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Immunology and Infection

लीजोनेला न्यूमोफिला डॉट/आईसीएम स्राव प्रणाली की स्थानिक रूपरेखा सुविधाओं को हल करने के लिए लाइव सेल इमेजिंग और क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी लागू करना

Published: March 10, 2020 doi: 10.3791/60693
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 1,2, 1
1Department of Microbial Pathogenesis, Boyer Center for Molecular Medicine, Yale University School of Medicine, 2Microbial Sciences Institute, Yale University, 3Department of Microbiology and Molecular Genetics, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston

Summary

बैक्टीरियल कोशिकाओं की इमेजिंग एक उभरते सिस्टम जीव विज्ञान दृष्टिकोण है जो स्थिर और गतिशील प्रक्रियाओं को परिभाषित करने पर केंद्रित है जो बड़ी मैक्रोमॉलिक्यूलर मशीनों के कार्य को निर्देशित करते हैं। यहां, मात्रात्मक लाइव सेल इमेजिंग और क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के एकीकरण का उपयोग लीजोनेला न्यूमोफिला प्रकार चतुर्थ स्राव प्रणाली वास्तुकला और कार्यों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है।

Abstract

लीजोनेला न्यूमोफिला का डॉट/आईसीएम स्राव प्रणाली एक जटिल प्रकार चतुर्थ स्राव प्रणाली (T4SS) नैनोमशीन है जो बैक्टीरियल पोल पर स्थानीयकरण करती है और कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए प्रोटीन और डीएनए सब्सट्रेट्स की डिलीवरी में मध्यस्थता करती है, एक प्रक्रिया आम तौर पर प्रत्यक्ष सेल-टू-सेल संपर्क की आवश्यकता होती है । हमने हाल ही में क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो-ईटी) द्वारा डॉट/आईसीएम उपकरण की संरचना को हल किया है और दिखाया है कि यह एक सेल लिफाफा-फैले चैनल बनाता है जो एक साइटोप्लाज्मिक कॉम्प्लेक्स से जुड़ता है । दो पूरक दृष्टिकोण है कि नमूना की देशी संरचना की रक्षा लागू करने, जीवित कोशिकाओं और क्रायो-एट में फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी, प्रोटीन के सीटू दृश्य और stoichiometry के आत्मसात और अंय डॉट/आईसीएम उपइकाइयों के सापेक्ष प्रत्येक मशीन घटक के उत्पादन के समय में अनुमति देता है । ध्रुवीय स्थिति के लिए आवश्यकताओं की जांच करने के लिए और T4SS मशीन बायोजेनेसिस के साथ जुड़े गतिशील सुविधाओं की विशेषता के लिए, हम गुणसूत्र पर अपने मूल पदों पर डॉट/Icm ATPase जीन के लिए एक जीन एन्कोडिंग सुपरफोल्डर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन जुड़े है । निम्नलिखित विधि स्थिर जीवाणु कोशिकाओं में ध्रुवीकरण स्थानीयकरण, गतिशीलता और इन प्रोटीनों की संरचना की मात्रा निर्धारित करने के लिए जीवित कोशिकाओं और क्रायो-ईटी की मात्रात्मक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी को एकीकृत करती है। लीजोनेला न्यूमोफिला T4SS का अध्ययन करने के लिए इन दृष्टिकोणों को लागू करना डॉट/आईसीएम प्रणाली के कार्य की विशेषता के लिए उपयोगी है और इसे विभिन्न प्रकार के जीवाणु रोगजनकों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जो T4SS या अन्य प्रकार के बैक्टीरियल स्राव परिसरों का उपयोग करते हैं ।

Introduction

लीजोनेला न्यूमोफिला (एल न्यूमोफिला),लीजन रोग के एटिलॉजिकल एजेंट, मीठे पानी के जलाशयों में रहते हैं, जहां बैक्टीरिया जलीय मुक्त तैराकी प्रोटोजोआ के भीतर संक्रमित और नकल करके प्रचार करते हैं। एल न्यूमोफिला पीने योग्य जल स्रोतों से एयरोसोलाइज्ड बैक्टीरिया की साँस लेने पर मनुष्यों में रोग फैलने का कारण बनता है। संक्रमित कोशिकाओं में, मेजबान रास्तों का तोड़फोड़ एल न्यूमोफिला को वैक्यूल के एंडोसाइटिक परिपक्वता में देरी करने की अनुमति देता है जिसमें यह रहता है और एक सेलुलर डिब्बे के बायोजेनेसिस को बढ़ावा देने के लिए जो बैक्टीरियल प्रतिकृति का समर्थन करता है। यह प्रक्रिया एक विशेष जीवाणु प्रकार आईवीबी स्राव प्रणाली (T4BSS) द्वारा संचालित होती है जिसे डॉट/आईसीएम के नाम से जाना जाता है और 300 से अधिक "प्रभावक" प्रोटीन के प्रदर्शनों की सूची है जो संक्रमण के दौरान मेजबान साइटोसोल में स्थानांतरित हो जाती है ताकि सेलुलर कार्यों में हेरफेर की सुविधाहो 1,2,3,4,5। एक कार्यात्मक डॉट/आईसीएम उपकरण की कमी म्यूटेंट मेजबान साइटोसोल में प्रभावकों को वितरित करने में विफल रहते हैं, इंट्रासेलर प्रतिकृति के लिए दोषपूर्ण हैं, और रोग6,7के पशु मॉडलमें एविरूलेंट हैं ।

कई बैक्टीरियल प्रजातियों ने अत्यंत जटिल और गतिशील बहुघटक मशीनें विकसित की हैं जो संक्रमण प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक हैं। डॉट/आईसीएम सिस्टम जैसे अन्य टी4बीएसएस भी कोक्सिएला बर्नेटी और रिकेटसिएला ग्रेलीजैसे बैक्टीरियल रोगजनकों की इंट्रासेलर प्रतिकृति के लिए आवश्यक हैं । हालांकि T4BSS विकासवादी रूप से प्रोटोटाइप प्रकार IVA सिस्टम से संबंधित हैं, जो डीएनए हस्तांतरण में मध्यस्थता करते हैं और प्रभावक प्रोटीन की एक सीमित प्रदर्शनों की सूची प्रदान कर सकते हैं, डॉट/आईसीएम प्रणाली में लगभग दो बार कई मशीन घटक हैं और विभिन्न प्रकार के प्रभावकों को वितरित करते हैं । संभवतः, घटकों की संख्या में इस विस्तार ने डॉट/आईसीएम तंत्र को आसानी से8,9नए प्रभावकों को समायोजित करने और एकीकृत करने में सक्षम बनाया है ।

हमने हाल ही में सीटू में डॉट/आईसीएम उपकरण की संरचना को हल करने के लिए क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो-ईटी) का उपयोग किया और दिखाया कि यह एक सेल लिफाफा-फैले चैनल बनाता है जो एक साइटोप्लाज्मिक कॉम्प्लेक्स से जोड़ता है । इसके अलावा विश्लेषण से पता चला है कि साइटोसोलिक ATPase DotB साइटोसोलिक ATPase DotO के साथ बातचीत के माध्यम से एल न्यूमोफिला सेल ध्रुव पर डॉट/आईसीएम प्रणाली के साथ एसोसिएट्स । हमने पाया है कि DotB ज्यादातर जीवाणु कोशिकाओं में एक साइटोसोलिक आंदोलन प्रदर्शित करता है, यह दर्शाता है कि यह ATPase एक गतिशील साइटोसोलिक आबादी में मौजूद है, लेकिन यह भी ध्रुवीय डॉट/Icm परिसरों के साथ सहयोगियों । इसके अलावा, डॉटो आंतरिक झिल्ली परिसर से जुड़े डॉटो डिमर्स की एक अर्धिक असेंबली बनाता है, और एक डॉटबी हैक्सेस्टर इस साइटोप्लाज्मिक कॉम्प्लेक्स के आधार पर जुड़ता है। डॉटब-डॉटो ऊर्जा परिसर की असेंबली एक साइटोप्लाज्मिक चैनल बनाती है जो T4SS(चित्रा 1)10के माध्यम से सब्सट्रेट्स के स्थानांतरण का निर्देश देती है।

इन हाल के अग्रिमों के बावजूद, थोड़ा कैसे डॉट/Icm प्रणाली कार्य करता है और कैसे प्रत्येक प्रोटीन के लिए एक सक्रिय तंत्र8फार्म इकट्ठा के बारे में जाना जाता है । डॉट/आईसीएम T4SS की नियामक सर्किटरी को उजागर करना मेजबान-रोगजनक बातचीत के आणविक तंत्र को समझने के लिए मौलिक है । इसलिए, हम इस बात पर चर्चा करते हैं कि सुपर-फ़ोल्डर जीएफपी (एसएफजीएफपी) के साथ टैग किए गए आवश्यक एल न्यूमोफिला डॉट/आईसीएम सिस्टम घटकों का पता लगाने और उनकी विशेषता के लिए लाइव सेल माइक्रोस्कोपी और क्रायो-ईटी का उपयोग कैसे किया जाए। मात्रात्मक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, डॉटबी के ध्रुवीकरण को जंगली प्रकार की पृष्ठभूमि में परिभाषित किया जाएगा या जब टाइप IV सिस्टम हटा दिया जाएगा। समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग डॉट/आईसीएम साइटोसोलिक एटपास के बीच स्थानीयकरण और गतिशीलता में मतभेदों को निर्धारित करने के लिए किया जाएगा ।

लाइव इमेजिंग और क्रायो-ईटी जैसे दो पूरक दृष्टिकोणों का संयुक्त अनुप्रयोग अन्य इन विट्रो सिस्टम की तुलना में लाभ प्रदान करता है। दोनों विधियों को बरकरार कोशिकाओं में किया जाता है और T4BSS के प्राकृतिक पर्यावरण को संरक्षित किया जाता है, इस प्रकार नमूना तैयार करने के दौरान देशी संरचना के व्यवधान को कम किया जाता है। क्योंकि प्रोटीन की अतिअभिव्यक्ति स्राव तंत्र के स्टोइचियोमेट्री को ख़राब कर सकती है, एसएफजीएफपी फ्यूजन लीजोनेला गुणसूत्र को एलीलिक एक्सचेंज के माध्यम से वापस कर रहे हैं ताकि प्रत्येक संलयन एकल प्रति में एन्कोडेड हो और अभिव्यक्ति एंडोजेनस प्रमोटर द्वारा संचालित हो। गुणसूत्र-एन्कोडेड फ्यूजन का दृश्य एक परिभाषित समय बिंदु पर व्यक्त किए जा रहे प्रोटीन के सटीक स्तर की मात्रा को सक्षम बनाता है। क्रायो-ईटी के पास स्राव प्रणालियों की संरचना का निर्धारण करने के कई फायदे भी हैं। सबसे उल्लेखनीय लाभ यह है कि क्रायो-ईटी नमूनों में जमे हुए अक्षुण्ण कोशिकाएं शामिल हैं जो बैक्टीरियल सेल वास्तुकला के संदर्भ में देशी परिसरों को संरक्षित करती हैं। नतीजतन, क्रायो-ईटी जैव रासायनिक शुद्धिकरण दृष्टिकोणों के लिए बेहतर हो सकता है, जो झिल्ली परिसरों को निकालते हैं और मुख्य उपकरण से परिधीय प्रोटीन को पट्टी कर सकते हैं या समग्र संरचना को संशोधित कर सकते हैं। इसके अलावा, sfGFP जैसे भारी प्रोटीन के साथ ब्याज के प्रोटीन को टैग करना एक द्रव्यमान जोड़ता है जो क्रायो-ईटी द्वारा पता लगाने योग्य है और क्रायो-ईटी द्वारा प्राप्त संरचना पर डॉट/आईसीएम उपकरण के विभिन्न उपपरिसरों के मानचित्रण के साथ सहायता कर सकता है ।

यह दृष्टिकोण बहुआणविक परिसरों के बारे में संरचनात्मक जानकारी को उजागर करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है जो बैक्टीरियल सेल झिल्ली में इकट्ठा होते हैं। इन तकनीकों का उपयोग करस्पष्ट संरचनाओं की व्याख्या क्षेत्र को यह समझने में मदद करेगी कि T4BSS घटक कैसे कार्य करते हैं, फ़ंक्शन के लिए इतने सारे घटकों की आवश्यकता क्यों होती है, घटक अधिक जटिल के भीतर कैसे बातचीत करते हैं, और ये क्या कार्य करते हैं उपसभाएं प्रदर्शन करती हैं।

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Protocol

नोट: विकास, हेरफेर, और एल न्यूमोफिला की इमेजिंग से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को स्थानीय दिशानिर्देशों के अनुपालन में जैविक सुरक्षा स्तर 2 प्रयोगशाला में किया जाना चाहिए।

1. एल न्यूमोफिला क्रोमोसोम में एसएफजीएफपी का सम्मिलन एलीलिक एक्सचेंज और डबल चयन रणनीति का उपयोग करके(चित्रा 2, चित्रा 3)

  1. जीन रिप्लेसमेंट वेक्टर pSR47S11 निम्नलिखित अनुक्रम में क्लोन: ब्याज की साइट के 1,000 बीपी अपस्ट्रीम, फिर एसएफजीएफपी अनुक्रम, फिर ब्याज की साइट(चित्रा 2)के 1,000 बीपी डाउनस्ट्रीम। एसएफजीएफपी अनुक्रम को एन-टर्मिनस या सी-टर्मिनस के फ्रेम में रखा जाना चाहिए, जिसमें चार से आठ अमीनो एसिड होते हैं। परिणामस्वरूप वेक्टर को ई. कोलाई DH5ααpir में बदलें। बाद में, चारकोल-खमीर निकालने (CYE) आगर12 पर एकल उपनिवेशों के लिए लकीर एल न्यूमोफिला (प्राप्तकर्ता) 100 μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त और 37 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 3)पर 5 दिनों के लिए बढ़ते हैं।
  2. CYE-आगर-स्ट्रेप्टोमाइसिन पर स्ट्रीक एल न्यूमोफिला और 37 डिग्री सेल्सियस (भारी पैच)10पर 2 दिनों के लिए बढ़ते हैं। स्ट्रीक ई. कोलाई DH5α LB आगर पर pRK600 सहायक प्लाज्मिड (सहायक)13 के साथ बदल 25 μg/mL क्लोरम्फेनिकोल युक्त । £ आगर पर ई. कोलाई DH5ααpir (दाता) ५० μg/mL kanamycin युक्त लकीर ।
  3. त्रिमाता-पिता समागम करें: सहायक की एक कॉलोनी, दाता की एक कॉलोनी, और प्राप्तकर्ता बिना चयन के एक CYE आगर प्लेट पर तीन उपभेदों के पैच को ओवरलेइंग करके और 37 डिग्री सेल्सियस पर 4-8 घंटे के लिए इनक्यूबेटिंग करके। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक सहायक + प्राप्तकर्ता तनाव मिश्रण और एक दाता + प्राप्तकर्ता तनाव मिश्रण समय की एक ही अवधि के लिए इनक्यूबेट ।
  4. डीएच2ओ प्लेट 20 माइक्रोन और सीवाईई एगर पर प्रतिक्रियाओं के 500 माइक्रोन में संभोग प्रतिक्रियाओं को फिर से निलंबित करें जिसमें 100 μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन और 10 ग्राम/एमएल कानामाइसिन शामिल हैं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए बढ़ते हैं। CYE आगर पर परिणामी क्लोन के चार लकीर १०० μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए विकसित ।
  5. CYE आगर पर लकीर 16 क्लोन जिसमें 5% सुक्रोज और 100 μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन होते हैं और 5 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ते हैं। फिर, CYE आगर पर इन क्लोनों की लकीर ३२ जिसमें १०० μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन और CYE आगर पर १०० μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन और 10 μg/mL kanamycin युक्त और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए विकसित होते हैं ।

2. क्लोन का अलगाव जो एल न्यूमोफिला क्रोमोसोम में एसएफजीएफपी को एकीकृत करता है

  1. स्ट्रीक क्लोन जो CYE-आगर-स्ट्रेप्टोमाइसिन प्लेटों पर कनकमिन के प्रति संवेदनशील थे और कॉलोनी पीसीआर के साथ गुणसूत्र में एसएफजीएफपी के सम्मिलन की पुष्टि करते हैं। प्राइमर्स का उपयोग करें जो एसएफजीएफपी जीन के पूरक हैं और प्रविष्टि जंक्शन को बढ़ाने के लिए ब्याज के गुणसूत्र क्षेत्र में हैं।
    1. 10 माइक्रोएम प्राइमर समाधानों में से प्रत्येक के 0.5 माइक्रोन और एक कॉलोनी को 12.5 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में मिलाएं और 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मीटर के लिए विकृत करें। 10 मिन के लिए बर्फ पर ठंडा, 2x पीसीआर मास्टर मिश्रण समाधान के 12.5 μL जोड़ें, और एक पीसीआर विश्लेषण करते हैं।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए CYE-आगर-स्ट्रेप्टोमाइसिन प्लेटों पर अलग-अलग कॉलोनियों के भारी पैच उगाएं। एक एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोलॉटिंग करके एसएफजीएफपी फ्यूजन की अभिव्यक्ति के स्तर और स्थिरता की जांच करें।

3. फ्लोरोसेंटी टैग ्ड डॉट/आईसीएम घटकों के साथ एल न्यूमोफिला की लाइव सेल इमेजिंग

  1. अगारोज पैड की तैयारी
    1. पानी में 1% कम पिघलने वाले अगारोज समाधान के बारे में 30 एमएल बनाएं। के बारे में ९० एस के लिए एक गिलास फ्लास्क में माइक्रोवेव, कभी कभार घूमता है, जब तक अगारोज पूरी तरह से भंग हो जाता है ।
    2. 25 x 75 x 1.1 मिमी3 ग्लास स्लाइड के किनारे पर दो 22 x 22 x 0.15 मिमी3 ग्लास स्लाइड रखें, जो दूसरे के शीर्ष पर है। दूसरे किनारे पर दो और 22 x 22 x 0.15 मिमी3 ग्लास स्लाइड के ढेर।
    3. दो ऊपरी ग्लास स्लाइड के बीच केंद्र स्लाइड में पिघला हुआ अगारोज के 1 mL के बारे में पिपेट, तो पिघला हुआ अगागुलाब के शीर्ष पर एक और 25 x 75 x 1.1 मिमी3 स्लाइड जगह है । हवा के बुलबुले के गठन से बचने की कोशिश करें। स्लाइड्स में 15 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा।
    4. स्केलपेल या रेजर ब्लेड का उपयोग करके, धीरे-धीरे पैड को छोटे वर्गों में काट लें, ~ 5 x 5 मिमी2। 25 x 75 x 1.1 मिमी3 ग्लास स्लाइड पर एक डबल तरफा चिपकने वाला 17 x 28 x 0.25 मिमी3 फ्रेम को ठीक करें और स्लाइड पर कई पैड रखें।
  2. छवि अधिग्रहण
    नोट: निम्नलिखित चरणों को एक माइक्रोस्कोप के लिए वर्णित किया गया है जो स्लाइडबुक 6.0 के नियंत्रण में है और ठोस राज्य प्रकाशकों, सीसीडी मोनोक्रोम कैमरे और 100x ऑब्जेक्टिव लेंस (1.4 संख्यात्मक एपर्चर) से लैस है। यदि आवश्यक हो, तो उचित हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर विन्यास के साथ वैकल्पिक माइक्रोस्कोपी उपकरणों का उपयोग करें जिन्हें प्रोटोकॉल सेटिंग्स के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है।
    1. पैड पर कमजोर पड़ने के डीडीएच2ओ, भंवर और पाइप्ट 2-3 माइक्रोन के 1 mL में एल न्यूमोफिला का एक भारी पैच भंग करें। चिपकने वाले फ्रेम पर धीरे-धीरे 50 x 24 x 0.15 मिमी3 कवरस्लिप रखें।
    2. कैप्चर विंडो में एनडी को 180 से एडजस्ट करें। 2 × 2 के लिए बिनिंग समायोजित करें और 488 एनएम चैनल का उपयोग करने के लिए 500-1,000 सुश्री के बीच नमूना बेनकाब एक ही मापदंडों के साथ अनटैग एल न्यूमोफिला इमेजिंग द्वारा फ्लोरेसेंस संकेत की विशिष्टता को मान्य(चित्र4)।

4. ध्रुवीकरण स्थानीयकरण और डॉट/आईसीएम घटकों की गतिशीलता का परिमाणीकरण

नोट: निम्नलिखित चरण0.129 माइक्रोन प्रति पिक्सेल वाली छवियों के लिए डिज़ाइन किए गए हैं जो 2 x 2 बिनिंग के साथ अधिग्रहीत किए गए थे।

  1. एसएफजीएफपी फ्यूजन प्रोटीन के लिए ध्रुवीकरण का परिमाणीकरण(चित्रा 5)
    1. छवि के विपरीत समायोजित करें ताकि बैक्टीरिया स्पष्ट रूप से दिखाई दे। ध्रुव पर शुरू होने वाले 0.25 x 1.3 माइक्रोन2 आयत को रखने और साइटोप्लाज्म में विस्तार करने के लिए क्षेत्र उपकरण का उपयोग करें। आयत बैक्टीरियल सीमाओं के भीतर ठीक रहना चाहिए ।
    2. कम से कम 200 बैक्टीरिया को चिह्नित करें और ब्याज के क्षेत्रों के लिए मास्क बनाने के लिए मास्क बटन के लिए क्षेत्र का उपयोग करें। मास्क स्टैटिस्टिक्स एंड मास्क स्कोपके तहत ऑब्जेक्टचुनें . फिर, सुविधाओं और तीव्रताके तहत, निशान मतलब तीव्रता और विचरण।
    3. डेटा का निर्यात करें और प्रत्येक जीवाणु के ध्रुवता स्कोर की गणना मतलब तीव्रता के लिए विचरण के बीच अनुपात के रूप में ।
    4. उच्च थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए चरण और 488 एनएम चैनलों के साथ छवियों को प्राप्त करने के लिए एक चरण उद्देश्य और एक उपयुक्त कंडेनसर सेटअप का उपयोग करते हैं। जहां बैक्टीरिया पूरी तरह से अलग कर रहे हैं देखने के क्षेत्रों का चयन करने के लिए सुनिश्चित करें।
    5. छवि के चरण चैनल विपरीत को उस स्तर पर समायोजित करें जहां बैक्टीरिया स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं। ड्यूल चैनल इमेज खोलें, सेगमेंट मास्क विंडो बनाएं और चैनल को फेज में बदलें।
    6. एक उपयुक्त सीमा समायोजित करें और परिभाषित ऑब्जेक्टबटन के साथ छोटी वस्तुओं को हटा दें। रिफाइन मास्क के तहत किनारों की वस्तुओं को हटाएं और बाद में बैक्टीरिया के अलग मास्क चुनें जो एक दूसरे से सटे हुए हैं।
    7. प्रत्येक सेल के लिए 488 चैनल में सिग्नल के ध्रुवता स्कोर की गणना करें जैसा कि पहले चरण 4.1.2-4.1.3 में वर्णित किया गया था।
  2. एसएफजीएफपी फ्यूजन प्रोटीन के लिए गतिशीलता का परिमाणीकरण(चित्र6)
    नोट: छवि अधिग्रहण के लिए एक नमूना तैयार करने के लिए धारा 3 में निर्देशों का पालन करें। गतिशीलता को समय के साथ तीव्रता में परिवर्तन के रूप में परिभाषित किया गया है और निम्नलिखित चरणों को कम इमेजिंग अवधि (यानी, कई मिनट) के लिए डिज़ाइन किया गया है। पैड में जोड़ें उचित पूरक यदि अब इमेजिंग अवधि वांछित हैं।
    1. इमेज कैप्चर विंडो में, टाइमलैप्सको चिह्नित करें, अंतराल बॉक्स में अंतराल के समय दर्ज करें, और # टाइम पॉइंट्स बॉक्स में 2 दर्ज करें। ब्याज के फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करते हुए एल न्यूमोफिला की लगातार दो छवियां प्राप्त करें।
    2. छवि के विपरीत समायोजित करें जब तक कोशिकाएं स्पष्ट रूप से दिखाई न दें। तीन अलग-अलग मास्क रखने के लिए चित्रा 6ए और नीचे दिए गए विवरणों का पालन करें। कम से कम 400 कोशिकाओं के बीच में 0.25 x 0.25 माइक्रोन वर्ग रखने के लिए क्षेत्र उपकरण का उपयोग करें।
    3. ब्याज के वर्गों का मुखौटा (मुखौटा 1) बनाने के लिए मास्क बटन के लिए क्षेत्र का उपयोग करें। एक नया खाली मास्क (मास्क 2) बनाएं और कम से कम 25 यादृच्छिक कोशिकाओं के पूरे सेल क्षेत्र को चिह्नित करने के लिए पिक्सेल टूल या बहुभुज उपकरण का उपयोग करें, जिसका उपयोग फ्लोरेसेंस ब्लीचिंग की गणना करने के लिए किया जाएगा। एक नया खाली मुखौटा (मुखौटा 3) बनाएं और कोशिकाओं के बीच के क्षेत्रों को चिह्नित करने के लिए बड़े ब्रश टूल का उपयोग करें, जिसका उपयोग पृष्ठभूमि घटाव के लिए किया जाएगा।
    4. मास्क स्टैटिस्टिक्स एंड मास्क स्कोपके तहत, मास्क 1 और मास्क 2 के लिए ऑब्जेक्ट चुनें। फिर, सुविधाओं और तीव्रता केतहत, मतलब तीव्रता चुनें और दो मास्क के डेटा का निर्यात करें। मुखौटा 3 के लिए, पूरे मुखौटा की औसत तीव्रता का निर्यात।
    5. निम्नलिखित सूत्रों का उपयोग करके मुखौटा 1 में प्रत्येक वस्तु के लिए फ्लोरेसेंस तीव्रता में परिवर्तन की गणना करें:

Equation 1

Equation 2

जहां मुखौटा 1 सेल सेंटर में रखा गया 0.25 माइक्रोन × 0.25 माइक्रोन स्क्वायर है, मास्क 2 पूरे सेल को कवर करता है, मास्क 3 कोशिकाओं के बीच की पृष्ठभूमि है, टी 1 पहली बार बिंदु में मतलब तीव्रता है, और टी 2 दूसरी बार बिंदु में औसत तीव्रता है।

5. क्रायो-ईटी के साथ एसएफजीएफपी मास डेंसिटी का पता लगाना

  1. नमूना तैयारी, डेटा संग्रह, और पुनर्निर्माण
    1. एल न्यूमोफिला का एक भारी पैच उगाएं, जो 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए CYE-आगर-स्ट्रेप्टोमाइसिन प्लेटों पर फ्लोरोसेंटी टैग डॉट/आईसीएम प्रोटीन व्यक्त करता है। डीएच2ओ में कोशिकाओं को ओडी600 ~ 0.7 पर फिर से निलंबित करें। सेल सस्पेंशन के 20 माइक्रोन में कोलॉयडल गोल्ड पार्टिकल्स (बीएसए ट्रेसर, 10 एनएम) के 5 माइक्रोन जोड़ें।
    2. ताजा चमक-छुट्टी वाले होली कार्बन ग्रिड (सीयू 200 जाल पर आर 2/1) पर सेल मिश्रण का पिपेट 5 μL और 1 मिन के लिए खड़े होने दें। फिल्टर पेपर के साथ दाग और गुरुत्वाकर्षण-संचालित प्लंजर उपकरण का उपयोग करके तरल इथेन में फ्रीज करें जैसा कि पहले14,15वर्णित है।
    3. एक क्षेत्र उत्सर्जन बंदूक, एक ऊर्जा फिल्टर, वोल्टा चरण प्लेट, और एक प्रत्यक्ष पहचान डिवाइस से सुसज्जित एक ३०० केवी ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ जमे हुए हाइड्रेटेड नमूनों छवि । 26,000x और 42,000x आवर्धन पर एकल-धुरी झुकाव श्रृंखला एकत्र करें, जिसके परिणामस्वरूप क्रमशः 5.4 Å/पिक्सेल या 3.4 Å/पिक्सेल के नमूने स्तर पर पिक्सेल आकार होता है।
    4. ~0 μm defocus पर छवि ढेर इकट्ठा करने के लिए स्थलाकृतिक पैकेज सीरियलईएम का उपयोग करें, जिसमें -60 डिग्री और +60° के बीच झुकाव कोणों की एक श्रृंखला के साथ 3° चरण वृद्धि और ~ 60 ई की संचयी खुराक-/Å2,16। मोशनकॉर्217का उपयोग करके प्रत्येक स्टैक में खुराक-आंशिक फिल्म छवियों को संरेखित करें। TOMOAUTO14का उपयोग कर बहाव-सही ढेर इकट्ठा ।
    5. आईएमओडी मार्कर-निर्भर संरेखण18द्वारा बहाव-सही ढेर को संरेखित करें। विभाजन और प्रत्यक्ष छवि विश्लेषण और डब्ल्यूबीपी विधि20के लिए एसआईआरटी विधि19 के साथ टोमोग्राम का पुनर्निर्माण करें ।
  2. SfGFP संलयन नमूनों का सब्टोमोग्राम विश्लेषण
    1. सब्टोमोग्राम विश्लेषण14,21,22के लिए स्थलाकृतिक पैकेज I3 (0.9.9.3) का उपयोग करें।
      नोट: संरेखण पुनरावृत्ति से आगे बढ़ता है, जिसमें प्रत्येक पुनरावृत्ति तीन भागों से मिलकर होती है जिसमें संदर्भ और वर्गीकरण मास्क उत्पन्न होते हैं, सब्टोमोग्राम गठबंधन और वर्गीकृत होते हैं, और वर्ग औसत एक दूसरे के साथ गठबंधन होते हैं।
    2. प्रारंभिक संरेखण के लिए 4 x 4 x 4 binned subtomograms का उपयोग करें। उन कणों को मर्ज करें जो वर्ग औसत से संबंधित हैं और एसएफजीएफपी के अनुरूप इलेक्ट्रॉन घनत्व दिखाते हैं। SfGFP संलयन के साथ कणों छंटाई के बाद, एक उच्च संकल्प संरचना प्राप्त करने के लिए ब्याज के एक क्षेत्र (डॉट/आईसीएम साइटोप्लाज्मिक ATPase परिसर की तरह) के एक केंद्रित संरेखण के लिए 2 x 2 x 2 binned subtomograms का उपयोग करें ।

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Representative Results

एसएफजीएफपी के परिभाषित प्रविष्टि के निर्माण के लिए दो चरणों में दोहरे चयन के साथ अावनत पुनर्संयोजन का उपयोग किया गया था। पहले चरण में, त्रिमाता-पिता का समागम किया गया, जहां ई कोलाई हेल्पर स्ट्रेन MT616 से pRK600 conjugative प्लाज्मिड (एक इंप प्लाज्मिड) को दो समरूप क्षेत्रों द्वारा फ्लैंक किए गए sfGFP जीन युक्त आत्मघाती वेक्टर pSR47S के साथ दाता ई कोलाई तनाव के लिए जुटाया गया था, स्थानांतरण oriT और बैसिलस सब्सिल काउंटर्स इसके बाद, pRK600 से conjugation प्रणाली एल न्यूमोफिला (Lp01, चित्रा 2ए)में pSR47S व्युत्पन्न के संघकी सहायता से जुड़ाव । क्लोन है कि सफलतापूर्वक एक ही अंतरराष्ट्रीय घटना द्वारा pSR47S एकीकृत एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन कानआर के कारण चुना गया था और एक दूसरे अंतरराष्ट्रीय अनुमति के लिए प्रचारित किया गया । दूसरे क्रॉसओवर के दौरान सैक जीन खोने वाले क्लोन का चयन काउंटरचुलेरिचयनात्मक एजेंट सुक्रोज(चित्रा 2, चित्रा 3)पर कोशिकाओं को चढ़ाना द्वारा किया गया था । एक एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी (α-GFP) के साथ इम्यूनोलॉट विश्लेषण यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि क्या एसएफजीएफपी क्लीव्ड था और एक जंगली प्रकार में संलयन प्रोटीन की स्थिरता और अभिव्यक्ति के स्तर का आकलन करने के लिए या एक पूर्ण डॉट/आईसीएम हटाने उत्परिवर्ती में । इसके अलावा, माइक्रोस्कोपी के लिए आगे बढ़ने से पहले, गुणसूत्र में एसएफजीएफपी जीन के सही एकीकरण की पुष्टि पीसीआर(चित्रा 3)द्वारा की गई थी । एक बार स्थिरता और संलयन के एकीकरण की पुष्टि की गई, लाइव सेल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी किया गया था, और फ्लोरोसेंट सिग्नल क्लोन की विशिष्टता की तुलना माता-पिता के एसएफजीएफपी-नकारात्मक तनाव से की गई थी। इसके अलावा, उज्ज्वल क्षेत्र या चरण माइक्रोस्कोपी का उपयोग करदोहरी इमेजिंग का उपयोग करके कोशिकाओं के अनुपात की जांच करने के लिए किया गया था जिनके पास एक विशिष्ट फ्लोरोसेंट सिग्नल(चित्रा 4)था।

डॉटबी-एसएफजीएफपी का उत्पादन करने वाली कोशिकाओं का केवल एक अंश संलयन प्रोटीन(चित्रा 5ए)का ध्रुवीकरण स्थानीयकरण प्रदर्शित करता है। डॉटबी फ्लोरेसेंस सिग्नल के वितरण की विशेषता के लिए, उन कोशिकाओं में देशीय धुरी के साथ डॉटबी-एसएफजीएफपी की तीव्रता की मात्रा निर्धारित की गई थी। ध्रुवों पर डॉटबी तीव्रता साइटोसोल(चित्रा 5बी)की तुलना में लगभग 2x अधिक थी। क्योंकि यह निर्धारित करना महत्वपूर्ण है कि फ्लोरोसेंटी टैग किए गए संलयन प्रोटीन के स्थानीयकरण में जैविक प्रासंगिकता है या नहीं, हमने पूछा कि क्या डॉटबी-एसएफजीएफपी ध्रुवीकरण पूरी तरह से इकट्ठे टी4बीएसएस पर निर्भर था। इसलिए, डॉटबी-एसएफजीएफपी के ध्रुवीकरण स्कोर कोशिका के मध्य के पास मापी गई फ्लोरेसेंस की तुलना में ध्रुवों पर मापा गया मतलब फ्लोरेसेंस के अनुपात को दर्शाता है, जो एक जंगली प्रकार में व्यक्तिगत कोशिकाओं के लिए और T4BSS उत्परिवर्ती(चित्र 5सी-ई)में निर्धारित किया गया था। दरअसल, पूरे डॉट/आईसीएम सिस्टम के विलोपन ने DotB-sfGFP की ध्रुवीय स्थिति को निरस्त कर दिया, जिससे इस बात की पुष्टि हुई कि ध्रुवीय पुक्टा T4SS के साथ DotB के संघ का प्रतिनिधित्व करता है और इस ATPase की भर्ती के लिए डॉट/आईसीएम मशीन के महत्व का प्रतिनिधित्व करता है । अधिकांश एल न्यूमोफिला कोशिकाओं में, DotB-sfGFP ने साइटोसोलिक आंदोलन भी प्रदर्शित किया, जो यह दर्शाता है कि यह एक गतिशील साइटोसोलिक आबादी में मौजूद है, लेकिन ध्रुवीय डॉट/आईसीएम परिसर के साथ जुड़ने में भी सक्षम है । DotO और DotB ATPases के बीच गतिशील गति में मतभेदों की मात्रा निर्धारित करने के लिए, लगातार दो छवियों का अधिग्रहण किया गया और फ्लोरेसेंस तीव्रता में परिवर्तन निर्धारित किए गए और sfGFP(चित्रा 6ए)की तुलना में । जबकि एसएफजीएफपी और डॉटो-एसएफजीएफपी ने कोई गतिशील पैटर्न नहीं दिखाया, साइटोसोल में डॉटबी-एसएफजीएफ तीव्रता परिवर्तन स्थानांतरित कर दिए गए थे और काफी अधिक थे। इन टिप्पणियों से संकेत मिलता है कि DotB ATPase एक गतिशील साइटोसोलिक आबादी में मौजूद था और देर से चरण की विधानसभा प्रतिक्रिया में, स्थानिक गतिशील DotB ATPase ध्रुवीय स्थानीयकृत डॉट/आईसीएम T4SS(चित्रा 6बी)में भर्ती किया गया था ।

डॉट/आईसीएम मशीन के सापेक्ष डॉटबी के स्थानिक स्थान को परिभाषित करने के लिए, उच्च-थ्रूपुट क्रायो-ईटी का उपयोग डॉटबी-एसएफजीएफपी को व्यक्त करने वाले एल न्यूमोफिला तनाव में अक्षुण्ण T4BSS उपकरण की कल्पना करने के लिए किया गया था । सबसे पहले, डॉटबी-एसएफजीएफपी व्यक्त करने वाले एल न्यूमोफिला सेल का पुनर्निर्माण किया गया था और सेल लिफाफे में एम्बेडेड विशिष्ट कई शंकु के आकार के परिसरों(चित्रा 7ए, बी)का पता चला था। हमने पहले विभिन्न प्रकार के डॉट/आईसीएम म्यूटेंट, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और क्रायो-ईटी के साथ एपिस्टैटिक प्रयोगों का उपयोग करके प्रदर्शन किया था कि डॉटबी एटपास डॉटओ10की एक अनूठी असेंबली के नीचे स्थित है। DotB-sfGFP व्यक्त तनाव के औसत Subtomogram बरकरार T4BSS मशीन के संबंध में DotB की समग्र स्थिति निर्धारित की है । इस विश्लेषण से एसएफजीएफपी(चित्रा 7सी)के अतिरिक्त द्रव्यमान से संबंधित एक अतिरिक्त घनत्व का पता चला। अंत में, पूरे डॉट/आईसीएम T4SS के त्रि-आयामी सतह प्रतिपादन इंगित करता है कि एसएफजीएफपी डॉटबी हैक्सेसर के नीचे स्थित है, जो साइटोप्लाज्मिक एटपास कॉम्प्लेक्स(चित्रा 8)10के आधार पर डिस्क के रूप में इकट्ठा होता है ।

Figure 1
चित्रा 1: एल न्यूमोफिला डॉट/आईसीएम T4SS के त्रिआयामी सतह प्रतिपादन । OM = बाहरी झिल्ली, आईएम = आंतरिक झिल्ली, पीजी = पेप्टिडोग्लियान। छवि चेट्रिट डी एट अल10से संशोधित किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एल न्यूमोफिला गुणसूत्र में एसएफजीएफपी डालने के लिए उपयोग किए जाने वाले समरूप पुनर्संयोजन और एलीलिक एक्सचेंज का योजनाबद्ध अवलोकन। (ए)त्रिमाता-पिता का संभोग एक ई. कोलाई MT616 सहायक तनाव के बीच किया गया जो कंजुगरियप्लाज्म प्लाज्मिड pRK600 (एक इंप प्लाज्मिड), एक दाता ई. कोलाई तनाव है कि आत्महत्या वेक्टर pSR47S के साथ बदल जाता है, और एल न्यूमोफिला एक प्राप्तकर्ता के रूप में बंदरगाहों । (ख)सी-टर्मिनल एसएफजीएफ फ्यूजन प्रोटीन उत्पन्न करने के लिए एल न्यूमोफिला क्रोमोसोम में एसएफजीएफपी डालने के लिए आवश्यक चरणों को दर्शाती योजनाबद्ध मॉडल। एलेलिक एक्सचेंज म्यूटेंट का चयन दो चरणों में पूरा किया गया था, जिसमें कानामाइसिन और काउंटर चुनिंदा मार्कर सैबका उपयोग किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एलीलिक एक्सचेंज परख कार्यप्रवाह। एल न्यूमोफिला उचित चयन और वृद्धि के समय पर लकीर थी (विवरण के लिए प्रोटोकॉल अनुभाग देखें)। बाद में, गुणसूत्र में एसएफजीएफपी के सम्मिलन की पुष्टि कॉलोनी पीसीआर के साथ एसएफजीएफजीन के पूरक प्राइमर का उपयोग करके और प्रविष्टि स्थल को फ्लैंक करने वाले गुणसूत्र क्षेत्र के साथ की गई थी। एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण द्वारा संलयन प्रोटीन की स्थिरता की जांच की गई थी। नीचे बाएं पैनल: लेन 1 = अनटैग एलपी01,लेन 2 = एसएफजीएफपी डॉटबी ऑपरन, लेन 3 = डॉटबी-एसएफजीएफपी से व्यक्त किया गया है जो एक पूर्ण डॉट/आईसीएम विलोपन उत्परिवर्ती, लेन 4 = डॉटबी-एसएफजीएफपी में व्यक्त किया गया है जो जंगली प्रकार की पृष्ठभूमि में व्यक्त किया गया है। पश्चिम पश्चिम धब्बा = पश्चिमी दाग। प्रत्येक चरण में विश्लेषण किए गए क्लोन की संख्या कोष्ठक में इंगित की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एल न्यूमोफिला की लाइव सेल इमेजिंग फ्लोरोसेंटी टैग डॉट/आईसीएम सबयूनिट्स को व्यक्त करती है। (ए)दो दिन के भारी पैच से एल न्यूमोफिला को डीडीएच2ओ में फिर से निलंबित कर दिया गया और 1% कम पिघलने वाले अगारोज पैड के शीर्ष पर रखा गया । (ख)एक तनाव के फ्लोरेसेंस सिग्नल की विशिष्टता जो गुणसूत्र डॉटबी-एसएफजीएफपी को एन्कोड करता है, उसकी तुलना माता-पिता के जीएफपी-निगेटिव एलपी01 तनाव से की गई थी । स्केल बार = 3 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: डॉट/आईसीएम सिस्टम उपइकाइयों के ध्रुवीकरण स्थानीयकरण का परिमाणीकरण । (A) एलपी01 में व्यक्त डॉटबी-एसएफजीएफपी के वास्तविक समय के दृश्य ने ध्रुवीकरण स्थानीयकरण दिखाया। DotB-sfGFP एक फैलाना पैटर्न प्रदर्शित जब एक तनाव में व्यक्त किया, जहां पूरे डॉट/icm जीन क्लस्टर हटा दिया गया था(T4SS)। डॉटबी ऑपरन से व्यक्त किए गए अप्रयुक्त एसएफजीएफपी ने एक फैलाना साइटोसोलिक पैटर्न दिखाया और नियंत्रण के रूप में कार्य किया। स्केल बार = 3 माइक्रोन। (ख)ध्रुवीय या फैलाना पैटर्न के साथ कोशिकाओं की देशीयद्रि धुरी के साथ DotB-sfGFP फ्लोरेसेंस तीव्रता का परिमाणीकरण । नमूनों के आकार ध्रुवीय और गैर ध्रुवीय कोशिकाओं के लिए एन = 20 कोशिकाओं थे । *पी = 0.02, **पी ♫ 0.0001। इसके महत्व की गणना दो पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट से की गई और ध्रुव पर तीव्रता की तुलना में । (ग)ध्रुवीकरण की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मास्क का योजनाबद्ध मॉडल। (D)डॉटबी-एसएफजीएफपी जैसा कि पोलरिटी को निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मास्क के साथ चित्रा 5A में दिखाया गया है। (ई)ध्रुवों पर डॉटबी-एसएफजीएफपी की प्रचुरता, जब इसे जंगली प्रकार की पृष्ठभूमि में व्यक्त किया जाता है या जब पूरे डॉट/आईसीएम जीन क्लस्टर को हटा दिया जाता है, तो आवृत्ति घटता के रूप में प्रदर्शित किया जाता है । नमूनों के आकार प्रत्येक तनाव के लिए एन = 200 कोशिकाओं थे। * पी एंड एलटी; 0.0001। इस महत्व की गणना दो पूंछ वाले मान व्हिटनी परीक्षण द्वारा की गई थी और डॉटबी ऑपरन से व्यक्त एसएफजीएफपी की तुलना में । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: डॉट/आईसीएम फ्लोरोसेंट फ्यूजन की गतिशीलता का परिमाणीकरण । (क)एक योजनाबद्ध मॉडल जिसका उपयोग गतिशील या स्थिर एसएफजीएफफ्यूजन प्रोटीन के लिए फ्लोरेसेंस तीव्रता में परिवर्तन ों की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मास्क का चित्रण किया जाता है । टी1,2 पहली और दूसरी बार अंक का समय है और एम1,2,3 मुखौटा 1, मुखौटा 2, और मुखौटा 3 हैं। (ख) डॉटबी ऑपरन से व्यक्त डॉटबी-एसएफजीएफपी, डॉटओ-एसएफजीएफपी और एसएफजीएफपी की गतिशीलता आवृत्ति घटता के रूप में प्रदर्शित की जाती है। नमूनों के आकार प्रत्येक तनाव के लिए एन = 400 कोशिकाओं थे। *पी = 3.4 × 10-12, ***पी = 1.0 × 10-147. इसके महत्व की गणना एसएफजीएफपी की तुलना में दो पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट से की गई थी । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: सब्टोमोग्राम औसत का उपयोग डॉटबी-एसएफजीएफपी के एसएफजीएफपी घनत्व को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। (क)एक प्रतिनिधि एल न्यूमोफिला सेल से 26,000x आवर्धन के साथ अधिग्रहीत एक स्थलाकृतिक टुकड़ा DotB-sfGFP व्यक्त करता है, सेल लिफाफे में एम्बेडेड कई डॉट/आईसीएम मशीनों दिखा । (ख) एमें दिखाए गए एक ही एल न्यूमोफिला सेल पोल के 42,000x आवर्धन के साथ अधिग्रहीत एक स्थलाकृतिक टुकड़ा । OM = बाहरी झिल्ली, आईएम = आंतरिक झिल्ली। (ग)डॉटबी-एसएफजीएफपी को व्यक्त करने वाले तनाव से पुनर्निर्माण डॉटबी और एसएफजीएफपी (पीले तीर) के अनुरूप घनत्व दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: डॉट/आईसीएम साइटोसोलिक कॉम्प्लेक्स की त्रि-आयामी सतह प्रतिपादन । डॉटबी(ए),वाइल्ड टाइप(बी),और डॉटबी-जीएफपी (सी) एल न्यूमोफिला उपभेदों से पूरे डॉट-आईसीएम T4SS की त्रि-आयामी सतह प्रतिपादन। (D)साइटोसोलिक कॉम्प्लेक्स की संरचना डॉटबी (बैंगनी) और एसएफजीएफपी (ग्रीन) की स्थिति को दर्शाती है। डॉटबी (पीडीबी: 6जीबी23)की एक्स-रे संरचना को डॉटबी मानचित्र पर डॉक किया गया था। आईएम = आंतरिक झिल्ली। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

बैक्टीरियल स्राव प्रणालियों के कार्यों को स्पष्ट करना मेजबान-रोगजनक बातचीत की पूरी समझ के लिए महत्वपूर्ण है। स्राव प्रणाली जटिल मशीनें हैं जो मेजबान कोशिकाओं में प्रभावक प्रोटीन इंजेक्ट कर सकती हैं, और कुछ मामलों में एक उपकोशिकीय आला की स्थापना को बढ़ावा देती हैं जो बैक्टीरियल प्रतिकृति का समर्थन करती है। उपरोक्त विधि श्वसन जीवाणु रोगजनक लीजोनेला न्यूमोफिला के डॉट/आईसीएम स्राव प्रणाली का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण नए उपकरण प्रदान करती है, जो प्रभावक स्थानांतरण के तंत्र के लिए सुराग प्रदान करती है जो इसकी रोगजनकता के लिए आवश्यक हैं । इस दृष्टिकोण को आणविक स्तर पर उनकी गतिविधि को विच्छेदन करने के लिए लाइव बैक्टीरियल सेल इमेजिंग और संरचनात्मक अध्ययन ों को नियोजित करके अन्य स्राव प्रणालियों पर लागू किया जा सकता है। यह समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर फ्लोरोसेंटटैग स्राव प्रणाली घटकों की स्थानिक गतिशीलता का अध्ययन करके पूरा किया जा सकता है।

हमने स्वच्छ और अचिह्नित उत्परिवर्तनों का निर्माण किया, जहां एक जीन को संशोधित एलील द्वारा टैग या प्रतिस्थापित किया गया था, जो आणविक स्तर पर रोगजनकता की समझ के साथ-साथ संरचना-कार्य संबंधों की परिभाषा के लिए एक मौलिक दृष्टिकोण है जो दवा उपचारों के उत्पादन को जन्म दे सकता है24,25। एल न्यूमोफिला के उपभेदों कि आनुवंशिक रूप से व्यक्तिगत डॉट और Icm प्रोटीन को खत्म करने के लिए संशोधित किया गया है क्रायो-एट द्वारा डॉट/आईसीएम प्रणाली की संरचना का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम एन-टर्मिनस और सी-टर्मिनस टैग प्रोटीन की कार्यक्षमता की तुलना करना है। इसलिए, संलयन को एन्कोडिंग करने वाले उपभेदों को यूकेरियोटिक होस्ट कोशिकाओं में प्रतिकृति के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए, माइक्रोस्कोपी द्वारा यह निर्धारित करने के लिए कि बैक्टीरियल सेल में टैग किए गए प्रोटीन स्थानीयकरण पूरी तरह से इकट्ठे स्राव मशीन पर निर्भर है या नहीं, और अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम जीन से व्यक्त प्रोटीन की स्थिरता के लिए मूल्यांकन किया जाता है।

यह प्रोटोकॉल लाइव सेल माइक्रोस्कोपी प्रयोगों का उपयोग करता है, जिसका व्यापक रूप से सिग्नल ट्रांसड्यूक्शन, सेल्फ असेंबली, सक्रिय तस्करी और जीन विनियमन जैसी जटिल जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है। कोशिकाओं में एकल कणों की गतिशीलता, प्रक्षेप पथ और बातचीत को समझना सेल जीव विज्ञान26में एक मौलिक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है। हालांकि, यह देखते हुए कि एक कणों पर नज़र रखने हमेशा तेजी से आणविक आंदोलन या कम संकेत से शोर अनुपात के कारण संभव नहीं हो सकता है, फ्लोरेसेंस तीव्रता में परिवर्तन का मूल्यांकन गतिशीलता पैटर्न में मतभेदों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक सीधा दृष्टिकोण के रूप में काम कर सकते हैं । इसके अलावा, क्योंकि विश्लेषण के लिए केवल दो समय अंक की आवश्यकता होती है, यह पद्धति फ्लोरोसेंट प्रकाश के लिए नमूने के केवल न्यूनतम जोखिम की गारंटी देती है और इस प्रकार एसएफजीएफपी फ्लोरेसेंस तीव्रता के प्रमुख ब्लीचिंग को रोकती है। क्योंकि अगारोज पैड में पोषक तत्वों का कोई स्रोत नहीं होता है, इसलिए यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि CYE एगर प्लेटों से कोशिकाओं को लेने के तुरंत बाद लाइव इमेजिंग की जानी चाहिए। यदि इमेजिंग समय की लंबी अवधि की आवश्यकता होती है, तो पूरक है कि एल न्यूमोफिला अस्तित्व और विकास का समर्थन पैड में जोड़ा जाना चाहिए । फ्लोरोसेंटी टैग किए गए प्रोटीन की ध्रुवता का निर्धारण उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए भी संशोधित किया जा सकता है। यदि इनकी आवश्यकता है, तो दोहरी चैनल छवियों (यानी, चरण और फ्लोरोसेंट चैनल) प्राप्त करने के लिए एक चरण उद्देश्य और एक उपयुक्त कंडेनसर सेटअप का उपयोग किया जाना चाहिए। ऐसे क्षेत्रों का चयन करना महत्वपूर्ण है जहां बैक्टीरिया पूरी तरह से अलग हैं। पूरी कोशिकाओं को मुखौटा करने और ऊपर वर्णित तीव्रता के अनुपात की मात्रा निर्धारित करने के लिए चरण चैनल का उपयोग करें।

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) और क्रायो-ईटी नैनोकणों के मजबूत दृश्य प्रदान करते हैं। इन तकनीकों में एक जमे हुए हाइड्रेटेड राज्य में नमूने की इमेजिंग शामिल है, जो नैनोकणों के दृश्य को अनिवार्य रूप से अनुमति देती है क्योंकि वे अपने सेलुलर वातावरण27में मौजूद हैं। क्योंकि संकल्प नमूने की मोटाई से सीमित है, क्रायो-ईटी द्वारा प्राप्त संरचनाओं में क्रायो-ईएम द्वारा प्राप्त किए गए लोगों की तुलना में कम संकल्प है। फिर भी, क्योंकि प्रत्येक छवि में टोमोग्राम प्रकार चतुर्थ मशीनरी कई प्रतियों में मौजूद हैं, उपटोमोग्राम औसत के लिए नमूना आकार बढ़ाकर बढ़ा हुआ संकल्प प्राप्त किया जा सकता है। क्रायो-ईटी का एक प्रमुख लाभ यह है कि अक्षुण्ण जीवाणु कोशिकाओं में जटिल विधानसभाओं का दृश्य उनकी संरचना को बेहतर ढंग से संरक्षित कर सकता है, जो उनके प्राकृतिक पर्यावरण से निष्कर्षण पर कठोर परिवर्तन से गुजर सकता है।

अंत में, गतिशील प्रक्रियाओं का अध्ययन और अणुओं का स्थानीयकरण जैविक प्रणालियों के कार्य को समझने की दिशा में पहले चरणों में से एक है। यहां वर्णित विधि की ताकत और ध्यान जीवित बैक्टीरिया में डॉट/आईसीएम घटकों का प्रत्यक्ष दृश्य है, जो टाइप आईवीबी मशीनों या अन्य बहुप्रोटीन विधानसभाओं के कार्यों को नियंत्रित करने वाली गतिशील प्रक्रियाओं को उजागर करने की संभावना प्रदान करता है । इसके अलावा, क्रायो-ईटी के लिए युग्मन लाइव इमेजिंग एक रणनीति है जो लीजोनेला न्यूमोफिला स्राव प्रणाली की अधिक संरचना के संबंध में डॉट/आईसीएम मशीन में प्रमुख घटकों के लक्षण वर्णन की अनुमति देती है, और यह समझना है कि वे उपकरण में कैसे इकट्ठा और प्रत्यक्ष संरचना परिवर्तन करते हैं । जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन व्यवहार का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग की एक सीमा उनका अपेक्षाकृत बड़ा आकार है, जो टैग किए गए प्रोटीन के कार्य और गुणों को प्रभावित कर सकता है। बाद में स्थिरता और कार्यक्षमता का आकलन जरूरी है। इस दृष्टिकोण की एक और सीमा यह है कि वर्तमान में नमूना की मोटाई के परिणामस्वरूप सीमित संकल्प के कारण परमाणु संरचनाओं को प्राप्त नहीं किया जा सकता है । मॉडलिंग और फिटिंग घनत्व का विश्लेषण करने का एक प्रभावी तरीका हो सकता है, इस प्रकार उपइकाइयों के स्थानीयकरण या संरचना परिवर्तनों के मूल्यांकन की अनुमति देता है। भविष्य की जांच और इस दृष्टिकोण की आगे पूर्णता से बेहतर समझ होगी कि विभिन्न उपसभाओं में एक कार्यात्मक प्रकार चतुर्थ तंत्र कैसे शामिल है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

डीसी और सीआरआर को एनआईएच (R37AI041699 और R21AI130671) द्वारा समर्थित किया गया था। डी.पी., बीएच और जेएल को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01AI087946 और R01GM107629) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 nm colloidal gold particles Aurion 25486
100x Plan Apo objective (1.4 NA) Nikon
ACES Sigma-Aldrich A9758
Activated charcoal Sigma-Aldrich C5510
Agaroze GPG/LMP, low melt American bioanalytical AB00981
Bacto dehydrated agar BD 214010
CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera Photometrics
Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 µL Fisher Scientific AB-0578
Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh Quantifoil Q225-CR1
Iron(III) nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich 216828
K2 Summit camera for cryo-EM GATAN
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352
Microscope cover slides 22x22 mm Fisher Scientific 12-542B
Microscope cover slides 24x50 mm Fisher Scientific 12-545K
Microscope slides 25x75x1 mm Globe Scientific 1380
SlideBook 6.0 Intelligent Imaging Innovations
Spectra X light engine Lumencor
Taq 2X Master Mix New England BioLabs M0270
Titan Krios Thermo Fisher Scientific
Yeast Extract BD 212750

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References

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इम्यूनोलॉजी एंड इंफेक्शन इश्यू 157 लीजोनेला न्यूमोफिला,लीजन डिजीज रेस्पिरेटरी इन्फेक्शन इंट्रासेलर बैक्टीरियल पैमोजन टाइप IV स्राव प्रणाली डॉट/आईसीएम स्राव प्रणाली लाइव सेल इमेजिंग स्थानिक गतिशीलता मात्रात्मक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी सेलुलर संरचनाएं ऑलिक एक्सचेंज
<em>लीजोनेला न्यूमोफिला</em> डॉट/आईसीएम स्राव प्रणाली की स्थानिक रूपरेखा सुविधाओं को हल करने के लिए लाइव सेल इमेजिंग और क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी लागू करना
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Chetrit, D., Park, D., Hu, B., Liu,… More

Chetrit, D., Park, D., Hu, B., Liu, J., Roy, C. R. Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System. J. Vis. Exp. (157), e60693, doi:10.3791/60693 (2020).

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