Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Samtidig isolering av primære astrocytter og microglia for protozoparasittinfeksjon

Published: March 18, 2020 doi: 10.3791/60680
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2
1Centro de Terapia Celular e Molecular (CTCMol), Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Terapia Celular e Molecular (CTCMol), Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
* These authors contributed equally

Summary

Det overordnede målet med denne protokollen er å instruere hvordan man trekker ut, opprettholder og dissosierer murineastrocyte og microglia celler fra sentralnervesystemet, etterfulgt av infeksjon med protozoa parasitter.

Abstract

Astrocytter og mikroglia er de mest tallrike glialcene. De er ansvarlige for fysiologisk støtte og homeostase vedlikehold i sentralnervesystemet (CNS). De økende bevisene for deres engasjement i kontroll av smittsomme sykdommer rettferdiggjør den nye interessen for forbedring av metoder for å isolere primære astrocytter og mikroglia for å evaluere deres respons på infeksjoner som påvirker CNS. Tatt i betraktning virkningen av Trypanosoma cruzi (T. cruzi) og Toxoplasma gondii (T. gondii) infeksjon i CNS, her gir vi en metode for å trekke ut, opprettholde, dissosiere og infisere murine astrocytes og microglia celler med protozoa parasitter. Ekstraherte celler fra nyfødte kortices opprettholdes in vitro i 14 dager med periodisk differensial media erstatning. Astrocytter og mikroglia er hentet fra samme ekstraksjonsprotokoll ved mekanisk dissosiasjon. Etter fenotyping ved flyt cytometri, er celler smittet med protozoer parasitter. Infeksjonsraten bestemmes av fluorescensmikroskopi på forskjellige tidspunkter, slik at evalueringen av differensialevne av glialceller for å kontrollere protozosk invasjon og replikering. Disse teknikkene representerer enkle, billige og effektive metoder for å studere svarene fra astrocytter og mikroglia til infeksjoner, og åpner feltet for videre nevroimmunologianalyse.

Introduction

CNS består hovedsakelig av nevroner og glialceller1,,2,3. Microglia og astrocytter er de mest tallrike gliacellene i CNS. Microglia, bosatt makrofag, er immunokompetent og fagocytisk glia celle i CNS3,4, mens astrocytter er ansvarlig for å opprettholde homeostase og utøve støttende funksjoner5.

Til tross for glial celler blir klassisk kjent for å være ansvarlig for støtte og beskyttelse av nevroner6,7, nye funksjoner av disse cellene har blitt beskrevet i den siste litteraturen, inkludert deres svar på infeksjoner8,9,10,11. Dermed er det et press for å utvikle metoder for å isolere disse glialcene for å forstå sine funksjoner individuelt.

Det er noen alternative modeller for å studere glialceller i stedet for primære kulturer, som udødeliggjorte cellelinjer og in vivo-modeller. Imidlertid er udødelige celler mer sannsynlig å gjennomgå genetiskdrivende og morfologiske endringer, mens in vivo studier pålegge begrensede manipulasjonforhold. Omvendt er primære kulturer enkle å håndtere, ligner bedre på vivo-celler og tillater oss også å kontrollere eksperimentelle faktorer12,13. Her beskriver vi retningslinjer for hvordan du trekker ut, vedlikeholder og dissosierer murineastrocytter og mikroglia primære celler i samme protokoll. Videre gir vi også eksempler på hvordan man arbeider med protozoinfeksjon i disse kulturene.

CNS-celler hentet fra nyfødte mus (opptil 3 dager gamle) ble dyrket i 14 dager på differensialmedier som gjør det mulig å fortrinnsrett vekst av astrocytter og mikrogliaceller. Siden microglia hviler over de vedlagte astrocytter, ble cellepopulasjoner mekanisk dissosiert i en orbital inkubator. Deretter samlet vi alle supernatantsominneholder microglia og lagt trypsin å løsne astrocytter. Isolerte glialceller ble fenotypisk evaluert av flow cytometri og belagt i henhold til ønsket eksperiment.

Vi ga også eksempler på hvordan man infiserer disse isolerte mikroglia og astrocytter med protozoaparasitter. T. gondii er en svært nevrotropisk protozoansvarlig ansvarlig for toksoplasmose14, mens T. cruzjeg er ansvarlig for Chagas sykdom som kan føre til utvikling av nevrologiske lidelser i CNS15,16. Videre har det også blitt rapportert at infeksjon med T. gondii17,18 eller T. cruzi19,20,21 var den antatte dødsårsaken hos immunkompromitterte pasienter. Derfor er oppklaringen av immunologiske rolle glialceller fra CNS i å kontrollere protozoer infeksjoner av stor betydning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer som involverer mus ble utført i samsvar med brasiliansk nasjonal rett (11.794/2008) og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) ved Federal University of São Paulo (UNIFESP).

1. Glial celler ekstraksjon, vedlikehold og dissosiasjon

MERK: Antall mus som brukes til glialcelleutvinning, avhenger av mengden celler som kreves for å utføre de ønskede eksperimentene. I denne protokollen ble totalt 2,7 x 107 astrocytter og 4 x 106 mikroglia hentet fra seks nyfødte C57BL/6 mus. Alle prosedyrer ble utført under steril tilstand i et klasse II biosikkerhetsskap.

  1. Dag 1
    1. Forbered ren Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS) og HBSS + 10 % av varmeinaktivert fosterstorfeserum (FBS) (se materialtabellen).
    2. Forbered supplert Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 (10% FBS + 0,08 mM Penicillin + 0,09 mM Streptomycin + 12,5 mM HEPES + 30 mM natriumbikarbonat, pH 7.2) og filtrer det med et 0,22 μm filter (se materialtabellen).
      MERK: Alle kulturmedier skal oppbevares ved 4 °C, men det er nødvendig å forvarme dem ved 37 °C i 20 minutter før du starter forsøket.
    3. Steriliser alle kirurgiske instrumenter (saks, slikkepott og pinsett) i en autoklav og bruk 70% etanol under prosedyren.
    4. Sett nyfødte (opptil 3 dager gamle) mus i et forseglet kammer som inneholder bomull gjennomvåt med isofluran i 5 min for dyp anestesi.
    5. Spray musevalpen med 70% etanol og halshugge dyret med saks.
    6. Lag sagittal kutt (bakre til anterior) med saks langs kraniet for å åpne den og utsette hjernen. Skill skallen fra hjernen ved hjelp av pinsett. Fjern hjernen ved hjelp av en mikroslikkepott for å opprettholde hjernens integritet.
    7. Plasser hjernen i en tørr petriskål (6 cm diameter). Fjern olfaktorisk pære og lillehjernen ved hjelp av en mikrospatel. Flytt cortex til en annen petriskål (6 cm diameter) som inneholder HBSS + 10% FBS (2 ml/petriskål).
    8. Skjær hjernevevet i små biter med steril saks og bruk en p1000 mikropipette overføre hvert hjernevev med HBSS + 10% FBS til forskjellige 15 ml koniske rør. Kontroller at det endelige volumet er 2 ml/rør. Hvis ikke, komplett med HBSS + 10% FBS.
      MERK: Protokollen kan settes på pause her. I så fall må koniske rør med CNS-vev plasseres på is opptil 1 t.
    9. Vask det kuttede hjernevevet med 3 ml HBSS + 10 % FBS (per rør) og etter dekantering. Fjern forsiktig supernatanten. Gjenta dette trinnet 3 ganger.
      MERK: Dette trinnet tar sikte på å fjerne rusk og å gjenopprette ekstraherdet vev.
    10. Vask det kuttede hjernevevet med 3 ml ren HBSS (per rør) og fjern forsiktig supernatanten. Gjenta dette trinnet 3 ganger.
      MERK: Dette trinnet tar sikte på å fjerne det gjenværende serumet fra de forrige vaskene, da celler vil bli trypsinisert i neste trinn.
    11. Tilsett 3 ml trypsin per rør og legg i et vannbad ved 37 °C i 30 min, rist forsiktig rørene hver 5.
      MERK: Dette trinnet tar sikte på å fordøye det oppsamlede vevet.
    12. For å inaktivere trypsin, vask vevet med 3 ml per rør av HBSS + 10% FBS og, etter dekantering av vevet, fjern nøye supernatanten. Gjenta dette trinnet 3 ganger.
    13. Vask vevet med 3 ml per rør av ren HBSS og fjern forsiktig supernatanten. Gjenta dette trinnet 2 ganger.
    14. Tilsett 7 ml per rør av ren HBSS og homogeniser vevet gjennom påfølgende passasjer i pipetter: først med 10 ml serologisk pipette, etterfulgt av 5 ml og til slutt med p1000 mikropipette.
    15. Etter homogenisering, sentrifugerør ved 450 x g i 5 min ved 4 °C.
    16. Kast supernatanten og resuspend pelleten med 4 ml HBSS + 10 % FBS per rør.
    17. Overfør celler til en forbehandlet T-75 kolbe for optimal cellekulturvedhesjon (se Materialtabellen).
      MERK: Behandle vev fra hvert dyr per kolbe.
    18. Plasser kolben i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2 i 30 min for etterlevelse.
    19. Tilsett 10 ml supplert DMEM/F12 per kolbe og inkuber ved 37 °C og 5 % CO2.
      MERK: Det endelige volumet er 14 ml per kolbe.
  2. Dag 3
    1. Fjern 7 ml kulturmedium fra T-75 kolbe og tilsett 7 ml fersk supplert DMEM/F12.
      MERK: Kolbene vil inneholde mye cellulært rusk og et overskyet utseende.
  3. Dag 5
    1. Fjern alt mediet fra T-75 kolbe og tilsett 14 ml fersk supplert DMEM/F12.
      MERK: Medium erstattes fra kolbene for å fjerne rusk og ikke-tilhengerceller.
    2. Etter hver 48 timer, fjern 6 ml av supernatanten og tilsett 7 ml fersksupplert DMEM/F12 medium til dag 14 av kulturen.
  4. Dag 14
    1. Etter å ha fjernet 6 ml av supernatantog legge til 7 ml fersk supplert DMEM / F12 medium, lukk T-75 flasker tett.
    2. Plasser dem i gulvet orbital shaker på 200 rpm og 37 ° C over natten for å mekanisk dissosiere microglia fra astrocytter.
  5. Dag 15
    1. Ta kolbene fra shaker og kraftig vaske dem med sitt eget medium for å optimalisere celledissosiasjon og høste maksimalt antall microglia. Deretter samler du supernatanten (som inneholder microglia) og overfører til et 50 ml konisk rør.
    2. Deretter legger du til 4 ml trypsin i hver kolbe og inkuberer i 5 min ved 37 °C for å løsne astrocytter.
    3. Legg til 5 ml per kolbe av supplert DMEM/F12 for å deaktivere trypsin. Vask kolbene med sitt eget medium og overfør innholdet til et 50 ml konisk rør.
    4. Sentrifuge alle rør som inneholder dissosierte mikroglia og astrocytter ved 450 x g i 5 min ved 4 °C.
    5. Kast supernatanten. Resuspender microglia pellet i 1 ml og astrocytter i 10 ml supplert DMEM/F12.
    6. Fortsett til celletelling i et Neubauer kammer eller en automatisk celleteller. Plate cellene med supplert DMEM/F12 ved ønsket tetthet i en passende flat bunncellekulturplate (forhåndsbehandlet for optimal cellevedlegg; se Materialtabellen). Inkuber celler ved 37 °C og 5 % CO2 i 24 timer slik at de kan festes.
      MERK: Reserver 1,5 x 106 av hver cellepopulasjon for å bekrefte renheten ved å flyte cytometri.
    7. Utfør en flow cytometrisk analyse for å verifisere renheten av cellepopulasjoner.
      MERK: Vi anser microglia CD11b+/CD45+/GFAP- og astrocytter CD11b-/ CD45-/ GFAP+. Iba1 og TMEM119 farging kan vurderes for å karakterisere microglia22.
    8. Legg til en FMO (Fluorescence Minus One)23 og en ufarget prøve for hver cellepopulasjon (astrocytter og microglia) som kontroller av flow cytometrianalyse.
    9. For hver cellepopulasjon reserverer du 5 x 105 celler for hver beiset og ubeiset prøve. For FMO, reserver to andre rør av microglia som inneholder 2,5 x 105 celler hver og reserverer også et annet rør på 5 x 105 astrocytter.
      MERK: Siden microglia-tall kan være en begrensende faktor, er det mulig å bruke færre celler for ufargede og FMO-kontroller.
    10. Sentrifuge alle mikrorør ved 450 x g i 5 min ved 4 °C. Kast supernatanten og resuspendpelleten med 500 μL/mikrorør med FACS-buffer (fosfatbufret saltvann (PBS) + 0,5 % storfeserumalbumin (BSA) + 2 mM EDTA, pH 7.2).
    11. Sentrifuge alle mikrorør ved 450 x g ved 4 °C i 5 min. Kast supernatanten og resuspend pelleten med 100 μL/mikrorør av anti-CD16/CD32 (klone 93) (1:50) fortynnet i FACS-bufferen. Inkuber i 10 min ved romtemperatur.
    12. Tilsett 500 μL/mikrorør med FACS-buffer i alle mikrorør og sentrifuge ved 450 x g ved 4 °C i 5 min. Kast supernatanten. Resuspender astrocytter og mikroglia fargingsrør og også astrocytt FMO rør med 50 μL / microtube av overflatemarkører blanding: anti-CD45 (PE, klone 30-F11) og anti-CD11b (eFluor 450, klone M1/70) (begge fortynnet på 1: 100 i FACS buffer).
    13. For ufargede celler, resuspender med samme volum av FACS-bufferen. For microglia FMO, inkuber hvert microglia rør med anti-CD45 eller anti-CD11b. Inkuber alle prøver ved 4 ° C i 20 min i mørket.
    14. Tilsett 500 μL FACS-buffer per mikrorør. Sentrifuge ved 450 x g ved 4 °C i 5 min. Kast supernatanten og resuspend pelleten med 100 μL/mikrorør av fikseringsbuffer (se materialbord)i 20 minutter ved romtemperatur i mørket.
    15. Tilsett 500 μL/mikrorør permeabilization buffer 1x (se Materialtabellen) og inkuber ved 4 °C i 5 min i mørket.
    16. Sentrifuge alle mikrorør ene ved 450 x g ved 4 °C i 5 min. Kast supernatanten. Resuspender astrocytter og mikroglia fargingrør og også microglia FMO rør med 50 μL / mikrorør av intracellulær antistoff anti-GFAP (APC, klone GA5) i en 1:100 fortynning i 1x permeabilization buffer. For ufargede celler og astrocytt FMO, resuspender cellene med samme volum av FACS-bufferen. Inkuber alle prøver ved 4 °C i 30 min i mørket.
    17. Vask alle rørved å legge til 500 μL/mikrorør med 1x permeabiliseringsbuffer. Sentrifuge alle mikrorør på 450 x g,i 5 min ved 4 °C. Sett hvert mikrorør på nytt i 200 μL FACS-bufferen. Erverve 1 x 105 hendelser /prøve på flytcytometeret.
    18. For analyse, celler må være gated først på CD11b x CD45 og deretter GFAP histogram.
      MERK: Ufargede og FMO-kontroller er nyttige for å bestemme porter.

2. Infeksjon og evaluering av infeksjonsrater

  1. Infeksjon av glialceller med T. gondii
    1. Plate 3 x 104 mikroglia eller astrocytter med supplert DMEM/F12 ved 37 °C og 5 % CO2 i 24 timer i en forbehandlet 96-brønnflat plate (se materialtabellen).
    2. Infisere hver cellepopulasjon med takyzoitter fra T. gondii RH stamme uttrykker gul fluorescerende protein (YFP) med en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 1:1 (parasitt:celle) fortynnet i 200 μL / brønn av supplert RPMI (3% FBS + 0,16 mM Penicillin + 0,18 mM Streptomycin + 12,5 mM HEPES + 30 mnatriumbikarbonat, pH 7.2) (se materialtabellen). Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i 48 timer.
    3. Kast deretter supernatanten og fest cellene ved å tilsette 100 μL/brønn på 1 % paraformaldehyd (PFA) fortynnet i PBS ved 4 °C i 24 timer.
    4. Erstatt PFA med 100 μL/brønn av PBS ved pH 7.2.
    5. Fjern forsiktig supernatantog flekkcellenes kjerner ved å pipe tupting 50 μL/brønn av DAPI (5 mg/ml) fortynnet i PBS pH 7,2 (1:1000) i 1 min ved romtemperatur i mørket.
    6. Erstatt DAPI-fargeoppløsningen med 100 μL/brønn av PBS (pH 7.2) og analyser den ved fluorescensmikroskopi.
  2. Infeksjon av glialceller med T. cruzi
    1. Plate 3 x 104 mikroglia eller astrocytter med supplert DMEM/F12 ved 37 °C og 5 % CO2 i 24 timer i en forbehandlet 96-brønnflat plate (se materialtabellen).
      MERK: For hvert infeksjonspunkt, bruk en annen plate.
    2. Inmitter glialcene med trypomastigotes fra T. cruzi Y-stamme ved en MOI på 5:1 (parasitter:celle) fortynnet i 200 μL /brønn av supplert RPMI og inkubasjon ved 37 °C og 5 % CO2 i 2 timer.
      MERK: Dette trinnet er viktig for celleinvasjonen av parasitten.
    3. Fjern alle supernatantog vask brønnene ved å legge til 200 μL / brønn av supplert RPMI for å fjerne alle de ekstracellulære parasittene. Fjern supernatant og tilsett 200 μL / brønn av fersk supplert RPMI.
      MERK: Dette trinnet har til hensikt å fjerne alle parasitter som ikke invaderte de tilhengerceller.
    4. Inkuber infiserte celler for 2 h, 48 h og 96 h for å evaluere T. cruzi replikering i glialceller11.
    5. Etter hvert tidspunkt fjerner du supernatanten og fikser cellene med 100 μL/brønn metanol i 15 min ved romtemperatur og skift deretter ut metanol med 100 μL/brønn av PBS (pH 7.2).
    6. Etter fiksering, forberede cellene for immunofluorescensanalysen som følger.
      1. For å unngå autofluorescens, behandle cellene med 100 μL/brønn på 50 mM NH4Cl fortynnet i PBS (pH 8.0) i 15 min. Vask cellene ved å legge til 100 μL/brønn av PBS og fjern det umiddelbart (gjenta dette trinn 3 ganger).
      2. Deretter permeabilize cellene ved å legge til 100 μL / brønn på 0,5% Triton fortynnet i PBS i 15 min. Vask celler ved å legge til 100 μL / brønn av PBS og umiddelbart fjerne det (gjenta dette trinn 3 ganger).
      3. Deretter inkuberer cellekulturen med 100 μL / brønn av blokkeringsløsning (5% fettfri melk + 2% BSA fortynnet i PBS [pH 7,2]) for 1 h ved romtemperatur. Vask cellene ved å legge til 100 μL/brønn av PBS og fjern det umiddelbart (gjenta dette trinn 3 ganger).
      4. For å beise amastigotes, inkuber med 30 μL / brønn av ikke-kommersiellmonoklonalt antistoff (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 protein (1:200) fortynnet i blokkerende løsning for 1 h ved romtemperatur.
      5. Vask cellene ved å legge til 100 μL/brønn av PBS og fjern det umiddelbart (gjenta dette trinn 3 ganger). Inkuber platen med 30 μL/brønn av sekundært anti-mus antistoff (1:500) fortynnet i PBS i 1 time ved romtemperatur.
        MERK: Det ikke-kommersielle mAb 2C2 anti-Ssp-4-proteinet var en snill gave fra prof. Dr. Renato A. Mortara fra Institutt for mikrobiologi, immunologi og parasitologi ved Federal University of São Paulo.
      6. Fjern forsiktig supernatanten og flekkkjernene ved å tilsette 50 μL/brønn av DAPI (5 mg/ml) fortynnet i PBS pH 7,2 (1:1000) i 1 min ved romtemperatur i mørket.
      7. Erstatt DAPI-fargeoppløsningen med 100 μL/brønn av PBS pH 7.2 og analyser den ved fluorescensmikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

På 14th dag gjennomgikk glialceller kultur ( Figur1A) mekanisk dissosiasjon. Isolerte cellepopulasjoner ble analysert av flow cytometri i henhold til CD11b, CD45 og GFAP markører. Vi kunne observere en renhet på 89,5% for astrocyttpopulasjonen og 96,6% for mikrogliapopulasjonen (figur 1B). Etter isolasjon ble cellene belagt i en 96-brønn flat plate, og etter 24 timer var de klare til å bli smittet av T. cruzi eller T. gondii i henhold til de respektive infeksjonsprotokollene. Her ga vi en tidsforløpsinfeksjon av T. cruzi som et eksempel på infeksjonsfrekvensevaluering i disse glialcene.

Astrocytter og mikroglia (3 x 104 celler/brønn) ble smittet med T. cruzi ved MOI = 5:1 (parasitter:celle) i 2–96 timer (Figur 2). Infeksjonsraten ble evaluert ved immunfluorescens ved å telle antall celler og antall parasitter farget med en DNA-intercalator (DAPI). Kort sagt, vi kunne observere at T. cruzi er i stand til å invadere microglia og astrocytter til lignende priser. Videre replikerer T. cruzi i begge celletyper, og når den høyeste infeksjonsraten ved 96 h postinfeksjon (p.i.). Interessant, ved 96 h p.i. infeksjonshastigheten er mer uttalt i astrocytter enn i microglia, noe som tyder på at mikrogliaceller er i stand til å kontrollere parasittreplikasjonen mer effektivt enn astrocytter, som vi tidligere beskrev11.

Det er viktig å merke seg at bruk av genmodifiserte parasitter som uttrykker fluorescerende reportere eller parasitter merket med spesifikke fluorescerende antistoffer, kan forbedre immunofluorescensmikroskopien, siden de er bedre skilles fra cellekjerne (Figur 3). Videre kan infeksjonsraten av fluorescerende parasitter bestemmes av andre teknikker som flow cytometri. Her ga vi eksempler på T. gondii RH stamme konstitutivt uttrykkyfp (Figur 3A) og T. cruzi Y stamme farget med ikke-kommersiell mAb 2C2 anti-Ssp-4 protein (Figur 3B).

Til sammen beskriver denne protokollen hvordan man trekker ut, vedlikeholder, dissosierer og infiserer murine microglia og astrocytter primære celler, som kan være et kraftig verktøy for å studere for eksempel immunresponser fra glialceller til protozoinfeksjon som kort belysning her.

Figure 1
Figur 1: Primære astrocytter og mikrogliaceller. (A) Bilder av C57BL/6 murine glialceller på 14th dag av kultur ble oppnådd av invertert mikroskop (400x). Den røde pilen indikerer laget av astrocytter og den svarte pilen indikerer microglia. (B) Etter mekanisk dissosiasjon ble astrocytter og mikroglia farget (5 x 105 celler) med fluorescerende anti-CD11b, anti-CD45 og anti-GFAP og evaluert ved flow cytometri (1 x 105 celler oppkjøp). Astrocytter regnes som CD11b-/ CD45- og GFAP+ celler, mens microglia er CD11b+/ CD45+ og GFAP- celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Tidsforløpet av T. cruzi infeksjon i glialceller. Astrocytter og mikroglia fra C57BL/6 mus ble smittet med T. cruzi Y (MOI = 5:1). Etter 2 timer, 48 h og 96 timer, kamre ble festet med metanol og farget med celle kjerne markør DAPI (blå) og anti-GFAP (rød). Bilder ble innhentet av invertert fluorescensmikroskop (400x). Antall amastigoter inne i cellene og hyppigheten av infiserte celler ble evaluert av fluorescensmikroskopprogramvaren (se Materialtabellen). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Astrocytter og mikrogliainfeksjon med fluorescerende protozoiske parasitter. (A) 3 x 104 astrocytter og microglia fra C57BL/6 mus ble smittet (MOI = 1:1) med T. gondii RH YFP (grønn) i 48 timer, kamre ble løst med 1% PFA og farget med DAPI (blå). (B) 3 x 104 astrocytter og mikroglia fra C57BL/6 mus ble smittet (MOI = 5:1) med T. cruzi Y i 96 timer, og kamre ble festet med ren metanol og farget med DAPI (grønn) og mAb 2C2 anti-Ssp-4 (oransje). Bilder ble kjøpt ved hjelp av et invertert fluorescensmikroskop. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Viktigheten av å studere isolerte glialceller fungerer i forskjellige biologiske sammenhenger har ekspandert de siste to tiårene. Forstå CNS utover nevroner er fortsatt et voksende felt i cellebiologi, spesielt under infeksjoner eller inflammatoriske forhold8,9,24. Glialceller er avgjørende ikke bare for nevroner fysisk støtte (som det tidligere var kjent), men også i mange andre fysiologiske situasjoner som nevron energiforsyning, neurometabolisme, immunovervåking, synaptisk beskjæring, forming og modulering av vevet, blant annet3,25,26,27,28,29.

Siden astrocytter og mikroglia kan moduleres forskjellig under infeksjon eller steril betennelse, er det av stor betydning å forstå den individuelle og relative rollen til disse glialcene. Selv om microglia er kjent for å representere det mononukleære phagocyte-systemet (MPS) i CNS, har astrocytter også blitt beskrevet som en sentral aktør i CNSimmunrespons8. For å sammenligne rollen til hvert glial undergruppe i sammenheng med infeksjon og/ eller betennelse, er det obligatorisk å få dem fra samme ekstraksjon og tilstander. Det er få rapporter om effektorresponser av microglia og astrocytter for å kontrollere infeksjoner, spesielt med hensyn til protozoanparasitter. I denne forstand demonstrerte vi nylig kravet om NLRP3 inflammasome til kontroll av T. cruzi replikering i microglia, men ikke i astrocytter av en mekanisme som involverer nitrogenoksid (NO) sekresjon11.

Denne protokollen beskriver en metode som er fokusert på samtidig utpakking av de to mest tallrike glialcellepopulasjonene, astrocytter og mikroglia, fra postnatale (opptil 3-dagers gamle) mus. Nyfødte mus eldre enn 3-dagers gamle kan brukes, men vi opplevde at utbyttet av begge cellene reduseres litt over tid (data som ikke vises). Vår metode er forskjellig fra tidligere beskrevne protokoller for astrocytter eller mikrogliaisolasjon fordi vi fokuserte på å skaffe og isolere begge celletyper i samme ekstraksjon, under samme forhold, og dermed optimalisere bruken av eksperimentelle dyr og forbedre studien av den relative rollen for disse cellene i immunologiske sammenhenger. Videre optimaliserte vår protokoll også utbyttet av begge celletyper. Utbyttet er vanligvis 3–5 x 106 astrocytter og 3–5 x 105 mikroglia per kolbe. Sammenlign dette med andre protokoller som resulterer i færre celler ved hjelp av flere dyr per T-75 kolbe (noen protokoller bruker 2-3 dyr per kolbe)30,31.

En annen fordel med denne protokollen er tiden det tar å oppnå isolerte astrocytter og microglia. Innen 14 dager er det mulig å få modne microglia. Faktisk er det viktig å markere at, som Flode og Kammer demonstrerte, microglia eldre enn 14 dager presentere redusert evne til å skille ut cytokiner; det er svært viktig å vurdere dette i nevroimmunologiske sammenhenger30. Til tross for at de modne beslutningstakere for astrocytt ikke er helt forstått, GFAP er i stor grad brukt til å karakterisere responsive og aktive astrocytter. Noen protokoller oppnå nivåer av 90% GFAP positive celler bare etter 21 eller 28 dager med kultur. Av den grunn foreslo vi en metode som er gitt, celler som er immunresponserende og for det meste modnes innen 7-14 dager. Selv om renhet kan være lavere enn andre metoder for både astrocytt31 og microglia30, var hovedfokus å oppnå mikroglia og astrocytter i større mengder i en samtidig ekstraksjon. Vi forstår at cellepopulasjoner kan sorteres ytterligere eller isoleres med kolonneseparasjon for å forbedre deres renhet. For dette kan flere cellemarkører inkluderes, for eksempel Iba1 eller TMEM119 for microglia; Aquaporin-4 eller S100B for astrocytter, CC1 eller O4 for oligodendrocytes og NeuN for nevroner22,31,32,33. Et viktig celletap på slutten av protokollen bør imidlertid vurderes.

Dermed ga vi en modifisert metode for samtidig å få mikroglia og astrocytter i en effektiv og billig protokoll. Videre gir denne protokollen fordelene med en stor avkastning som tillater komparative studier av gliale undergrupper i nevroimmunologiske sammenhenger, som illustrert her under T. cruzi og T. gondii infeksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke professor Dr. Renato A. Mortara fra Federal University of São Paulo (UNIFESP) for mAb 2C2 anti-Ssp-4. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, stipend 2017/25942-0 til K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, gi 402100/2016-6 til K.R.B.), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas (INCTV/CNPq) og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Finance Code 001). M.P.A. mottar fellesskap fra CNPq, A.L.O.P. mottar fellesskap fra CAPES, og I.S.F og L.Z.M.F.B. mottar fellesskap fra FAPESP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% Ethanol Dinâmica Química Contemporânea Cat: 2231 Sterilize
75 cm2 Flask Corning Cat: 430720U Plastic material
96 well cell culture plate Greiner Cellstar Cat: 655090 Cell culture
Ammonium Chloride (NH4Cl) Dinâmica Química Contemporânea Cat: C10337.01.AH Remove autofluorescence
Anti-GFAP antibody Abcam Cat.: ab49874 Immunofluorescence antidoby
Bottle Top Filter 0.22 μmm CA Corning Cat: 430513 Culture medium filter
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich Cat: A7906 FACS Buffer preparation
CD11b (FITC) BD Pharmigen Cat.: 553310 Flow cytometry antibody
CD45 (PE) Invitrogen Cat.: 12-0451-83 Flow cytometry antibody
Centrifuge Eppendorf Cat: 5810R Centrifugation
Centrifuge Eppendorf 5415R Centrifugation
Class II biosafety cabinet Pachane Cat: 200 Biosafety cabinet for sterile procedures
CO2 Incubator ThermoScientific Model: 3110 Primary cells maintenance
Conical tubes 15 mL Corning Cat: 430766 Plastic material
Conical tubes 50 mL Corning Cat: 352070 Plastic material
Countess automated cell counter Invitrogen Cat: C10281 Cell counter
DAPI Invitrogen Cat.: D1306 Immunofluorescence antidoby
Digital Microscope Camera Nikon Cat: DS-RI1 Capture images on microscope
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco Cat: 12800-058 Cell culture medium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich Cat: E9884 FACS Buffer preparation
F12 Nutrient Mixture Gibco Cat: 21700-026 Cell culture medium
FACS Canto II BD Biosciences Unavaiable Flow cytometer
Fetal Bovine Serum (FBS) LGC Biotechnology Cat: 10-bio500-1 Cell culture medium supplement
Flow Jo (software) Flow Jo Version: Flow Jo_9.9.4 Data analysis
Fluorescence intenselight Nikon Cat: C-HGFI Fluorescence source
GFAP (APC) Invitrogen Cat.: 50-9892-82 Flow cytometry antibody
Goat - anti-mouse IgG (FITC) Kirkeegood&Perry Lab (KPL) Cat.: 172-1806 Immunofluorescence antidoby
HBSS - Hank's Balanced Salt Solution Gibco Cat: 14175079 Cell culture medium
HEPES Sigma Aldrich Cat: H4034 Cell culture medium supplement
IC Fixation Buffer Invitrogen Cat: 00-8222-49 Cell fixation for Flow Citometry
Inverted microscope Nikon Model: ECLIPSE TS100 Microscope
Isoflurane Cristália Cat: 21.2665 Inhaled anesthetic
Methanol Synth Cat: 01A1085.01.BJ Fixation for Immunofluorescence
Micro spatula ABC stainless Unavaiable Surgical material
Microtube 1.5 mL Axygen Cat: MCT-150-C Plastic material
Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 Non commercial Non commercial Immunofluorescence antidoby
Multichannel Pipette (p200) Corning Cat: 751630124 Pipette reagents
NIS Elements Software Nikon Version 4.0 Acquire and analyse images
Non-fat milk Nestlé Cat: 9442405 Blocking solution for immunofluorescence
Orbital Shaker Incubator ThermoScientific Model: 481 Cat: 11 Dissociate microglia from astrocytes
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich Cat: P6148 Fixation for Immunofluorescence
PBS Non commercial Non commercial Neutral Buffer
Penicillin G Sigma Aldrich Cat: P-7794 Cell culture medium supplement
Permeabilization Buffer (10x) Invitrogen Cat: 00-8333-56 Cell permeabilization for Flow Citometry
Petri dish 60 mm x 15 mm (Disposable, sterile) Prolab Cat: 0303-8 Plastic material
pH meter Kasvi K39-1014B Calibrate pH solution
RPMI 1640 Medium Gibco Cat: 31800-014 Cell culture medium
Scissors ABC stainless Cat: LO9-W4 Surgical material
Serological pipette 10 mL Corning Cat: 4101 Plastic material
Serological pipette 5 mL Corning Cat: 4051 Plastic material
Single Channel Pipette (p1000) Gilson Pipetman Cat: F123602 Pipette reagents
Single Channel Pipette (p200) Gilson Pipetman Cat: F123601 Pipette reagents
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich Cat: S6297 Cell culture medium supplement
Streptomycin sulfate salt Sigma Aldrich Cat: S9137 Cell culture medium supplement
Triton X-100 Sigma Aldrich Cat: T9284 Permeabilization for immunofluorescence
Trypsin Gibco Cat: 27250-018 Digestive enzyme
Tweezers ABC stainless Cat: L28-P4-172 Surgical material
Water Bath Novatecnica Model: 09020095 Digeste tissue at 37 °C with trypsin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
  2. Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
  3. Jäkel, S., Dimou, L. Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).
  4. Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40 (2), 133-139 (2002).
  5. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).
  6. Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. Verlag von August Hirschfeld, Berlin. , (1858).
  7. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  8. Samartino, C. G., et al. Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis. American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).
  9. Jamilloux, Y., et al. Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection. Glia. 61 (4), 539-549 (2013).
  10. Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
  11. Pacheco, A. L., et al. The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication. Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).
  12. Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
  13. Lian, H., Roy, E., Zheng, H. Protocol for Primary Microglial Culture Preparation. Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).
  14. Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation. Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).
  15. Chagas, C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).
  16. Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases. Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).
  17. Jones, J. L., et al. Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group. AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).
  18. Luft, B. J., et al. Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome. New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).
  19. Madalosso, G., et al. Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).
  20. Rocha, A., et al. Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).
  21. Yasukawa, K., et al. Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).
  22. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  23. Roederer, M. Compensation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).
  24. Silva, A. A., et al. Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu. Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).
  25. Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).
  26. Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).
  27. Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity. Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).
  28. Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. The active role of astrocytes in synaptic transmission. Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).
  29. Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191 (2017).
  30. Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
  31. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
  32. Sarkar, S., et al. Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility. Journal of Visualized Experiments. (122), e55364 (2017).
  33. Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (66), e3814 (2012).

Tags

Immunologi og infeksjon Utgave 157 Glia celler astrocytter microglia protozoa infeksjon T. cruzi T. gondii
Samtidig isolering av primære astrocytter og microglia for protozoparasittinfeksjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pacheco, A. d. O. L., Amaral, M. P., … More

Pacheco, A. d. O. L., Amaral, M. P., de Farias, I. S., Bottino, L. Z. M. F., Bortoluci, K. R. Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection. J. Vis. Exp. (157), e60680, doi:10.3791/60680 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter