュアした細胞を移植することにより、生物発光イメージングは、胚全体に広がる膜および癌細胞上の腫瘍増殖の敏感な検出に使用することができる。このモデルは、潜在的に腫瘍原性、浸潤、転移、および治療効果を研究するために使用することができます。鶏のCAMモデルは従来のマウスモデルと比較してかなり少ない時間および財源を必要とする。卵は免疫不全で免疫寛容であるため、あらゆる生物の組織を、ヒト組織の移植に必要な高価なトランスジェニック動物(例えばマウス)なしで移植できる可能性がある。しかし、このモデルの利点の多くは、腫瘍発生時間の短縮や免疫不全/免疫寛容な状態など、潜在的に制限である可能性があります。さらに、ここに提示されたすべての腫瘍タイプは鶏絨毛性膜モデルに生着したが、腫瘍の成長の程度はさまざまである。
Introduction
マウスは、悪性腫瘍を含むヒト疾患の研究のための古典的なモデル生物として機能している。哺乳類として、彼らは人間と多くの類似点を共有しています。それらの高度な遺伝的類似性は、ヒト疾患の遺伝的制御に対する巨大な洞察を提供するために、マウスゲノムのトランスジェニック操作を可能にした1.マウスの取り扱いと実験に関する豊富な経験は、その結果、生物医学研究のための選択のモデルとなっています。しかし、マウスモデルに関する倫理的および科学的な懸念に加えて、彼らはまた、非常に高価で時間がかかる可能性があります2,3.腫瘍の発症には数週間から数ヶ月かかる場合があります。典型的な施設の住宅だけでも、腫瘍が発達している間、数百〜数千ドルで実行することができます。卵巣癌は、マウスモデルの成長が容易に数ヶ月かかることがあるため、この欠点の一例である。研究の進行の遅れは、卵巣癌患者の持続的に低い5年生存率にわずか47%(すなわち、30年間でわずか10%の生存率の増加)に影響を与える可能性4。同様に、泌尿器科癌(腎臓、前立腺、膀胱癌)は、米国における全癌症例の19%、癌関連死の11%を占めている4。したがって、婦人科癌と泌尿器科癌を研究するための新しいインビボアプローチは、たとえこのモデルが最初のスクリーニング実験にのみ適用されるとしても、実験室にかなりの時間、労力、そしてお金を節約できる。さらに、結果として得られる研究結果の加速は、これらの癌と診断された177,000人の個人に大きな影響を与える可能性があります。
Chicken CAMモデルは、前述の問題に対処する多くの利点を提供します。血管新生5、6、腫瘍細胞浸潤7、8、転移7、9を研究する一般的なモデルは、神経膠腫10、11、12、頭頸部および頸部扁平上皮癌13、14、白血病15、16、膵臓癌17、膵臓癌17、および膵臓癌17、および癌の多くの形態を研究するために既に使用されている大腸癌18.さらに、CAMモデルは、神経芽細胞腫19、バーキットリンパ腫20、黒色腫21、およびネコ線維肉腫22に対して生成されている。以前の研究では、膀胱癌23および前立腺癌細胞株24の生着も提示されているが、プロトコルの詳細は限られている。卵はマウスよりずっと安いだけでなく、再現性の高い結果25、26を生み出す。それらは速い血管系の発達を示し、腫瘍の生着は数日の速さで起こり、開いた窓を通して縦方向に視覚化することができる。卵子受精と孵化の間の21日の時間枠で、実験は数週間以内に完了することができます。さらに、低コスト、限られた住宅ニーズ、および小型は、マウス研究のために禁止される大規模な実験を容易に可能にする。
そこで、婦人科がんや泌尿器科がんの生着に向けてCAMモデルを最適化することを検討しました。初期の鶏胚27の免疫不全状態のために、マウスおよびヒト細胞の両方を容易に移植することができる。したがって、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌、膀胱癌の生着に成功しました。これらの腫瘍タイプのそれぞれについて、CAMは確立されたマウスおよび/またはヒト腫瘍細胞株を容易に受け入れる。重要なことに、採取された新しい原発性ヒト腫瘍組織は、消化された細胞または高い成功率を有する固形組織の断片から生着することもできる。これらのがんの種類と細胞源のそれぞれは、最適化が必要です。
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Protocol
本書に示された実験はすべて、カリフォルニア大学ロサンゼルス校(UCLA)の適切な倫理委員会によって審査され、承認されました。識別されていない原発性ヒト腫瘍の使用は、UCLA機関審査委員会(プロトコル番号17-000037、17-001169、および11-001363)によって承認されています。UCLAでは、鶏の胚を使用した実験には動物研究委員会の審査は必要ありません。プロトコルの承認は、卵が孵化する場合にのみ必要です。しかし、動物の安楽死のためのAVMAガイドラインなどのベストプラクティスは、鶏の胚を倫理的に処理し、可能な限り痛みを避けるために使用されました。研究者は、CAMモデルを使用して研究を行う前に、機関で監視要件を確認するよう促されます。
1. 卵の準備
- 卵を受け取る前に、卵インキュベーターを組み立てて37.8°C(100°F)に平衡させ、メーカーの指示に従って湿度60〜70%を調整してください。
注:汚染のリスクを最小限に抑えるために、オートクレーブされた水を使用して湿度を制御することができます。 - 認定された実験室グレードの卵サプライヤーから受精したロードアイランドレッドチキンの卵を受け取ると、タオルで殻の表面を乾かして拭きます。軽く湿らせたペーパータオルを使用して、付着した材料を除去することができます。すぐに乾燥します。
注:43.3 °C未満の液体で殻を濡らすと、卵に細菌を導入することができます。卵を洗浄または消毒することを選択した場合、液体の温度は43.3〜48.9 °Cの間でなければなりません。より高い温度は卵を沸騰させることができます。消毒剤の選択は、懸念を引き起こす微生物に基づいて行われるべきである。 - 鉛筆やマーカーを使って卵の日付にラベルを付けます。これは開発日 0 と見なされます。
- 卵インキュベーターに卵を入れ、CAM開発を可能にするために回転して少なくとも7日間インキュベートします。自動回転器を使用するか、または卵が1日あたり180°2-3x回転することができる。
2. 卵を開く
注:CAMが完全に開発されたときに卵の開口部を行う必要があります。これは通常、開発 7 日目または 8 日目です。
- 70%エタノールでバイオセーフティキャビネットを消毒します。同様に消毒し、バイオセーフティキャビネットに卵ラック、卵のローソーバー、マーカー、シリコンカーバイド砥石と円形切断ホイールを備えたコードレスロータリーツール、18 G針、4分の1インチ真空チューブ付きピペットコントローラ、パッキングテープ、オフィスはさみ、湾曲したはさみ、Semken(または類似)の鉗子、綿のボール、および6 x 7 cmの透明なフィルムドレッシング。可能な限り、滅菌、使い捨てまたはオートクレーブツールを使用してください。
- 卵の回転子の電源を切ります。約1~3個の卵を卵ラックのバイオセーフティキャビネットに入れます。暗闇の中で、卵のろうそくを卵殻に当て、空気細胞を識別します。空気セルの位置をマークします。
注:卵のキャンドルからの照明の強度は、卵の内部を視覚化するために重要です。空気細胞や血管系が一貫して見えにくい場合は、卵のろうそくの電池を交換してみてください。 - 卵のキャンドラーを殻の上に移動して、大きな血管ネットワークを見つけます。必要に応じて卵を回転させます。理想的な血管系は、卵の真ん中付近に分岐します。マーカーを使用して、移植に使用する血管系を描画します。
- ボンネットのライトを点灯します。シリコンカーバイド砥石を取り付けたコードレス回転工具を使用して、空気セルの中心にシェルに小さな穴を開けます。シェルの大部分が取り除かれるまでドリルしますが、白い内膜はそのままです。
注:血管系をターゲットにする前に空気セルを掘削することで、CAMや脈管構造ではなく、空気セル上の特定の卵殻の厚さを決定できます。CAMまたは血管系が破壊された場合、卵は移植に使用できません。 - ドリルと空気細胞のために行われたように、血管窓が開く別の小さな穴を開きます (ステップ 2.4).
- 18G針を使用して、空気細胞と脈管構造の上に白い内膜をそっと突き刺します。シェルを貫通できない場合は、もう少し慎重にドリルします。白い内部膜(CAMではない)が掘削された領域全体全体にわたって破壊されていることを確認します。膜片の除去は必要ではない。
注: この手順で CAM または血管系が乱れた場合は、卵を捨てます。穴の開いた穴から血液やアルブミンが漏れている場合、損傷は明らかです。 - フードライトを消します。卵のろうそくを使用して、空気細胞が卵の端から血管系上の領域に移されたことを確認します。必要に応じて、元の空気セルの穴の周りにピペットコントローラに挿入された真空チューブを配置し、短いバーストで吸引を静かに適用して空気セルを移動させます。
- マーカーを使用して、空気-CAM境界内の約0.5cmのエアセルの新しい位置を輪郭を描きます。新しいエアセルの上に梱包テープを貼り付けます。必要に応じて、標準オフィスハサミを使用してテープを適切なサイズにトリミングします。
メモ:テープはシェルを通る気流を破壊する可能性があり、エアセルを完全に覆うために必要以上に大きくすべきではありません。 - 卵をインキュベーターに戻し、新しい空気セルを上に向けて回転せずに温めます。残りの卵を開くには、手順 2.2 ~ 2.9 を繰り返します。
注: ここでプロトコルを一時停止できます。CAM開発の質が不明な場合は、残りの卵を開く前に、少数の卵がステップ2.16を進める必要があります。 - 約1~3個の卵を移した空気細胞をバイオセーフティキャビネットの卵ラックに置きます。
注意:開いた卵に汚染を入れないように注意してください。したがって、常にバイオセーフティキャビネット内の卵を開き、可能な限り滅菌ツールや機器を使用しています。 - 円形のカッティングホイールを取り付けたコードレス回転ツールを使用して、ステップ2.8で描かれた空気セル境界の上に小さな線をカットします。CAM または血管系を破壊しないように、実際の空気カム境界内で約 0.5 cm であることを確認します。シェルを完全にカットしますが、CAMや血管系を破壊するのに十分な深く浸透しないように注意してください。
- 湾曲したはさみを使用して、残りの空気セルの周りをカットして、シェルに窓を作成します。
注:除去されたシェルに血液または膜が存在する場合、卵は移植に適していません。卵の高い割合がきれいに開いていない場合は、より良いCAM形成を可能にするために、残りの卵を開くために少なくとも1日以上待つこと検討してください。残りの卵の殻が突き刺さっていない場合は、インキュベーター内の卵の回転を再開する必要があります。 - 胚の生存率を確認します。生存可能な胚は、広範な血管系、透明なアルブミン、胚の動き、または目に見える心拍を表示する。
- セムケンの鉗子を使用して、無菌の綿球から綿の小片を引っ張ります。CAM サーフェスを静かにブロットして、シェルのほこりやデブリを取り除きます。
注:卵を開いた日に、デブリの除去を行う必要があります。 - シェル開口部を6 x 7 cm透明フィルムドレッシングの4分の1の部分で覆います。
- 卵をインキュベーターに戻します。開いた窓を上に向けて、透明なフィルムドレッシングに触れないように卵がしっかりと座っていることを確認してください。卵ラック、卵の回転子の端、または転がり続ける卵を支えるのに適した別のアイテムを使用してください。
- 残りのすべての卵を開くには、手順 2.10 から 2.16 を繰り返します。
注:卵の開口部は、移植と同じ日に完了する必要はありません。少なくとも1日待つことは、シェルを開くことによって生存率が損なわれた卵を排除するのに役立ちます。
3. 移植のためのがん細胞懸濁液の準備(オプション1)
注:これは、理想的には7日から10日目の間に行われるべき移植の直前に完了する予定です。移植日に関する詳細については、ステップ5または6の冒頭の注記を参照してください。このアプローチは、すべての細胞株および培養腎臓癌腫瘍消化に使用された。
- 氷上の細胞外マトリックス溶液を解凍します。
- 機械的および/または酵素的消化を用いて、移植される細胞型に適した方法を用いて単一細胞懸濁液を得る。
- 移植用の適切な培地に移植される細胞の総数を再懸濁する。卵1個あたり1~2x106細胞のインプラントが代表的です。
注:細胞株の移植に使用される培地は、通常、FBSまたは血清置換を含む細胞を培養するために使用される完全な培地である。腫瘍の消化の移植は、典型的には、同じ癌型の細胞株を培養するために使用される完全な培地を使用する。しかしながら、培地製剤への調整は、実験的に必要に応じて行われてもよい。腫瘍の発達と成長への影響は、経験的に決定する必要があります。 - 使用する細胞に適した遠心分離機の速度と時間を用いて細胞をペレットにする。一般的な速度は250-300×gで、時間は5〜10分です。
- ピペッティングによってペレット化された細胞から上清を除去する。フリックまたはピペッティングを介して、残留培地中の細胞を機械的に再懸濁する。氷の上に置き、冷やします。適切なサイズのピペットを使用して、セルと媒体の体積を測定します。
- 1-2 x 106細胞が卵1個あたり20〜100μLの体積に移植され、最終的な細胞外マトリックス濃度が2.7〜4mg/mLタンパク質になるように移植量を計算します。培地、任意の必要な成長因子または添加剤、およびこの計算に従って細胞外マトリックス溶液を追加します。インプラント準備ができるまで氷の上に置いてください。
注: ステップ 3.3 および 3.6 の計算では、グループ内のすべての卵に対して十分な量を確保するために、少なくとも半分の卵インプラントの余分な容積を組み込む必要があります。卵巣癌細胞株(すなわち、SKOV3およびID8)の移植のために、卵1個につき106個の細胞を移植した。腎細胞癌細胞株RENCAの移植のために、消化されたヒト腎細胞癌、前立腺癌細胞株(すなわち、CWR、C4−2、およびMyC-CaP)、および膀胱癌細胞株(すなわち、HT-1376およびT24)に由来する培養細胞を、2x106細胞移植した。
4. 移植のための腫瘍片の準備(オプション2)
注:これは、理想的には7日から10日目の間に行われるべき移植の直前に完了する予定です。移植日に関する詳細については、ステップ5または6の冒頭の注記を参照してください。原発性卵巣癌および膀胱癌は腫瘍片として移植された。
- 氷上の細胞外マトリックス溶液を解凍します。任意の所望の成長因子または添加剤を含む適切な培地で2.7〜4 mg/mLの最終タンパク質濃度に希釈します。氷の上に置いておきなさい。
注:腫瘍片の注入は、通常、同じ癌タイプの細胞株を培養するために使用される完全な培地を使用する。しかしながら、培地製剤への調整は、実験的に必要に応じて行われてもよい。腫瘍の生着と成長への影響は、経験的に決定する必要があります。 - メスやハサミを使用して、新鮮な腫瘍から切除片。理想的なサイズは、両側に2〜5ミリメートルの範囲です。移植準備ができるまで、組織を培地に浸しておいてください。
5. ノンスティックリングを使用した移植(オプション1)
注:CAMが完全に開発されている場合、細胞は開発7日目から移植することができます。移植は、腫瘍の発生と所望の実験のための十分な時間を可能にする孵化の前にいつでも起こり得るが、胚の免疫細胞が10日目の受精後27の周りに存在し始めることに注意してください。腫瘍の増殖速度は細胞の種類によってかなり異なり、目的の細胞タイプについて経験的に決定される必要があります。卵巣癌および前立腺癌細胞を非スティックリング法を用いて移植した。ノンスティックリングが利用できない場合、ピペットチップを同様のサイズにカットして使用する場合があります。
- 70%エタノールを使用してバイオセーフティキャビネットと必要なすべてのツールを消毒します:卵ラック、湾曲した虹彩鉗子、ノンスティックリング(1/4インチ内径)、ガラスの攪拌棒、適切なボリュームピペットとチップ、6 x 7 cm透明フィルムドレッシング、オフィスハサミ、およびマーカーまたは鉛筆。可能な限り、滅菌、使い捨て、またはオートクレーブツールを使用する必要があります。
- バイオセーフティキャビネットの卵ラックに埋め込む卵を置きます。管理可能な卵の数を選択します。最大6が典型的です。卵を一緒に作業しながら、卵が実質的に冷却することを避けてください。
- 透明なフィルムドレッシングをシェルから取り外すには、開いた窓に向かってエッジを転がして、シェルの破片を引き離さないようにします。卵が生存可能で健康であることを確認してください。理想的な卵はそれから枝分かれ小さい容器が開いた区域の中心に大きい容器を有する。
- 湾曲したアイリス鉗子を使用して、理想的には分岐点の上に、血管の上にCAM上に無菌、ノンスティックリングを置きます。滅菌ガラスの攪拌ロッドを使用して、CAMを穏やかにアブレイドします。
- ステップ3.6からノンスティックリングの中心に細胞懸濁液をピペットする。あるいは、ステップ4.2からノンスティックリングの中心に腫瘍片を配置し、ステップ4.1で生成された細胞外マトリックス溶液の20〜50μLで覆うために鉗子を使用する。
- 開口を6×7cm透明フィルムドレッシングの4分の1の部分で密封します。適切なインプラント指定で卵にラベルを付けます。
注:グループ内の卵の番号付けは、縦方向の観察を容易にします。 - 卵をインキュベーターに戻します。シェルの開口部が直立し、卵が安全であることを確認します。
注:卵は回転せずに卵インキュベーターに戻すことができます。あるいは、CO2を非活性化させた37-38°Cの細胞インキュベーターと湿度を監視する湿度を用いて高い移植後生存率を得ることができ、これは50%〜80%であるべきである。
6. ノンスティックリングなしの移植(オプション2)
注:CAMが完全に開発されている場合、細胞は開発7日目から移植することができます。移植は、腫瘍の発生と所望の実験のための十分な時間を可能にする孵化の前にいつでも起こり得るが、胚の免疫細胞が10日目の受精後27の周りに存在し始めることに注意してください。この方法は、腎細胞癌細胞および膀胱癌細胞を移植するために使用した。
- 70%エタノールを使用してバイオセーフティキャビネットと必要なすべてのツールを消毒します:適切な容積のピペットとチップ、無菌10cmのティッシュ培養皿、卵ラック、6 x 7 cm透明フィルムドレッシング、オフィスハサミ、およびマーカー。
- ステップ3.6で生成した細胞懸濁液の接種量を適切なサイズのピペットチップ(200μLが典型的)に吸引する。先端の上部を保持しながら、慎重にピペットの先端を排出し、無菌、10cmの組織培養皿に水平に配置します。
- グループ内のすべてのサンプルについて、ステップ 6.2 を繰り返し、各グループに 1 つの皿を含めます。
- 37°Cのインキュベーターにチップを15~30分間入れ、細胞外マトリックスを部分的に重合させます。
- 15分のインキュベーション後、重合の確認を開始します。少量の液体は、通常、皿の上に置くと先端から漏れます。この液体の重合は、先端内の液体の重合の程度を推定するために使用することができる。
- バイオセーフティキャビネットの卵ラックに埋め込む卵を置きます。管理可能な卵の数を選択します。最大6が典型的です。卵を一緒に作業しながら、卵が実質的に冷却することを避けてください。
- 開いた窓に向かってエッジを転がして、透明フィルムドレッシングをシェルから取り外します。これにより、シェルの破片を引き離すのを避けます。
- 卵が生存可能で健康であることを確認してください。理想的な卵はそれから枝分かれ小さい容器が開いた区域の中心に大きい容器を有する。
- 適切なサイズのピペットにピペットチップを1つ置きます。プランジャーを押し下げ、部分的に重合された細胞懸濁液を、理想的には分岐点上の大きな、よく発達した容器の上にCAMに押し込む。
- 開口を6×7cm透明フィルムドレッシングの4分の1の部分で密封します。
- 適切なインプラント指定で卵にラベルを付けます。
注:グループ内の卵の番号付けは、縦方向の観察を容易にします。 - 卵をインキュベーターに戻します。シェルの開口部が直立し、卵が安全であることを確認します。
注:卵は回転なしで専用の卵インキュベーターに戻すことができます。あるいは、CO2を非活性化させた37-38°Cの細胞インキュベーターと湿度を監視する湿度を用いて高い移植後生存率を得ることができ、これは50%〜80%であるべきである。
ホタルルシメラーゼの生物発光イメージングは腫瘍を示す
注:移植された細胞がホタルルシフェラーゼまたは他のイメージング因子をコードする遺伝子で安定に導入された場合、得られた腫瘍は、生物発光イメージングを使用して視覚化され得る。卵殻からの背景が高いため、無傷の卵には蛍光イメージングは推奨されません。シェルの開口部が生存率を大幅に低下させるので、これは終点解析です。腫瘍は、実験のニーズおよび腫瘍の成長の速度に適した任意の時点で画像化され得る。しかし、平均して、卵は21日後に孵化する。したがって、開発日18は、不要なハッチングを回避するための適切なエンドポイントである。
- 必要に応じて、卵をイメージング施設に運ぶ。10cmのティッシュ培養料理にテープ卵。回転機構を取り外したり、非アクティブ化して、卵インキュベーターを37.8°C(100°F)に戻します。湿度は、輸送やイメージングのために重要ではありません。
- 湾曲したアイリス鉗子を使用して、CAMがアルブミンと胚と一緒に洗い流されるまで、CAMをシェルからそっと押し出します。広い先端の標本の鉗子を使用して、腫瘍の視覚化のために十分に貝の開口を拡大するために貝の部分を壊す。
- 卵アルブミンに最低50μLの30mg/mL D-ルシフェリンを注入します。同様のD-ルシフェリンの体積は、移植された細胞を含む領域の非スティックリングまたはCAMの表面にピペトされてもよい。これは理想的な管の供給の不在の最適生物発光を保障する。8分間インキュベートします。
- 卵を麻酔するために卵のアルブミンにイソファフルランの20-50 μLを注入します。さらに2分間インキュベートする代わりに、卵を2〜2.5%気化イソファフルランを含む誘導室に入れてもよい。胚の動きが止まるときに適切な麻酔深度が得られる。
注:イソファフルラン(100μL)の大きなボリュームは、卵を安楽死させるために使用することができます。 - 卵を生物発光イメージングデバイスに入れ、メーカーの指示に従って適切な設定を使用して画像を撮ります。本研究では、1分間の露光時間を用いた。
- 残りのCAMおよび胚を画像化するために、卵を10cmの組織培養皿に開けた。
- 卵の真ん中近くの卵の下側に両手の指で卵をつかみ、殻の開口部の両側の親指を持ちます。
- 親指で卵の2つの半分をそっと引き離し、指で卵にそっと押し込みます。
- シェルがCAMと胚から約半分分離されたら、10cmの組織培養皿の上に卵をひっくり返す。
- シェルの半分を分離し続けます。シェルの内側に CAM が付いている場合は、指を使用してシェルから CAM を押し出します。
- 胚は、必要に応じて別の皿に反転され得る。
- 必要に応じて、追加のイソファフルランは、ステップ7.4のように投与され得る。
8. 腫瘍の収穫
注:腫瘍は、実験のニーズと腫瘍の成長の速度に適したいつでも収穫することができます。しかし、平均して、卵は21日後に孵化する。したがって、開発日18は、不要なハッチングを回避するための適切なエンドポイントである。
- 鉗子で腫瘍をつかむ。ハサミ(春の虹彩はさみはよく働く)またはメスを使用して、慎重にCAMから腫瘍を切除します。
- もし腫瘍がホタルルシファーゼ遺伝子で導入された場合、再イメージングを行って、可視化が困難な腫瘍の除去が成功したことを検証してもよい。
注:切除された腫瘍は、特定の実験に適した任意の方法によって分析され得る。腫瘍はまた、CAMまたはマウスに再移植され得る。腫瘍同一性を確認するために、腫瘍を固定し、パラフィンを埋め込み、ヘマトキシリンおよびエオシンまたは免疫組織化学的染色で検査することができる。
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Representative Results
これまでのところ、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌癌および膀胱癌に対してこの移植方法が成功することを発見した。各々は、柔軟性があるかもしれないが、移植のための特定の条件を識別するために最適化された。検査された腫瘍タイプのうち、卵巣癌の増殖は、生物発光イメージングの助けを借りずに顕著で、典型的には見えない(図1)。しかし、CAMの硬化は、移植領域の鉗子で感じることができました。これは、生物発光イメージングの不在時に可能な腫瘍増殖を同定するのに役立つ可能性があるが、組織学または別の適切な方法を介してさらなる検証が必要であろう。ヒトとマウスの両方の細胞株の生着に成功し、他のin vivoモデルに見られる形態と一致する形態を示す(図1Aおよび1B)。また、腫瘍片の移植が可能であった(図1C、青矢印は腫瘍を示す)。この場合の移植された腫瘍は、高等級、転移性、卵巣漿液性癌の患者から来た。結果として生じる腫瘍は、形態的に起源の腫瘍に似ており、CAMおよび鶏胚組織からの分化を容易に可能にするサイトケラチン8/18のようなヒト特異的タンパク質を発現させた。
腫瘍の生着および成長を最適化する場合、適切な成長因子またはホルモンを移植時に添加してもよい。例えば、移植時に3単位のヒト卵胞刺激ホルモン(FSH)を補った場合に、ID8細胞において、微妙で有意でない腫瘍サイズの増加(全放射束フラックスで測定)が認められた(図1D)。卵巣癌の増殖のためのFSHの選択は、ID8細胞におけるFSH受容体の発現と、卵巣癌症例の大半を構成する閉経後の女性に典型的に見られるFSHの高レベルから生じた。同様のアプローチは、CAMモデルの有用性を高めるために、他の成長しにくい癌タイプにも採用され得る。さらに、FSHは、細胞移植時にのみ添加された。成長因子またはホルモンを補充することは、適切な間隔で媒体中の添加剤を適切な間隔でノンスティックリングにピペット化することによって達成することができ、これは効果を高めることができる。
腎臓癌の場合、RENCAなどの確立された細胞株から2 x106の透明細胞腎細胞癌細胞の移植は、迅速で堅牢な腫瘍形成を生み出したが、より低い細胞用量も使用することができる(図2A、10日後の移植)。得られた腫瘍は形態学的に、生体内モデル28において標準的なマウスを通して得られたものに類似した。ホタルルシフェラーゼを用いてマーキングされたRENCA細胞の移植は、生物発光イメージングを可能にした。原発性ヒト腫瘍も移植され得る。腫瘍の断片は、有意な成長を示すことなく持続し、血管系を募集した。一次的に発する一次細胞から由来する消化細胞の移植は、インビトロで拡張された一次細胞腎細胞癌であり、しかし、確立された細胞株と同様に成長した(図2B)。腎細胞癌細胞は、非スティックリング法または非スティック環を伴わない方法のいずれかを用いて播種することができる。
複数のヒトおよびマウス前立腺癌細胞株がCAM生着について試験された(図3)。2 x 106細胞をノンスティックリングを用いて移植すると、それぞれよく成長した。得られた腫瘍の組織学的評価は、各細胞株に対する期待と一致した。さらに、ホタルルシフェラーゼで安定に印付けされた細胞の移植は、生物発光イメージングによる腫瘍同定を可能にした(図3A)。
膀胱癌は、確立された細胞株および一次ヒト組織の断片からCAMモデルに樹立された(図4)。細胞株は、非スティック環(図4Aおよび4B)を持たない2 x106細胞で移植すると良好に成長したが、リングとの移植は成功した。原発性ヒト腫瘍は、組織の断片から移植され得る(図4C)。提示された症例は、高等級、非筋肉浸潤性、尿皮癌の患者に由来する。消化細胞の移植は、腫瘍消化の最適化の進行中のため、まだ試みられていない。得られたCAM腫瘍の癌細胞は、元の腫瘍の形態を保持したが、変化した間質成分を有する。腫瘍の増殖は腎細胞癌および前立腺癌に比べて少なかったが、依然として容易に見える。
エンドポイントで多数の生存可能なアッセイ可能な卵を確保するために、卵をインキュベートして開くときは注意が必要です。インキュベーター条件が移植前または移植後に最適でない場合、胚の生存可能性が損なわれる可能性があります。重大な胚死が発生した場合は、メーカーの指示に従ってインキュベーター状態をトラブルシューティングします。私たちの経験では、温度と湿度の安定性は、その正確な値よりも重要であるように見えます。そこで、接種卵を改変した細胞培養器でインキュベートすることで、湿度を制御する水を補給するためにより頻繁に開く必要がある小さな専用卵インキュベーターに卵を保持するよりも優れた生存率を達成したことがわかりました。腫瘍検査のために接種卵を除去する頻度を最小限に抑えることは、胚の生存率を高める可能性もある。
CAMの注入の付加的な心配は接種のCAMの完全性である。シェルを開いた後にCAMがそのままでない場合、非スティックリングと移植細胞は胚のアルブミンに沈みます(ステップ2.12の後の注を参照)。これは、癌細胞分散を引き起こす。一部の腫瘍は依然として形成される可能性があるが、卵巣癌などの隣接する癌細胞から有意な成長および生存シグナルを受ける癌は、そのような条件下で確実に腫瘍を形成しない。非スティックリングを移植に使用する場合、CAMの障害は、アルブミンへのリングの沈下によって識別することができる。これは、リングおよび移植された細胞が胚の動きによって卵の底に移動した場合と区別されなければならない。このような場合、リングは CAM とシェルの下側の間にあります。胚の動きを制御することはできません。しかし、リングの配置は、胚が移植された細胞を破壊することをより困難にすることができます。ステップ2.7で発生したエアポケットの端に配置されたリングは、フィールドの中心に配置されたものよりも胚によって移動される可能性が高い。
図1:卵巣癌からの代表的な腫瘍発生。正常に移植された卵巣癌細胞は、以下を含む:(A)ヒトSKOV3細胞株、(B)マウスID8細胞株、および(C)原発性腫瘍を含む。代表的なヘマトキシリンおよびエオジン染色は、適宜、生物発光イメージングと共に提示される。原発性腫瘍(C)ヘマトキシリンおよび原発腫瘍のエオシン染色の移植から生じるCAM腫瘍には、結果として生じるCAM腫瘍のサイトケラチン8/18(CK 8/18)染色とともに含まれる。最初のパネルの青い矢印は腫瘍を示す。(D) 3U FSHを用いたID8インプラントの腫瘍サイズは、生物発光イメージングに起因する全フラックス(未治療の場合はn=3、FSH補充の場合はn=4)として算出される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:透明細胞腎細胞癌からの代表的な腫瘍発生。(A) マウス腎細胞癌細胞株の移植から生じる腫瘍は、RENCA、又は(B)消化ヒト原発腫瘍に由来する培養細胞である。(B) で切除した腫瘍に隣接する測定スケールは、1 mmのマーキングを示す。(A)および(B)に対応するヒストロジーは、ヘマトキシリンおよびエオジン染色を示す。(A)では、ホタルルシフェラーゼマーク付きRENCA細胞の代表的な生物発光イメージングも示されている。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:前立腺癌細胞株からの代表的な腫瘍発生。ヒト前立腺癌細胞株の移植に起因するヘマトキシリンおよびエオシン染色をマウス細胞株(C)MyC-CaPと共に(A)CWRおよび(B)C4-2に移植した代表的な腫瘍。CWR細胞に印を付けたホタルルシメラーゼから得られた腫瘍の生物発光画像化は、(A)に示されている。切除された腫瘍に隣接する測定スケールは1mmのマーキングを示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:膀胱癌からの代表的な腫瘍発生樹立したヒト膀胱癌細胞株(A)HT-1376、(B)T24、および(C)原発性膀胱腫瘍の移植から生じる代表的な腫瘍。C)において、得られたCAM腫瘍および原発性腫瘍のヘマトキシリンおよびエオシン染色が示される。切除された腫瘍に隣接する測定スケールは1mmのマーキングを示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
CAMモデルを用いた腫瘍の拡大および生着は既存のin vivo動物モデルよりより速く、直接観察可能な腫瘍の成長を可能にする。さらに、特に免疫不全マウスのコストと比較して、機器の最初の購入が完了すると、コストは大幅に低くなります。鶏の胚の初期の免疫不全状態は、ヒトおよびマウス組織の生着を容易に可能にする。これらの強みがあっても、CAM モデルには制限があります。長期的な治療研究が保証されている場合、利益になり得る短い時間も損害になる可能性があります。CAMモデルの免疫不全/免疫寛容な状態は、腫瘍免疫相互作用の研究を複雑にする可能性があります。これらの研究のために、目的の免疫細胞の共着が必要であり、おそらく免疫コンパートメントの補充が必要である。さらに、我々はCAMモデルに生着を提示したすべての腫瘍タイプが、彼らは成長の様々な程度でそうします。例えば、腎細胞癌は急速に大きな腫瘍を形成するが、卵巣癌腫瘍は生物発光画像化の助けを借りずに可視化することは困難である。腫瘍の成長と速度は、CAMが適切な実験モデルであるかどうかを判断するために、特定の腫瘍タイプについて評価する必要があります。
成功した腫瘍の生着は、プロトコルの特定のステップの慎重な完了を必要とします.まず、卵は、生着前に最適な胚生存およびCAM形成を有する理想的な条件下でインキュベートされる必要がある。バッチ内の自然変動のため、特定の卵の供給業者から余分な卵を得ることをお勧めします。我々はまた、より涼しい、雨の多い天候が卵の真菌の成長につながることを発見しました。雨天時には、エンドポイントで十分な収量を得るために、より多くの卵を生着させる必要があるかもしれません。この季節変動は地域固有である可能性が高い。適切なCAM形成は、腫瘍の生着を成功させるために不可欠です。開くときにシェルに接続された CAM の表示は無視されません。いくつかの卵が最初のバッチを開くときに無傷のCAMを持っていない場合は、少なくとも1日以上残りの卵の開口部を遅らせることをお勧めします。
生存率が低いか、生着が得られない場合、いくつかのステップに欠陥がある可能性があります。第1に、供給者からの胚の生存率は不良である可能性がある。空気細胞および目に見える血管系の欠如は、生存不可能な卵を示す。時には、胚の動きを可視化して生存率を確認できる。しかし、視覚化には強い光が必要であるため、新鮮な電池が卵のろうそくに入っていることを確認してください。フロートテストは、実行可能性を評価するために行うこともできます(さまざまな指示やビデオがオンラインで入手可能です)。生存率の低さについてのもう一つの可能な説明は、インキュベーターである。独立した湿度計と温度計を使用して、設定が正確で安定していることを確認します。インキュベーターの製造元の指示には、適切な設定を評価するための詳細なトラブルシューティング手順が記載されている必要があります。不適切なインキュベーター設定は、CAM開発を損なう可能性もあります。テープやマーカーを使用して、卵の回転子が実際に卵を回転しているかどうかを確認します。非スティックリングが生着卵の高い割合でアルブミンに沈む場合、CAMは十分に発達しなかった。最後に、生着卵の頻繁なチェックは、温度と湿度の変動につながる、移植後の生存率を低下させる可能性があることを発見しました。移植された卵が最初に生存可能であるが、生着期間を通して生存率が低下する場合、卵は検査の頻度を減らすべきである。この生存率の低下は、移植後の不正確または不適切なインキュベーター設定に起因する可能性もあります。
新しいセル型に対してこの方法を最適化する場合、いくつかの因子を制御できます。最初のセル番号です。我々は、通常、細胞株から5 x 105-2 x 106細胞を移植する。埋め込まれた腫瘍片は、通常、両側に2〜5mmである。これらの量は、生着またはサイズを向上させるために調整され得る。しかし、腫瘍の増殖が細胞型依存である一定の閾値を超えて減少することを発見した。付加的な生着パラメータは非スティックリングの有無を含む。この選択は通常、リングがエンドポイント分析を妨げるかどうかに基づいて行われますが、成功した生着にも影響を与える可能性があります。非スティック環の存在はまた、望ましい場合には、血管の採用の前に生存を改善するために所望の間隔で媒体で新生移植片を覆うことを許可することができる。細胞外マトリックスタイプ、濃度、およびマトリックスが希釈される培地の選択は、生着にも影響を与える可能性があります。成長因子またはホルモンの添加は、腫瘍の服用率またはサイズをさらに改善し得る。添加物と濃度の選択は、特定の細胞タイプに適しており、実験を妨げないものに基づいて行う必要があります。また、ノンスティックリングを使用する場合、これらは間隔で補充される可能性もあります。
このモデルシステムの将来の応用は、テストされる仮説に依存する。例えば、これらの腫瘍移植片は、腫瘍サイズを小さくするか、または腫瘍の亜集団を枯渇させる新しい治療アプローチを試験するために使用することができる。宿主の腫瘍微小環境からの細胞との共移植は、腫瘍の成長および治療抵抗性を含む様々なパラメータにこれらの細胞の影響の研究を可能にする可能性がある。このモデルはまた、免疫不全動物モデルに異種移植片を確立する前に、原発性ヒト腫瘍を徐々に拡大する機会として役立つ可能性がある。CAMの生着への最初の適応は、おそらくマウスモデルにおける腫瘍の取り込み率を促進する可能性があります。これらのアプリケーションはまだテストされていませんが、さらなる調査が必要です。
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Disclosures
著者たちは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、この方法に関する最初の訓練に対して、玉野井冬彦博士とビン・ヴー博士に感謝したいと考えています。エヴァ・コジオレク博士との議論は、このアプローチの最適化に役立ち、非常に高く評価されています。この研究は、以下の情報源からの資金提供なしには不可能でした:タバコ関連疾患研究プログラム博士研究員(27FT-0023、 ACS、国防総省(DoD)卵巣癌研究プログラム(W81XWH-17-1-0160)、NCI/NIH(1R21CA216770)、タバコ関連疾患研究プログラムハイインパクトパイロット賞(27IR-0016)、UCLA機関支援、 JCCCシードグラント(NCI /NIH P30CA016042)とLW研究担当副首相室からの3R助成金を含む。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings | The O-Ring Store | TEF010 | Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE). |
| C4-2 | ATCC | CRL-3314 | Human prostate cancer cell line. |
| CWR22Rv1 | CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California) | ||
| Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51) | Novus Biologicals | NBP2-44929-0.02mg | Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors. |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length | Roboz Surgical | RS6703 | This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well. |
| Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | This kit contains all necessary tools. |
| Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red - Brown, Lab Grade) | AA Lab Eggs Inc. | N/A | A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally. |
| HT-1376 | ATCC | CRL-1472 | Human bladder cancer cell line. |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D-NONE-1102-1588-1357 | Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used. |
| ID8 | Not commercially available, please see PMID: 10753190. | ||
| Incu-Bright Cool Light Egg Candler | Incubator Warehouse | 1102 | Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit. |
| Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips | World Precision Instrument | 15915 | This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method. |
| Isoflurane | Clipper Distributing | 0010250 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free | Corning | 354248 | Extracellular matrix solution |
| MyC-CaP | ATCC | CRL-3255 | Murine prostate cancer cell line. |
| Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | Any similar pipet controller would be appropriate. |
| PrecisionGlide Hypodermic Needles | BD | 305196 | This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly. |
| RENCA | ATCC | CRL-2947 | |
| Semken Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate. |
| SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Human ovarian cancer cell line. |
| Specimen forceps | Electron Microscopy Sciences | 72914 | This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips. |
| Sterile Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice. |
| Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length | United Scientific Supplies | GRPL06 | This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well. |
| T24 | ATCC | HTB-4 | Human bladder cancer cell line. |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 21272 | |
| Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter | Corning | 353803 | This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary. |
| Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well. |
References
- Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
- Jackson, S. J., Thomas, G. J. Human tissue models in cancer research: looking beyond the mouse. Disease Models & Mechanisms. 10 (8), 939-942 (2017).
- Cheon, D. J., Orsulic, S. Mouse Models of Cancer. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 6 (1), 95-119 (2011).
- Howlader, N., et al. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2016. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. https://seer.cancer.gov/csr/1975_2016/ (2018).
- Ribatti, D. Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model. Methods Molecular Biology. 843, 47-57 (2012).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Lokman, N. A., Elder, A. S., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Science. 13 (8), 9959-9970 (2012).
- Xiao, X., et al. Chick Chorioallantoic Membrane Assay: A 3D Animal Model for Study of Human Nasopharyngeal Carcinoma. PLoS ONE. 10 (6), e0130935 (2015).
- Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1119-1130 (2008).
- Shoin, K., et al. Chick Embryo Assay as Chemosensitivity Test for Malignant Glioma. Japanese Journal of Cancer Research. 82 (10), 1165-1170 (1991).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Kavaliauskaitė, D., et al. The Effect of Sodium Valproate on the Glioblastoma U87 Cell Line Tumor Development on the Chicken Embryo Chorioallantoic Membrane and on EZH2 and p53 Expression. BioMed Research International. 2017, 12 (2017).
- Liu, M., et al. The Histone Methyltransferase EZH2 Mediates Tumor Progression on the Chick Chorioallantoic Membrane Assay, a Novel Model of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Translational Oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
- Rudy, S. F., et al. In vivo Wnt pathway inhibition of human squamous cell carcinoma growth and metastasis in the chick chorioallantoic model. Journal of Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 45 (1), 26 (2016).
- Canale, S., et al. Interleukin-27 inhibits pediatric B-acute lymphoblastic leukemia cell spreading in a preclinical model. Leukemia. 25, 1815 (2011).
- Loos, C., et al. Amino-functionalized nanoparticles as inhibitors of mTOR and inducers of cell cycle arrest in leukemia cells. Biomaterials. 35 (6), 1944-1953 (2014).
- Rovithi, M., et al. Development of bioluminescent chick chorioallantoic membrane (CAM) models for primary pancreatic cancer cells: a platform for drug testing. Scientific Reports. 7, 44686 (2017).
- Majerník, M., et al. Novel Insights into the Effect of Hyperforin and Photodynamic Therapy with Hypericin on Chosen Angiogenic Factors in Colorectal Micro-Tumors Created on Chorioallantoic Membrane. International Journal of Molecular Science. 20 (12), 3004 (2019).
- Swadi, R., et al. Optimising the chick chorioallantoic membrane xenograft model of neuroblastoma for drug delivery. BMC Cancer. 18 (1), 28 (2018).
- Klingenberg, M., Becker, J., Eberth, S., Kube, D., Wilting, J. The chick chorioallantoic membrane as an in vivo xenograft model for Burkitt lymphoma. BMC Cancer. 14 (1), 339 (2014).
- Avram, S., et al. Standardization of A375 human melanoma models on chicken embryo chorioallantoic membrane and Balb/c nude mice. Oncology Reports. 38 (1), 89-99 (2017).
- Zabielska-Koczywas, K., et al. 3D chick embryo chorioallantoic membrane model as an in vivo model to study morphological and histopathological features of feline fibrosarcomas. BMC Veterinary Research. 13 (1), 201 (2017).
- Skowron, M. A., et al. Applying the chicken embryo chorioallantoic membrane assay to study treatment approaches in urothelial carcinoma. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 35 (9), e511-e523 (2017).
- Jefferies, B., et al. Non-invasive imaging of engineered human tumors in the living chicken embryo. Scientific Reports. 7 (1), 4991 (2017).
- Taizi, M., Deutsch, V. R., Leitner, A., Ohana, A., Goldstein, R. S. A novel and rapid in vivo system for testing therapeutics on human leukemias. Experimental Hematology. 34 (12), 1698-1708 (2006).
- Strojnik, T., Kavalar, R., Barone, T. A., Plunkett, R. J. Experimental model and immunohistochemical comparison of U87 human glioblastoma cell xenografts on the chicken chorioallantoic membrane and in rat brains. Anticancer Research. 30 (12), 4851-4860 (2010).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
- Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
