이 프로토콜에서, 뮤린 아일렛 분리 및 인추니얼 피하 백색 지방 조직내로이식하는 방법이 기재되어 있다. 분리된 합성 뮤린 섬은 지하 막 하이드로겔을 사용하여 뮤린 수용자로 이식된다. 수령인의 혈당 수준을 모니터링하고, 아일렛 이식의 학력 분석이 수행됩니다.
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방법 논문
뮤린 아일렛의 인과 피하 백색 지방 조직 (ISWAT) 이식 모형
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
췌도 이식은 타입-1 당뇨병을 위한 잘 확립된 치료 처리입니다. 신장 캡슐은 설치류 모형에 있는 아일레 이식을 위해 일반적으로 이용되는 사이트입니다. 그러나, 단단한 신장 캡슐은 큰 동물 및 인간에 있는 충분한 작은 작은 것의 이식을 제한합니다. 새로운 피하 공간인 인큐니얼 피하 백색 지방 조직(ISWAT)은 저도 이식에 잠재적으로 귀중한 부위인 것으로 나타났습니다. 이 사이트는 다른 피하 공간보다 더 나은 혈액 공급이 있습니다. 더욱이, ISWAT는 신장 캡슐보다 더 큰 작은 덩어리를 수용하고, 그것으로 이식하는 것은 간단하다. 이 원고는 합성 당뇨병 마우스 수용자의 ISWAT 부위에서 마우스 췌도 격리 및 이식의 절차를 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 뮤린 췌도는 표준 콜라게나아제 소화에 의해 분리되었고 지하 막 매트릭스 하이드로겔은 ISWAT 부위에서 정제된 섬을 고정하는데 사용되었다. 수용자 마우스의 혈당 수준을 100일 이상 모니터링하였다. 아일렛 이식편은 조직학적 분석을 위해 이식 후 100일째에 회수되었다. 이 원고에 설명된 ISWAT 사이트에서 의정서는 간단하고 효과적이다.
서론
국제 당뇨병 연맹 (IDF)1의통계 데이터에 따르면 타입-1 당뇨병 (T1DM)의 세계적인 부각 그리고 보급은 급속하게 상승하고 있습니다. 아일렛 이식은 T1DM4를 치료하기위한 가장 유망한 접근 법 중 하나입니다. 에드먼튼 프로토콜2를 이용한 임상 섬 이식에서 큰 돌파구가 보고된 이후, 5년 후 T1DM 수혜자에서 기능하는 섬 이식 생존은 이제 약 50%3에도달한다.
과거에는 간, 신장 캡슐, 비장, 근육 내 부위, 피하 공간, 골수 및 오멘탈 파우치와 같은 여러 이식 부위가 실험적인 췌도이식을위해 탐구되었다5,6,7. 위의 사이트 중 일부는 임상 설정에서 테스트 되었습니다8. 췌도 이식은 현재9에서임상 적용에서 가장 널리 사용되는 방법으로 남아 있지만,이 사이트를 사용할 때 해결해야 할 몇 가지 중요한 문제가 있습니다. ....
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프로토콜
이 프로토콜의 모든 절차는 심천 제 2 인민 병원의 윤리 검토위원회의 동물 복지 원칙을 따랐다. 아일렛 이식 수혜자 및 기증자는 광동성 의과 동물 센터에서 구입한 8-10주 된 C57BL/6 남성 마우스이었습니다. 수확된 세포의 수확, 분리, 배양, 또는 투여의 절차는 무균 조건에서 수행되었다.
1. 아일렛 준비
- 콜라게나아제 V 형 작동 용액을 준비하십시오. 콜라게나아제 V형을 계량하고 D-Hank의 버퍼로 1 mg/mL의 최종 농도로 용해하고, 0.22 μm 주사기 구동 필터 유닛과 60 mL 주사기를 사용하여 필터를 사용하여 얼음에서 미리 냉각합니다. 각 기증자 받는 사람에 대 한 5 mL의 볼륨이 필요 합니다.
- 자궁 경부 탈구에 의해 10 주 된 C57BL / 6 남성 마우스 (23 ± 2g)를 안락사시키고 마우스의 외부 부분을 75 % 에탄올로 몇 초 동안 살포하십시오. 한편, 콜라게나제 용액으로 5 mL 주사기를 채우고 굴곡 무딘 뾰족한 관류 바늘 (32G)으로 주사기 바늘을 변경하십시오.
- 해부 범위 아래 얼음 가방에 척추 위치에 기증자 마우스를 넣어, 음모 영역의 피부에 직선 뾰족한 안과 가위를 사용하여 횡개구를 잘라, 완전히 머리를 향해 피부를 절개. 그런 다음 음모 부위에서 ....
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결과
이 프로토콜에는 두 가지 절차가 도입됩니다: 뮤린 아일렛 제제 및 ISWAT 부위에 의한 아일렛 이식. 첫 번째 절차에서, 타입 V 콜라게나아제 용액으로 정독 및 소화한 후, 히스타크-1119 및 히스타크-1077및 추가의 손 따기 단계로 정화한 후, 분리된 뮤린 섬은 이식에 충분히 순수할 것이다(도 1에도시된 바와 같이) 및 높은 생존율을 가지는 고립된 섬이 이식에 사용될 것이다(도 2에도시된 바와 같이). 두 번째 절차에서는 STZ 화학 물질을 가진 당뇨병 유도가 중요합니다. STZ의 최적 복용량은 마우스 긴장및 나이에 달려 있고, 당뇨병의 성공적인 유도는 2 일 연속에 동시에 16.7 mmol/L 이상의 비 빠른 혈액 포도당 수준에 의해 정의됩니다. 당뇨병 마우스는 몇 주 동안 췌도 이식없이 살아남을 수 있습니다. ISWAT 부위로 이식되기 전에 아일렛 이식편을 하이드로겔과 완전히 혼합해야 하며, IWSAT에 이식이 .......
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토론
췌장 췌도 이식은 T1DM을 치료하는 유망한 치료법입니다. 이 치료의 효과는 많은 요인에 의해 영향을 받고 아일렛 이식을위한 최적의 부위를 선택하는 것은 매우 중요합니다. 아일렛 이식에 대한 이상적인 해부학 적 부위는 다음과 같은 특성을 가져야합니다 : 간단한 이식, 생검 및 이식 편이식 검색 절차에 대한 접근성; 감소 합병증; 혈액 포도 당 제어의 높은 성공률; 및 섬 이식편15,16의장기 생존.
우리 팀은 이전에 뮤린 모델17에서오멘텀에서 의식을 이식하기 위한 프로토콜을 기술했다. omentum에서, 일반적인 혈액 포도당은 신장 캡슐의 밑에 섬 이식에 비교된 나중에 달성되었습니다. 그 결과, 섬을 이식하기위한 다른 사이트를 탐구했다.
ISWAT는 간에서 이식에 비해 수령인의 고혈당.......
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공개 사항
저자는 이해 상충을보고하지 않습니다.
감사의 글
이 사업은 중국 의전사업(2017YFC1103704)의 국고병원 건립을 위한 특별기금(2019), 심천의학산명프로젝트(SZSM201412020), 고급기금의 보조금으로 지원되었다. 심천의 의료 분야 건설 (2016031638), 심천 과학 기술 재단 (JCJY2022229204849975, GJHZ2017031417135556), 심천 재단 건강 및 가족 계획위원회 (SZXJ20102111S222222 중국 광동성 과학 연구 재단 (A2019218), 중국 박사 후 과학 재단 (2018M633218).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.22 &무; m 주사기 구동 필터 유닛 | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| 1.5 mL 원심 분리기 튜브 | Axygen | MCT-150-C | |
| 5 mL 파스퇴르 피펫 | JingAn Biological, 중국 | J00085 | |
| 5 mL 주사기 | Szboon, 중국 | 20170829 | |
| 50 mL 원추형 튜브 | Corning | 430829 | |
| 5-0 외과 봉합사 | sh-Jinhuan, 중국 | CR537 | |
| 60 mL 주사기 | Szboon, 중국 | 20170623 | |
| 75% 에탄올 | LIRCON, 중국 | 9180527 | |
| Alexa Fluor 488 당나귀 안티 마우스 IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | 희석 (1:200) |
| 안티 마우스 글루카곤 항체 | Abcam | ab10988 | 희석 (1:100) |
| 안티 마우스 인슐린 항체 | 세포 Signaling Technology | 3014s | Dilution (1:100) |
| 뭉툭한 관류 바늘 | Oloey, China | 005 | 32G, 노란색 |
| BSA | Meilune, 중국 | MB4219 | |
| C57BL/6 광 | 동성 | 8~10주 | |
| 세포 배양 접시 | BIOFIL, 중국 | TCD000100 | 일반, 비처리, 직경 87.8mm |
| 원심분리기 | Thermo Scientific | ST16R | |
| 세팔로스포린 | 루캉 의료, 중국 | 150303 | |
| CMRL-1066 | 시그마-알드리치 | C0422 | |
| 코도스 애완 동물 클리퍼 | 슈코도스, 중국 | CP-8000 | |
| 콜라겐분해효소 V형 | 시그마 | C9262 | |
| DAPI | 써모 피셔 | D1306 | |
| D-hank's buffer | Coolaber, 중국 | PM5140-10 | |
| 디티존 | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| 에오신 염색 매체 | Beyotime Biotech, 중국 | C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| fluorescein diacetate (FDA) | Thermo Fisher | F1303 | |
| 형광 현미경 | Leica | DMIL | |
| 젤 로딩 피펫 팁 | Corning | CLS4884 | |
| HBSS | Coolaber, China | PM5150-10 | |
| 헤마톡실린 염색 매체 | 세포 신호 기술 | 14166S | |
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | 시그마-알드리치 | RNBG0536 | |
| 하이드로겔 | BD Biosciences | 356234 | 지하 멤브레인 매트릭스 |
| 요오도퍼 | LIRCON, 중국 | 5190313 | |
| 광밀폐 배양 접시 | DVS, 중국 | AN-5058548 | 자체 제작, 검은 페인트 |
| 스프레이 유리 접시 의료 접착 테이프 | Cofoe, 중국 | K12001 | |
| 비침습적 마이크로핀셋 | RWD Life Science | F11033-11 및 F12016-15 | |
| 원터치 초경량 기본 혈당 모니터링 시스템 | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| 안과 가위 | RWD 생명 과학 | S12012-12 및 S11001-08 | |
| P / S (페니실린 / 스트렙토 마이신) | Gibco | 15140-122 | |
| 펜토 바르비탈 나트륨 | 시그마 - 알드리치 | P-010 | |
| 요오드 프로 피듐 | 시그마 - 알드리치 | P4864 | |
| STZ (스트렙토 조토신) | 시그마 알드리치 | S0130 | |
| 테스트 스트립 | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC 활용 염소 안티 토끼 IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | 희석(1:200) |
| 혈관 클램프 | RWD 생명 과학 | R31006-04 |
참고문헌
- Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Shapiro, A. M., et al.
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재인쇄 및 허가
