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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Isolamento concomitante de astrócitos primários e microglia para infecção por parasitas protozoários

Published: March 18, 2020 doi: 10.3791/60680
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2
1Centro de Terapia Celular e Molecular (CTCMol), Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Terapia Celular e Molecular (CTCMol), Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
* These authors contributed equally

Summary

O objetivo geral deste protocolo é instruir como extrair, manter e dissociar as células murina e microglia do sistema nervoso central, seguidas de infecção com parasitas protozoários.

Abstract

Astrócitos e microglia são as células gliais mais abundantes. São responsáveis pelo apoio fisiológico e manutenção da homeostase no sistema nervoso central (SNC). As evidências crescentes de seu envolvimento no controle de doenças infecciosas justificam o interesse emergente no aprimoramento de metodologias para isolar astrócitos primários e microglia, a fim de avaliar suas respostas às infecções que afetam o SNC. Considerando o impacto da infecção por Trypanosoma cruzi (T. cruzi)e Toxoplasma gondii (T. gondii)no CNS, aqui fornecemos um método para extrair, manter, dissociar e infectar astrócitos de murina e células de microglia com parasitas protozoários. As células extraídas de cortices recém-nascidos são mantidas in vitro por 14 dias com substituição periódica diferencial da mídia. Astrócitos e microglias são obtidos a partir do mesmo protocolo de extração por dissociação mecânica. Após a fenotipagem por citometria de fluxo, as células são infectadas com protozoários parasitas. A taxa de infecção é determinada por microscopia de fluorescência em diferentes pontos de tempo, permitindo assim a avaliação da capacidade diferencial das células gliais para controlar a invasão e a replicação do protozoário. Essas técnicas representam métodos simples, baratos e eficientes para estudar as respostas dos astrócitos e microglia às infecções, abrindo o campo para análises neuroimunologia suplementares.

Introduction

O SNC é composto principalmente por neurônios e células gliais1,2,3. Microglia e astrócitos são as células glia mais abundantes no SNC. Microglia, o macrófago residente, é a célula de glia imunocompetente e fagocítica no CNS3,4, enquanto os astrócitos são responsáveis pela manutenção da homeostase e exercem funções de apoio5.

Apesar de as células gliais serem conhecidas por serem conhecidas por serem responsáveis pelo apoio e proteção dos neurônios6,7, funções emergentes dessas células foram descritas na literatura recente, incluindo suas respostas às infecções8,9,10,11. Assim, há um empurrão para desenvolver métodos para isolar essas células gliais para entender suas funções individualmente.

Existem alguns modelos alternativos para estudar células gliais em vez de culturas primárias, como linhagens celulares imortalizadas e modelos in vivo. No entanto, as células imortalizadas são mais propensas a sofrer deriva genética e alterações morfológicas, enquanto estudos in vivo impõem condições limitadas de manipulação. Por outro lado, as culturas primárias são fáceis de manusear, se assemelham melhor às células in vivo e também nos permitem controlar fatores experimentais12,13. Aqui, descrevemos orientações sobre como extrair, manter e dissociar os astrócitos murina e as células primárias de microglia no mesmo protocolo. Além disso, também fornecemos exemplos de como trabalhar com a infecção por protozoários nessas culturas.

As células CNS extraídas de camundongos neonatais (até 3 dias de idade) foram cultivadas durante 14 dias em meios diferenciais que permitem o crescimento preferencial de astrócitos e microglias. Uma vez que a microglia está acima dos astrócitos anexados, as populações celulares foram mecanicamente dissociadas em uma incubadora orbital. Em seguida, coletamos todo o sobrenadante contendo microglia e adicionamos tripsina para desapegar os astrócitos. As células gliais isoladas foram avaliadas fenotipicamente por citometria de fluxo e banhadas de acordo com o experimento desejado.

Também fornecemos exemplos de como infectar essas microglias isoladas e astrócitos com parasitas protozoários. T. gondii é um protozoário altamente neurotrópico responsável pela toxoplasmose14, enquanto T. cruzi é responsável pela doença de Chagas que pode levar ao desenvolvimento de distúrbios neurológicos na CNS15,16. Além disso, também foi relatado que a infecção por T. gondii17,18 ou T. cruzi19,20,21 foram a causa presumida de morte em pacientes imunocomprometidos. Portanto, a elucidação do papel imunológico das células gliais do SNC no controle das infecções por protozoários é de grande importância.

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Protocol

Todos os procedimentos experimentais envolvendo camundongos foram realizados de acordo com a Lei Nacional (11.794/2008) e aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidado e Uso animal (IACUC) da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP).

1. Extração, Manutenção e Dissociação de Células Gliais

NOTA: O número de camundongos utilizados para a extração de células gliais depende da quantidade de células necessárias para realizar os experimentos desejados. Neste protocolo, foram obtidos um total de 2,7 x 107 astrócitos e 4 x 106 microglias de seis camundongos c57BL/6 neonatais. Todos os procedimentos foram realizados em condições estéreis em um gabinete de biossegurança classe II.

  1. Dia 1º
    1. Prepare a solução de sal balanceado de Hank puro (HBSS) e HBSS + 10% do soro bovino fetal inativado pelo calor (FBS) (ver Tabela de Materiais).
    2. Prepare o Suplemento Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 (10% FBS + 0,08 mM Penicilina + 0,09 mM Estreptomicina + 12,5 mM HEPES + 30 mM bicarbonato de sódio, pH 7,2) e filtrar com um filtro de 0,22 μm (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: Todas as mídias de cultura devem ser armazenadas a 4 °C, mas é necessário pré-aquecê-las a 37 °C por 20 min antes de iniciar o experimento.
    3. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos (tesoura, espátula e pinça) em uma autoclave e use 70% de etanol durante o procedimento.
    4. Coloque os camundongos recém-nascidos (até 3 dias de idade) em uma câmara selada contendo algodão encharcado com isoflurano por 5 min para anestesia profunda.
    5. Borrife o filhote de rato com 70% de etanol e decapite o animal com uma tesoura.
    6. Faça corte sagital (posterior a anterior) com tesoura ao longo do crânio para abri-lo e expor o cérebro. Separe o crânio do cérebro usando pinças. Remova o cérebro usando uma micro espátula para manter a integridade cerebral.
    7. Coloque o cérebro em uma placa de Petri seca (6 cm de diâmetro). Remova a lâmpada olfativa e o cerebelo usando uma micro espátula. Mova o córtex para outra placa de Petri (6 cm de diâmetro) contendo HBSS + 10% FBS (placa de 2 mL/Petri).
    8. Corte o tecido cerebral em pequenos pedaços com uma tesoura estéril e usando uma micropipete p1000 transfira cada tecido cerebral com HBSS + 10% FBS para diferentes tubos cônicos de 15 mL. Certifique-se de que o volume final é de 2 mL/tubo. Caso assim, completo com HBSS + 10% FBS.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Nesse caso, tubos cônicos com tecido CNS devem ser colocados no gelo até 1h.
    9. Lave o tecido cerebral cortado com 3 mL de HBSS + 10% FBS (por tubo) e após a decantação. Remova cuidadosamente o sobrenadante. Repita este passo 3 vezes.
      NOTA: Esta etapa visa remover os detritos e recuperar o tecido extraído.
    10. Lave o tecido cerebral cortado com 3 mL de HBSS puro (por tubo) e após a decantação, remova cuidadosamente o sobrenadante. Repita este passo 3 vezes.
      NOTA: Esta etapa visa remover o soro restante das lavadoras anteriores, pois as células serão trippsinizadas na próxima etapa.
    11. Adicione 3 mL de tripsina por tubo e coloque em banho-maria a 37 °C por 30 min, agitando suavemente os tubos a cada 5 min. Evite bolhas invertendo ou misturando abruptamente os tubos.
      NOTA: Esta etapa visa digerir o tecido coletado.
    12. Para inativar a tripsina, lave o tecido com 3 mL por tubo de HBSS + 10% FBS e, após a decantação do tecido, remova cuidadosamente o sobrenadante. Repita este passo 3 vezes.
    13. Lave o tecido com 3 mL por tubo de HBSS puro e remova cuidadosamente o sobrenadante. Repita este passo 2 vezes.
    14. Adicionar 7 mL por tubo de HBSS puro e homogeneizar o tecido através de sucessivas passagens em pipetas: primeiro com a pipeta sorológica de 10 mL, seguido pelo 5 mL e, finalmente, com a micropipette p1000.
    15. Após a homogeneização, os tubos de centrífuga a 450 x g para 5 min a 4 °C.
    16. Descarte o sobrenadante e resuspenda a pelota com 4 mL de HBSS + 10% FBS por tubo.
    17. Transferir células para um frasco T-75 pré-tratado para adesão ideal da cultura celular (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: Processe tecido de cada animal por frasco.
    18. Coloque o frasco na incubadora a 37 °C e 5% de CO2 por 30 min para adesão.
    19. Adicione 10 mL de DMEM/F12 suplementado por frasco e incubar a 37 °C e 5% CO2.
      NOTA: O volume final é de 14 mL por frasco.
  2. Dia 3.
    1. Remova 7 mL de meio de cultura do frasco T-75 e adicione 7 mL de DMEM/F12 fresco.
      NOTA: Os frascos conterão muitos detritos celulares e uma aparência nebulosa.
  3. Dia 5
    1. Remova todo o meio do frasco T-75 e adicione 14 mL de DMEM/F12 recém-suplementado.
      NOTA: O meio é substituído dos frascos para remover detritos e células não aderentes.
    2. Após cada 48 h, remova 6 mL do sobrenadante e adicione 7 mL de meio DMEM/F12 fresco até o dia 14 de cultura.
  4. Dia 14.
    1. Depois de remover 6 mL do sobrenadante e adicionar 7 mL de meio DMEM/F12 fresco, feche bem os frascos T-75.
    2. Coloque-os no agitador orbital do chão a 200 rpm e 37 °C durante a noite para dissociar mecanicamente a microglia dos astrócitos.
  5. Dia 15.
    1. Pegue os frascos do agitador e lave-os vigorosamente com seu próprio meio, a fim de otimizar a dissociação celular e colher o número máximo de microglia. Em seguida, colete o sobrenadante (contendo microglia) e transfira para um tubo cônico de 50 mL.
    2. Em seguida, adicione 4 mL de tripsina em cada frasco e incubar por 5 min a 37 °C, a fim de separar os astrócitos.
    3. Adicione 5 mL por frasco de DMEM/F12 suplementado para inativar a tripsina. Lave os frascos com seu próprio meio e transfira o conteúdo para um tubo cônico de 50 mL.
    4. Centrifugação de todos os tubos contendo microglia dissociada e astrócitos a 450 x g por 5 min a 4 °C.
    5. Descarte o sobrenadante. Resuspender a pelota de microglia em 1 mL e os astrócitos em 10 mL de DMEM/F12 suplementado.
    6. Vá para a contagem de células em uma câmara de Neubauer ou um contador automático de células. Emplacaas as células com DMEM/F12 suplementada na densidade desejada em uma placa de cultura de célula inferior plana apropriada (pré-tratada para a fixação celular ideal; ver Tabela de Materiais). Incubar células a 37 °C e 5% CO2 por 24 h para permitir que elas se conectem.
      NOTA: Reserve 1,5 x106 de cada população celular para confirmar sua pureza por citometria de fluxo.
    7. Realizar uma análise citométrica de fluxo para verificar a pureza das populações celulares.
      NOTA: Consideramos microglia CD11b+/CD45+/GFAP- e astrócitos CD11b-/CD45-/GFAP+. A coloração iba1 e tmem119 podem ser consideradas para caracterizar totalmente a microglia22.
    8. Adicione um FMO (Fluorescência Menos Um)23 e uma amostra não manchada para cada população celular (astrócitos e microglia) como controles do ensaio de citometria de fluxo.
    9. Para cada população celular, reserve 5 x 105 células para cada amostra manchada e não manchada. Para FMO, reserve outros dois tubos de microglia contendo 2,5 x 105 células cada e também reserve outro tubo de 5 x 105 astrócitos.
      NOTA: Uma vez que os números de microglia podem ser um fator limitante, é possível usar menos células para controles não-manchados e FMO.
    10. Centrifugar todos os microtubos a 450 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e resuspenda a pelota com 500 μL/microtubo de tampão FACS (solução salina tamponada com fosfato (PBS) + 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) + 2 mM EDTA, pH 7.2).
    11. Centrifugação de todos os microtubos a 450 x g a 4 °C por 5 min. Descarte o sobrenadante e resuspenda a pelota com 100 μL/microtubo de anti-CD16/CD32 (clone 93) (1:50) diluído no tampão FACS. Incubar por 10 min em temperatura ambiente.
    12. Adicione 500 μL/microtubo de tampão FACS em todos os microtubos e centrífugas a 450 x g a 4 °C por 5 min. Descarte o sobrenadante. Ressuspensão de tubos de coloração de microglia e também tubo fmo astrócito com 50 μL/microtubo de marcadores de superfície misturam: anti-CD45 (PE, clone 30-F11) e anti-CD11b (eFluor 450, clone M1/70) (ambos diluídos em 1: 100 no tampão FACS).
    13. Para células não manchadas, resuspenda com o mesmo volume de buffer FACS. Para microglia FMO, incubar cada tubo de microglia com anti-CD45 ou anti-CD11b. Incubar todas as amostras a 4 °C por 20 min no escuro.
    14. Adicione 500 μL de tampão FACS por microtubo. Centrifugação a 450 x g a 4 °C por 5 min. Descarte o sobrenadante e resuspenda a pelota com 100 μL/microtubo de tampão de fixação (ver Tabela de Materiais) por 20 min à temperatura ambiente no escuro.
    15. Adicione 500 μL/microtubo de tampão de permeabilização 1x (ver Tabela de Materiais) e incubar a 4 °C por 5 min no escuro.
    16. Centrifugar todos os microtubos a 450 x g a 4 °C por 5 min. Descarte o sobrenadante. Resuspender os tubos de coloração de astrocitos e microglia e também tubos de microglia FMO com 50 μL/microtubo de anticorpo intracelular anti-GFAP (APC, clone GA5) em uma diluição de 1:100 em tampão de permeabilização de 1x. Para células não manchadas e FMO astrócito, resuspenda as células com o mesmo volume de tampão FACS. Incubar todas as amostras a 4 °C por 30 min no escuro.
    17. Lave todos os tubos adicionando 500 μL/microtubo de tampão de permeabilização de 1x. Centrifugar todos os microtubos a 450 x g,por 5 min a 4 °C. Ressuspensão de cada microtubo em 200 μL de tampão FACS. Adquira 1 x 105 eventos/amostra no citómetro de fluxo.
    18. Para análise, as células devem ser fechadas primeiro em CD11b x CD45 e, em seguida, no histograma GFAP.
      NOTA: Os controles não manchados e FMO são úteis para determinar os portões.

2. Infecção e Avaliação das Taxas de Infecção

  1. Infecção de células gliais com T. gondii
    1. Placa 3 x 104 microglia ou astrócitos com DMEM/F12 suplementado a 37 °C e 5% CO2 para 24 h em uma placa plana pré-tratada de 96 poços (ver Tabela de Materiais).
    2. Infectar cada população celular com taquizoitas de T. cepa de rh gondii expressando proteína fluorescente amarela (YFP) em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1:1 (parasita:célula) diluída em 200 μL/poço de RPMI suplementado (3% FBS + 0,16 mM Penicilina + 0,18 mM Estreptomicina + 12,5 mM HEPES + 30 mM bicarbonato de sódio, pH 7.2) (ver Tabela de Materiais). Incubar a 37 °C e 5% CO2 por 48 h.
    3. Em seguida, descarte o sobrenadante e fixe as células adicionando 100 μL/poço de 1% de paraformaldeído (PFA) diluído em PBS a 4 °C por 24 horas.
    4. Substitua o PFA por 100 μL/poço de PBS em pH 7.2.
    5. Remova cuidadosamente os núcleos das células de sobrenadante e de coloração, pipetando 50 μL/poço de DAPI (5 mg/mL) diluído em PBS pH 7.2 (1:1.000) por 1 min de temperatura ambiente no escuro.
    6. Substitua a solução de coloração DAPI por 100 μL/poço de PBS (pH 7.2) e analise-a por microscopia de fluorescência.
  2. Infecção de células gliais com T. cruzi
    1. Placa 3 x 104 microglia ou astrócitos com DMEM/F12 suplementado a 37 °C e 5% CO2 para 24 h em uma placa plana pré-tratada de 96 poços (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: Para cada ponto de infecção, use uma placa diferente.
    2. Infectar as células gliais com trippomastigotes da cepa T. cruzi Y em um MOI de 5:1 (parasitas:células) diluídos em 200 μL/poço de RPMI suplementado e incubar a 37 °C e 5% CO2 por 2 h.
      NOTA: Este passo é importante para a invasão celular pelo parasita.
    3. Remova todo o sobrenadante e lave os poços adicionando 200 μL/poço de RPMI suplementado para remover todos os parasitas extracelulares. Remova o sobrenadante e adicione 200 μL/poço de RPMI recém-suplementado.
      NOTA: Esta etapa pretende remover todos os parasitas que não invadiram as células aderentes.
    4. Incubar células infectadas por 2h, 48h e 96 h para avaliar a replicação de T. cruzi em células gliais11.
    5. Após cada ponto de tempo, remova o sobrenadante e fixar as células com 100 μL/poço de metanol por 15 min à temperatura ambiente e, em seguida, substitua o metanol por 100 μL/poço de PBS (pH 7.2).
    6. Após a fixação, prepare as células para o ensaio de imunofluorescência da seguinte forma.
      1. Para evitar a autofluorescência, trate as células com 100 μL/poço de 50 mM NH4Cl diluído em PBS (pH 8.0) por 15 min. Lave as células adicionando 100 μL/poço de PBS e remova-a imediatamente (repita esta etapa 3 vezes).
      2. Em seguida, permeabilize as células adicionando 100 μL/poço de 0,5% Triton diluído em PBS por 15 min. Lave as células adicionando 100 μL/poço de PBS e remova-as imediatamente (repita esta etapa 3 vezes).
      3. Em seguida, incubar a cultura celular com 100 μL/poço de solução de bloqueio (5% leite sem gordura + 2% BSA diluído em PBS [pH 7.2]) para 1 h à temperatura ambiente. Lave as células adicionando 100 μL/poço de PBS e remova-as imediatamente (repita esta etapa 3 vezes).
      4. Para colorir amastigotos, incubar com 30 μL/poço de anticorpo monoclonal não comercial (mAb) 2C2 proteína anti-Ssp-4 (1:200) diluída em solução de bloqueio por 1h à temperatura ambiente.
      5. Lave as células adicionando 100 μL/poço de PBS e remova-as imediatamente (repita esta etapa 3 vezes). Incubar a placa com 30 μL/poço de anticorpo anti-rato secundário (1:500) diluído em PBS por 1 h à temperatura ambiente.
        NOTA: A proteína anti-Ssp-4 mAb 2C2 não comercial foi um presente gentil do Prof. Dr. Renato A. Mortara do Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia da Universidade Federal de São Paulo.
      6. Remova cuidadosamente os núcleos de sobrenadante e mancha adicionando 50 μL/poço de DAPI (5 mg/mL) diluído em PBS pH 7.2 (1:1.000) por 1 min à temperatura ambiente no escuro.
      7. Substitua a solução de coloração DAPI por 100 μL/poço de PBS pH 7.2 e analise-a por microscopia de fluorescência.

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Representative Results

No14º dia, a cultura das células gliais (Figura 1A) sofreu dissociação mecânica. As populações de células isoladas foram analisadas por citometria de fluxo segundo marcadores CD11b, CD45 e GFAP. Observou-se uma pureza de 89,5% para a população astrócida e de 96,6% para a população de microglias (Figura 1B). Após o isolamento, as células foram banhadas em uma placa plana de 96 poços e após 24 h estavam prontas para serem infectadas por T. cruzi ou T. gondii de acordo com os respectivos protocolos de infecção. Aqui nós fornecemos uma infecção temporal de T. cruzi como um exemplo de avaliação da taxa de infecção nessas células gliais.

Astrócitos e microglia (3 x 104 células/bem) foram infectados com T. cruzi no MOI = 5:1 (parasitas:células) por 2-96 h(Figura 2). A taxa de infecção foi avaliada por imunofluorescência por contagem do número de células e do número de parasitas manchados por um intercalador de DNA (DAPI). Resumidamente, pudemos observar que T. cruzi é capaz de invadir microglia e astrócitos a taxas semelhantes. Além disso, T. cruzi se replica em ambos os tipos celulares, atingindo a maior taxa de infecção a 96 h após a infecção (p.i.). Curiosamente, a 96 h p.i. a taxa de infecção é mais acentuada em astrócitos do que em microglia, sugerindo que as células de microglia são capazes de controlar a replicação do parasita de forma mais eficiente do que os astrócitos, como descrevemos anteriormente11.

É importante notar que o uso de parasitas geneticamente modificados que expressam repórteres fluorescentes ou parasitas rotulados com anticorpos fluorescentes específicos poderia melhorar a microscopia de imunofluorescência, uma vez que são melhor distinguidos do núcleo celular(Figura 3). Além disso, a taxa de infecção de parasitas fluorescentes pode ser determinada por outras técnicas, como a citometria do fluxo. Aqui fornecemos exemplos de t. gondii RH ecepções expressas em YFP(Figura 3A)e T. cruzi Y manchadas com proteína anti-Ssp-4 não comercial(Figura 3B).

Ao todo, este protocolo descreve como extrair, manter, dissociar e infectar células primárias de murina microglia e astrócitos, o que poderia ser uma poderosa ferramenta para estudar, por exemplo, respostas imunes de células gliais à infecção por protozoários como brevemente elucidada Aqui.

Figure 1
Figura 1: Astrócitos primários e células de microglia. (A) As imagens de células gliais c57BL/6 murine no14º dia de cultura foram obtidas por microscópio invertido (400x). A seta vermelha indica a camada de astrócitos e a seta preta indica a microglia. (B) Após a dissociação mecânica, os astrócitos e a microglia foram manchados (5 x 105 células) com anti-CD11b fluorescente, anti-CD45 e anti-GFAP e avaliados por citometria de fluxo (1 x 105 células de aquisição). Os astrócitos são considerados como Células CD11b-/CD45- e GFAP+, enquanto as microglias são CD11b+/CD45+ e GFAP- células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Curso de tempo da infecção por T. cruzi em células gliais. Os astrócitos e a microglia dos camundongos C57BL/6 foram infectados com T. cruzi Y (MOI = 5:1). Após 2h, 48h e 96h, as câmaras foram fixadas com metanol e manchadas com marcador de núcleo celular DAPI (azul) e anti-GFAP (vermelho). As imagens foram obtidas por microscópio de fluorescência invertida (400x). O número de amastigotos dentro das células e a frequência das células infectadas foram avaliados pelo software de microscópio de fluorescência (ver Tabela de Materiais). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Astrócitos e microglia infecção com parasitas protozoários fluorescentes. (A) 3 x 104 osascitos e microglia de camundongos C57BL/6 foram infectados (MOI = 1:1) com T. gondii RH YFP (verde) para 48 h, câmaras fixadas com 1% de PFA e manchadas com DAPI (azul). (B) 3 x 104 os astrócitos e microglia dos camundongos C57BL/6 foram infectados (MOI = 5:1) com T. cruzi Y por 96 h, e as câmaras foram fixadas com metanol puro e manchadas com DAPI (verde) e mAb 2C2 anti-Ssp-4 (laranja). As imagens foram adquiridas usando um microscópio de fluorescência invertida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A importância de estudar funções isoladas de células gliais em contextos biológicos distintos vem se expandindo nas últimas duas décadas. Compreender o SNC além dos neurônios ainda é um campo crescente na biologia celular, especialmente infecções ou condições inflamatórias8,9,24. As células gliais são cruciais não apenas para o suporte físico dos neurônios (como era conhecido anteriormente), mas também em muitas outras situações fisiológicas como o fornecimento de energia de neurônios, neurometabolismo, vigilância imunológica, poda sináptica, modelagem e modulação do tecido, entre outras3,25,26,27,28,29.

Uma vez que os astrócitos e a microglia podem ser modulados diferencialmente durante a infecção ou inflamação estéril, é de grande importância entender o papel individual e relativo dessas células gliais. Embora a microglia seja conhecida por representar o sistema de fagocitos mononucleares (MPS) no CNS, os astrócitos também foram descritos como um jogador crucial nas respostas imunes do CNS8. Para comparar o papel de cada subconjunto glial no contexto de infecção e/ou inflamação, é obrigatório obtê-los da mesma extração e condições. Há poucos relatos sobre as respostas dos efeitos de microglia e astrócitos para controlar infecções, especialmente no que diz respeito aos parasitas protozoários. Nesse sentido, recentemente demonstramos a exigência de nlrp3 inflamatório para o controle da replicação de T. cruzi em microglia, mas não em astrócitos por um mecanismo envolvendo secreção de óxido nítrico (NO)11.

Este protocolo descreve um método que se concentra em extrair simultaneamente as duas populações de células gliais mais abundantes, astrócitos e microglia, de camundongos pós-natal (até 3 dias de idade). Camundongos recém-nascidos com mais de 3 dias de idade podem ser usados, mas experimentamos que o rendimento de ambas as células diminui ligeiramente ao longo do tempo (dados não mostrados). Nosso método difere dos protocolos descritos anteriormente para os astrócitos ou isolamento da microglia porque focamos na obtenção e isolamento de ambos os tipos celulares na mesma extração, as mesmas condições, otimizando assim o uso de animais experimentais e melhorando o estudo do papel relativo dessas células em contextos imunológicos. Além disso, nosso protocolo também otimizou o rendimento de ambos os tipos de células. O rendimento é geralmente 3-5 x 106 astrócitos e 3-5 x 105 microglia por frasco. Compare isso com outros protocolos que resultam em menos células usando mais animais por frasco T-75 (alguns protocolos usam de 2 a 3 animais por frasco)30,31.

Outra vantagem deste protocolo é o tempo necessário para a obtenção de astrócitos isolados e microglia. Dentro de 14 dias é possível obter microglia madura. Na verdade, é importante destacar que, como Flode e Combs demonstraram, a microglia com mais de 14 dias apresenta diminuição da capacidade de segregar citocinas; é muito importante considerar isso em contextos neuroimunológicos30. Apesar de os fabricantes maduros de astrócitos não serem completamente compreendidos, o GFAP é amplamente usado para caracterizar astrócitos responsivos e ativos. Alguns protocolos atingem níveis de 90% de células positivas GFAP somente após 21 ou 28 dias de cultura. Por essa razão, propusemos um método que fornecia células imunoresponsivas e em sua maioria maduras dentro de 7 a 14 dias. Embora a tepividade possa ser menor do que outros métodos tanto para astrócitos31 quanto para microglia30,o foco principal foi obter microglia e astrócitos em maiorquantidade em uma extração concomitante. Entendemos que as populações celulares poderiam ser mais classificadas ou isoladas com a separação das colunas para melhorar suas purezas. Para isso, podem ser incluídos marcadores celulares adicionais, como Iba1 ou TMEM119 para microglia; Aquaporin-4 ou S100B para astrócitos, CC1 ou O4 para oligodendrócitos e NeuN para neurônios22,31,32,33. No entanto, uma perda celular importante no final do protocolo deve ser considerada.

Assim, fornecemos um método modificado para obter concomitantemente microglia e astrócitos em um protocolo eficiente e barato. Além disso, este protocolo proporciona as vantagens de um grande rendimento permitindo os estudos comparativos de subconjuntos gliais em contextos neuroimunológicos, como ilustrado aqui durante a infecção por T. cruzi e T. gondii.

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Disclosures

Os autores não têm nada para revelar.

Acknowledgments

Agradecemos ao professor Dr. Renato A. Mortara, da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), pelo mAb 2C2 anti-Ssp-4. Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, na justiça, na obra). subvenção 2017/25942-0 à K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), bolsa 402100/2016-6 à K.R.B.), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas (INCTV/CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Código financeiro 001). M.P.A. recebe bolsa do CNPq, A.L.O.P. recebe bolsa da CAPES, e I.S.F e L.Z.M.F.B. recebem bolsa da FAPESP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% Ethanol Dinâmica Química Contemporânea Cat: 2231 Sterilize
75 cm2 Flask Corning Cat: 430720U Plastic material
96 well cell culture plate Greiner Cellstar Cat: 655090 Cell culture
Ammonium Chloride (NH4Cl) Dinâmica Química Contemporânea Cat: C10337.01.AH Remove autofluorescence
Anti-GFAP antibody Abcam Cat.: ab49874 Immunofluorescence antidoby
Bottle Top Filter 0.22 μmm CA Corning Cat: 430513 Culture medium filter
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich Cat: A7906 FACS Buffer preparation
CD11b (FITC) BD Pharmigen Cat.: 553310 Flow cytometry antibody
CD45 (PE) Invitrogen Cat.: 12-0451-83 Flow cytometry antibody
Centrifuge Eppendorf Cat: 5810R Centrifugation
Centrifuge Eppendorf 5415R Centrifugation
Class II biosafety cabinet Pachane Cat: 200 Biosafety cabinet for sterile procedures
CO2 Incubator ThermoScientific Model: 3110 Primary cells maintenance
Conical tubes 15 mL Corning Cat: 430766 Plastic material
Conical tubes 50 mL Corning Cat: 352070 Plastic material
Countess automated cell counter Invitrogen Cat: C10281 Cell counter
DAPI Invitrogen Cat.: D1306 Immunofluorescence antidoby
Digital Microscope Camera Nikon Cat: DS-RI1 Capture images on microscope
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco Cat: 12800-058 Cell culture medium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich Cat: E9884 FACS Buffer preparation
F12 Nutrient Mixture Gibco Cat: 21700-026 Cell culture medium
FACS Canto II BD Biosciences Unavaiable Flow cytometer
Fetal Bovine Serum (FBS) LGC Biotechnology Cat: 10-bio500-1 Cell culture medium supplement
Flow Jo (software) Flow Jo Version: Flow Jo_9.9.4 Data analysis
Fluorescence intenselight Nikon Cat: C-HGFI Fluorescence source
GFAP (APC) Invitrogen Cat.: 50-9892-82 Flow cytometry antibody
Goat - anti-mouse IgG (FITC) Kirkeegood&Perry Lab (KPL) Cat.: 172-1806 Immunofluorescence antidoby
HBSS - Hank's Balanced Salt Solution Gibco Cat: 14175079 Cell culture medium
HEPES Sigma Aldrich Cat: H4034 Cell culture medium supplement
IC Fixation Buffer Invitrogen Cat: 00-8222-49 Cell fixation for Flow Citometry
Inverted microscope Nikon Model: ECLIPSE TS100 Microscope
Isoflurane Cristália Cat: 21.2665 Inhaled anesthetic
Methanol Synth Cat: 01A1085.01.BJ Fixation for Immunofluorescence
Micro spatula ABC stainless Unavaiable Surgical material
Microtube 1.5 mL Axygen Cat: MCT-150-C Plastic material
Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 Non commercial Non commercial Immunofluorescence antidoby
Multichannel Pipette (p200) Corning Cat: 751630124 Pipette reagents
NIS Elements Software Nikon Version 4.0 Acquire and analyse images
Non-fat milk Nestlé Cat: 9442405 Blocking solution for immunofluorescence
Orbital Shaker Incubator ThermoScientific Model: 481 Cat: 11 Dissociate microglia from astrocytes
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich Cat: P6148 Fixation for Immunofluorescence
PBS Non commercial Non commercial Neutral Buffer
Penicillin G Sigma Aldrich Cat: P-7794 Cell culture medium supplement
Permeabilization Buffer (10x) Invitrogen Cat: 00-8333-56 Cell permeabilization for Flow Citometry
Petri dish 60 mm x 15 mm (Disposable, sterile) Prolab Cat: 0303-8 Plastic material
pH meter Kasvi K39-1014B Calibrate pH solution
RPMI 1640 Medium Gibco Cat: 31800-014 Cell culture medium
Scissors ABC stainless Cat: LO9-W4 Surgical material
Serological pipette 10 mL Corning Cat: 4101 Plastic material
Serological pipette 5 mL Corning Cat: 4051 Plastic material
Single Channel Pipette (p1000) Gilson Pipetman Cat: F123602 Pipette reagents
Single Channel Pipette (p200) Gilson Pipetman Cat: F123601 Pipette reagents
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich Cat: S6297 Cell culture medium supplement
Streptomycin sulfate salt Sigma Aldrich Cat: S9137 Cell culture medium supplement
Triton X-100 Sigma Aldrich Cat: T9284 Permeabilization for immunofluorescence
Trypsin Gibco Cat: 27250-018 Digestive enzyme
Tweezers ABC stainless Cat: L28-P4-172 Surgical material
Water Bath Novatecnica Model: 09020095 Digeste tissue at 37 °C with trypsin

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References

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Imunologia e Infecção Problema 157 Células Glia astrócitos microglia infecção protozoária T. cruzi T. gondii
Isolamento concomitante de astrócitos primários e microglia para infecção por parasitas protozoários
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Pacheco, A. d. O. L., Amaral, M. P., … More

Pacheco, A. d. O. L., Amaral, M. P., de Farias, I. S., Bottino, L. Z. M. F., Bortoluci, K. R. Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection. J. Vis. Exp. (157), e60680, doi:10.3791/60680 (2020).

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