L'imaging delle cellule batteriche è un approccio biologico dei sistemi emergenti incentrato sulla definizione di processi statici e dinamici che dettano la funzione di grandi macchine macromolecolari. Qui, l'integrazione dell'imaging quantitativo delle cellule vive e della tomografia crioelettronica viene utilizzata per studiare l'architettura e le funzioni del sistema di secrezione Legionella pneumophila tipo IV.
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Articolo metodologico
Applicazione di Live Cell Imaging e tomografia Cryo-Electron a risolvere le caratteristiche spatiotemporali del sistema di secrezione Legionella pneumophila Dot/Icm
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il sistema di secrezione Dot/Icm della Legionella pneumophila è una nanomacchina complessa di secrezione IV (T4SS) che localizza al polo batterico e media la somministrazione di substrati proteici e del DNA alle cellule bersaglio, un processo che generalmente richiede un contatto diretto tra cellule. Recentemente abbiamo risolto la struttura dell'apparato Punto/Icm mediante tomografia crioelettronica (cryo-ET) e dimostrato che forma un canale di involucro cellulare che si collega a un complesso citoplasmatico. L'applicazione di due approcci complementari che preservano la struttura nativa dell'esemplare, la microscopia fluorescente nelle cellule viventi e il crio-ET, consente la visualizzazione in situ delle proteine e l'assimilazione della stoichiometria e la tempistica della produzione di ciascuna componente macchina rispetto ad altre sottounità punto/icm. Per studiare i requisiti per il posizionamento polare e caratterizzare le caratteristiche dinamiche associate alla biogenesi della macchina T4SS, abbiamo fuso una proteina fluorescente verde di codifica genica ai geni AtPase di Dot/Icm nelle loro posizioni native sul cromosoma. Il seguente metodo integra la microscopia quantitativa a fluorescenza delle cellule viventi e il crio-ET per quantificare la localizzazione, la dinamica e la struttura polari di queste proteine nelle cellule batteriche intatte. L'applicazione di questi approcci per lo studio della Legionella pneumophila T4SS è utile per caratterizzare la funzione del sistema Dot/Icm e può essere adattata per studiare un'ampia varietà di patogeni batterici che utilizzano il T4SS o altri tipi di complessidi di secrezione batterica.
Introduzione
La legionella pneumophila (L. pneumophila), l'agente eziologico della malattia dei Legionari, abita serbatoi d'acqua dolce, dove i batteri si propagano infettando e replicandoalli protozoi acquatici di nuoto libero. L. pneumophila provoca focolai di malattia nell'uomo quando si verifica l'inalazione di batteri aerosolizzati da fonti di acqua potabile. Nelle cellule infette, la sovversione delle vie ospiti consente a L. pneumophila di ritardare la maturazione endocitica del vacuolo in cui risiede e di promuovere la biogenesi di un compartimento cellulare che supporta la replicazione batterica. Questo processo è guidato da un sistema ....
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Protocollo
NOTA: Tutte le procedure che comportano la crescita, la manipolazione e l'imaging di L. pneumophila devono essere eseguite in un laboratorio di livello di sicurezza biologica 2 in conformità con le linee guida locali.
1. Inserimento di sfGFP in L. pneumophila Cromosoma utilizzando Lo scambio allelico e doppia strategia di selezione (Figura 2, Figura 3)
- Clone nel vettore di sostituzione genica pSR47S11 la seguente sequenza: l'a monte di 1.000 bp del sito di interesse, quindi la sequenza sfGFP, quindi i 1.000 bp a valle del sito di ....
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Risultati
La ricombinazione omologa con doppia selezione in due fasi è stata utilizzata per costruire l'inserimento definito di sfGFP. Nella prima fase, L'accoppiamento triparentale è stato eseguito, dove il plasmide coniugale pRK600 (un plasmide IncP) del ceppo di aiuto E. coli MT616 è stato mobilitato al ceppo E. coli del donatore con il vettore suicida pSR47S contenente il gene sfGFP affiancato dalle due regioni omologhe, l'origine dell'oriT di trasferimento e il gene bacillus subtilselection.......
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Discussione
Chiarire le funzioni dei sistemi di secrezione batterica è fondamentale per una comprensione completa delle interazioni ospite-patogeno. I sistemi di secrezione sono macchine complesse che possono iniettare proteine efricchenti nelle cellule ospiti e in alcuni casi promuovono la creazione di una nicchia subcellulare che supporta la replicazione batterica. Il metodo di cui sopra fornisce importanti nuovi strumenti per studiare il sistema di secrezione punto/Icm del patogeno batterico respiratorio Legionella pneumophil.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
D.C. e C.R.R. sono stati supportati dai NIH (R37AI041699 e R21AI130671). D.P., B.H.e J.L sono stati supportati dai National Institutes of Health (R01AI087946 e R01GM107629).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Particelle di oro colloidale da 10 nm | Aurion | 25486 | |
| 100x Obiettivo Plan Apo (1,4 NA) | Nikon | ||
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | |
| Carbone attivo | Sigma-Aldrich | C5510 | |
| Agaroze GPG/LMP, | AB00981 | bioanalitico americano | |
| Bacto agar disidratato | BD | 214010 | |
| CoolSNAP EZ 20 MHz fotocamera digitale monocromatica | Photometrics | ||
| Gene Frame, 1,7x2,8 cm, 125 &; L | Fisher Scientific | AB-0578 | |
| Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh | Quantifoil | Q225-CR1 | |
| Nitrato di ferro (III) nonaidrato | Sigma-Aldrich | 216828 | |
| K2 Summit camera per cryo-EM | GATAN | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| Vetrini coprimicroscopio 22x22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Vetrini coprimicroscopio 24x50 mm | Fisher Scientific | 12-545K | |
| Vetrini per microscopio 25x75x1 mm | Globe Scientific | 1380 | |
| SlideBook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations Spectra | ||
| X light engine | Lumencor | ||
| Taq 2X Master Mix | New England BioLabs | M0270 | |
| Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | ||
| Estratto di lievito | BD | 212750 |
Riferimenti
- Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors. Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).
- Burstein, D., et al.
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Ristampe e permessi
