Summary
세균성 세포의 화상 진찰은 큰 거대 분자 기계의 기능을 지시하는 정적 및 동적 프로세스를 정의에 초점을 맞춘 신흥 시스템 생물학 접근입니다. 여기서, 정량적 라이브 세포 영상 및 극저온 단층 촬영의 통합은 레지오넬라 뉴모필라 형 IV 분비 시스템 아키텍처 및 기능을 연구하는 데 사용된다.
Abstract
레지오넬라 뉴모필라의 도트/Icm 분비 시스템은 박테리아 극에서 국소화되고 표적 세포에 단백질 및 DNA 기판의 전달을 중재하는 복합형 IV 분비 시스템(T4SS) 나노머신으로, 일반적으로 직접 세포 간 접촉을 요구하는 과정이다. 우리는 최근에 극저온 전자 단층 촬영 (cryo-ET)에 의해 Dot /Icm 장치의 구조를 해결하고 세포질 복합체에 연결되는 세포 봉투 에 걸친 채널을 형성하는 것으로 나타났습니다. 견본의 토착 구조물, 살아있는 세포 및 극저온 ET에 있는 형광 현미경 검사법, 단백질의 초기 시각화및 그밖 점/Icm subunits에 상대하여 각 기계 분대의 stoichiometry 그리고 생산의 타이밍을 보존하는 2개의 상보적인 접근을 적용하십시오. 극성 포지셔닝에 대한 요구 사항을 조사하고 T4SS 기계 생물 발생과 관련된 동적 특징을 특성화하기 위해, 우리는 염색체에 그들의 기본 위치에서 도트 / Icm ATPase 유전자에 슈퍼 폴더 녹색 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 융합했다. 다음 방법은 살아있는 세포의 정량형 형광 현미경 검사법을 통합하고 저온-ET는 그대로 세균 세포에서 이러한 단백질의 편도적 국소화, 역학 및 구조를 정량화합니다. 레지오넬라 폐렴구균 T4SS를 연구하기 위한 이러한 접근법을 적용하는 것은 도트/Icm 시스템의 기능을 특성화하는 데 유용하며 T4SS 또는 다른 유형의 세균 분비 복합체를 활용하는 다양한 세균성 병원체를 연구하는 데 적합할 수 있다.
Introduction
레지오넬라 폐렴구균 (L. 폐렴구기),군단의 병인 에이전트' 질병의, 민물 저수지에 살고, 여기서 박테리아는 감염 과 수생 자유 수영 원생 동물 내에서 복제하여 전파. L. 폐렴구균은 식수원에서 에어로졸화된 박테리아를 흡입할 때 인간에게 질병 발병을 일으킨다. 감염된 세포에서, 숙주 통로의 전복은 L. 뉴모필라가 상주하는 환액의 내분비 성 성숙을 지연시키고 세균 복제를 지원하는 세포 구획의 생물 발생을 촉진할 수 있게 합니다. 이 과정은 도트/Icm으로 알려진 특수 세균형 IVB 분비 시스템(T4BSS)과 감염 시토솔로 전이되는 300개 이상의 "이펙터" 단백질의 레퍼토리에 의해 구동되어 세포 기능의조작을용이하게 하기 위해1, 2,3,4,5. 기능성 도트/Icm 장치가 결여된 돌연변이체는 숙주 시토솔내로 이펙터를 전달하지 못하고, 세포내 복제에 결함이 있으며, 질병6,7의동물 모델에서 항법성이다.
많은 세균종은 감염 과정에 필요한 매우 복잡하고 역동적인 다성분 기계를 개발했습니다. 도트/Icm 시스템과 같은 다른 T4BSS는 콕시엘라 버네티와 리케티엘라 그릴리와같은 세균성 병원체의 세포내 복제에도 필수적입니다. T4BSS는 DNA 전달을 중재하고 이펙터 단백질의 제한된 레퍼토리를 전달할 수 있는 프로토타입 유형 IVA 시스템과 진화적으로 관련이 있지만, Dot/Icm 시스템은 거의 두 배에 달하는 기계 성분을 가지고 있으며 다양한 이펙터를 제공합니다. 아마도, 구성 요소의 수의 이 확장은 쉽게8,9새로운 이펙터를 수용하고 통합 하는 점 /Icm 장치를 가능하게했다.
우리는 최근에 극저온 전자 단층 촬영 (cryo-ET)을 사용하여 도트 / Icm 장치의 구조를 해결했으며 세포 종역학 복합체에 연결되는 세포 봉투 스패닝 채널을 형성하는 것으로 나타났습니다. 추가 분석은 세포질 ATPase DotO와의 상호 작용을 통해 L. 폐렴 구균 세포 극에서 도트 /Icm 시스템과 연관된 세포 토졸릭 ATPase DotB가 있음을 밝혔다. 우리는 DotB가 대부분의 세균성 세포에 있는 세포토솔릭 운동을 표시한다는 것을 것을을 발견했습니다, 이 ATPase가 동적 세포토실 인구에서 존재하고 또한 극성 점/Icm 복합체와 연관된다는 것을 나타내는. 또한 DotO는 내부 멤브레인 복합체와 관련된 DotO 이형제의 hexameric 어셈블리를 형성하고 DotB hexamer는이 세포질 복합체의 기지에 결합합니다. DotB-DotO 에너지 복합체의 조립은 T4SS(그림1)10을통해 기판의 전좌를 지시하는 세포질 채널을 생성한다.
이러한 최근의 발전에도 불구하고, Dot/Icm 시스템이 어떻게 기능하는지, 그리고 각 단백질이 어떻게 조립되어 활성 장치를 형성하는지에 대해서는 거의 알려져 없다8. Dot/Icm T4SS의 규제 회로를 밝히는 것은 호스트 병원체 상호 작용의 분자 메커니즘을 이해하는 데 기본적입니다. 따라서, 우리는 슈퍼 폴더 GFP (sfGFP)로 태그가 지정된 필수 L. 폐렴 구균 도트 / Icm 시스템 구성 요소를 감지하고 특성화하기 위해 라이브 세포 현미경 검사법 및 저온 ET를 사용하는 방법에 대해 논의합니다. 정량형 형광 현미경 을 사용하여 DotB의 극성 국소화는 야생 형 배경 또는 유형 IV 시스템이 삭제될 때 정의됩니다. 시간 경과 현미경 검사법은 도트 / Icm cytosolic ATPases 사이의 국소화 와 역학의 차이를 정량화하는 데 사용됩니다.
라이브 이미징 및 저온-ET와 같은 두 가지 상보적 접근법의 결합된 적용은 다른 체외 시스템에 비해 이점을 제공합니다. 두 방법 모두 손상되지 않은 세포에서 수행되고 T4BSS의 자연 환경을 보존하므로 샘플 준비 중에 기본 구조의 중단을 최소화합니다. 단백질의 과발현은 분비 장치의 stoichiometry를 손상시킬 수 있기 때문에, sfGFP 융합은 레지오넬라 염색체에 대한 모든 유린교환을 통해 반환되어 각 융합이 단일 카피로 인코딩되고 발현은 내인성 프로모터에 의해 구동된다. 염색체 로 인코딩 된 융합의 시각화는 정의 된 시점에서 발현되는 단백질의 정확한 수준을 정량화 할 수 있습니다. Cryo-ET는 또한 분비 시스템의 구조를 결정하는 많은 장점을 가지고 있습니다. 가장 주목할만한 장점은 cryo-ET 샘플이 박테리아 세포 아키텍처의 맥락에서 기본 복합체를 보존하는 냉동 그대로 의 세포로 구성되어 있다는 것입니다. 따라서, 저온-ET는 막 복합체를 추출하고 핵심 장치에서 말초 단백질을 제거하거나 전체 구조를 변형시킬 수 있는 생화학적 정제 접근법보다 바람직할 수 있다. 또한, sfGFP와 같은 부피가 큰 단백질로 관심 있는 단백질을 태깅하면 저온 ET에 의해 검출가능한 질량을 추가하고 저온-ET에 의해 얻어진 구조에 도트/Icm 장치의 상이한 소복합체를 매핑하는 데 도움을 줄 수 있다.
이 접근은 세균성 세포막에서 집합하는 다분자 복합체에 관하여 구조적인 정보를 밝히기 위한 강력한 공구입니다. 이러한 기술을 사용하여 해명된 구조의 해석은 현장에서 T4BSS 구성 요소가 작동하는 방식, 함수에 필요한 이유, 구성 요소가 더 복잡한 내에서 상호 작용하는 방법 및 이러한 기능을 이해하는 데 도움이 됩니다. 하위 어셈블리가 수행됩니다.
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Protocol
참고: L. 폐렴구균의 성장, 조작 및 이미징과 관련된 모든 절차는 현지 지침에 따라 생물학적 안전 수준 2 실험실에서 수행되어야 합니다.
1. 말기 교환 및 이중 선택 전략을 사용하여 L. 폐렴 구균 염색체에 sfGFP 삽입(그림 2, 그림 3)
- 유전자 치환 벡터 pSR47S11내로 클론하기 다음 서열: 관심 부위의 1,000 bp 상류, sfGFP 서열, 그 후 관심 부위의 1,000 bp 다운스트림(도2). sfGFP 서열은 4~8개의 아미노산을 포함하는 링커로 N-종단 또는 C-종단 끝에 프레임에 배치되어야 한다. 생성된 벡터를 대장균 DH5αλpir로 변환합니다. 나중에, 줄무늬 L. 폐렴구균(수용자)은 100 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 숯효모 추출물(CYE) 한천(agar12)에 대한 단일 콜로니에 대해 37°C에서 5일 동안 성장한다(그림3).
- CyE-agar-스트렙토마이신에 대한 줄무늬 L. 폐렴은 37°C(무거운 패치)에서 2일 동안 성장한다(무거운 패치)10. 25 μg/mL 클로람페니콜을 함유하는 LB 한천에서 pRK600 도우미 플라스미드(helper)13으로 변형된 대장균 DH5α. 50 μg/mL 카나마이신을 함유하는 LB 한천에 대장균 DH5αλpir(기증자)를 줄무늬.
- 삼부모 짝짓기를 수행: 도우미의 콜로니를 배양, 기증자의 식민지, 및 선택없이 CYE 한천 플레이트에 세 균주의 패치를 오버레이하고 37 °C에서 4-8 시간 동안 배양하여 받는 사람. 부정적인 대조는 같은 기간 동안 도우미 + 받는 사람 변형 믹스와 기증자 + 받는 사람 변형 믹스를 인큐베이션으로.
- ddH 2 O. Plate 20 μL 및 50 μL의 ddH2o. 플레이트에서 짝짓기 반응을 재개하고 100 μg/mL 스트렙토마이신과 10 μg/mL 카나마이신을 함유한 CYE 한천에 대한 반응의 50μL을 37°C에서 5일 동안 성장시다. 100 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 CYE 한천상에 생성된 클론의 4척을 37°C에서 5일 동안 성장시다.
- 5% 자당 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 CYE 한천에 16개의 클론을 연속하고 37°C에서 5일 동안 성장한다. 이어서, 100 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 CYE 한천과 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 10 μg/mL 카나마이신을 함유하는 CYE 한천에 이들 클론의 32개가 37°C에서 5일 동안 자랍니다.
2. L. 폐렴구균 염색체에 sfGFP를 통합한 클론 분리
- CYE-한천-스트렙토마이신 플레이트상에서 카나마이신에 민감했던 클론을 연속하여 콜로니 PCR로 염색체내로 sfGFP의 삽입을 확인한다. sfGFP 유전자 및 관심 있는 염색체 영역에 상보적인 프라이머를 사용하여 삽입 접합을 증폭시다.
- 10 μM 프라이머 용액과 1개의 콜로니각각의 0.5 μL을 최종 부피 12.5 μL에 혼합하고 95°C에서 10분 동안 변성한다. 10분 동안 얼음에 식히고, 2x PCR 마스터 믹스 용액 12.5 μL을 추가하고, PCR 분석을 수행합니다.
- 37 °C에서 2 일 동안 CYE-agar-스트렙토 마이신 플레이트에 고립 된 식민지의 무거운 패치를 성장. 항-GFP 항체로 면역블롯팅에 의해 sfGFP 융합의 발현 수준 및 안정성을 검사한다.
3. 형광 태그 도트 / Icm 구성 요소와 L. 폐렴의 라이브 세포 이미징
- 아가로즈 패드의 준비
- 물에 1% 저용융 아가로즈 용액의 약 30 mL을 확인합니다. 아가로즈가 완전히 용해될 때까지 유리 플라스크에 약 90년대동안 전자레인지에 돌리며 가끔 씩 소용돌이치기.
- 25 x 75 x 1.1mm3 유리 슬라이드의 가장자리에 2개의 22 x 22 x 0.15mm3 유리 슬라이드를 놓고 다른 슬라이드 위에 놓습니다. 다른 가장자리에 22 x 22 x 0.15 mm3 유리 슬라이드 를 두 개 더 쌓습니다.
- 용융 아가로스의 약 1 mL을 두 개의 상부 유리 슬라이드 사이의 중앙 슬라이드로 피펫을 넣고, 용융 된 아가로오스 위에 또 다른 25 x 75 x 1.1 mm3 슬라이드를 놓습니다. 기포의 형성을 피하십시오. 슬라이드를 4°C에서 15분간 식힙니다.
- 메스 나 면도날을 사용하여 패드를 작은 사각형으로 부드럽게 자르고 ~ 5 x 5mm2로자릅니다. 양면 접착제 17 x 28 x 0.25 mm3 프레임을 25 x 75 x 1.1 mm3 유리 슬라이드에 고정하고 슬라이드에 여러 개의 패드를 놓습니다.
- 이미지 수집
참고: 다음 단계는 SlideBook 6.0의 제어하에 있고 솔리드 스테이트 조명기, CCD 흑백 카메라 및 100x 대물 렌즈(1.4수치 조리개)가 장착된 현미경에 대해 설명합니다. 필요한 경우 프로토콜 설정에 따라 사용자 지정할 수 있는 적절한 하드웨어 및 소프트웨어 구성이 있는 대체 현미경 장치를 사용하십시오.- DdH2O, 소용돌이 및 피펫 2-3 μL의 1 mL에 L. 폐렴구균의 무거운 패치를 패드에 용해시다. 50 x 24 x 0.15 mm3 커버슬립을 접착 프레임 위에 부드럽게 놓습니다.
- 캡처 창에서 ND를 180으로 조정합니다. 비닝을 2×2로 조정하고 488 nm 채널을 사용하여 500-1,000 ms 사이의 샘플을 노출시재합니다.
4. 도트/Icm 부품의 극성 국소화 및 역학 정량화
참고: 다음 단계는 픽셀당 0.129μm의 이미지를 위해 설계되었으며, 이 단계는 2 x 2 비닝으로 획득되었습니다.
- sfGFP 융합 단백질에 대한 극성의 정량화(그림 5)
- 박테리아가 선명히 보이지 않도록 이미지 대비를 조정합니다. 영역 도구를 사용하여 극에서 시작하여 세포질로 확장되는 0.25 x 1.3 μm2 직사각형을 배치합니다. 사각형은 박테리아 테두리 내에 정확하게 유지되어야 합니다.
- 적어도 200개의 박테리아를 표시하고 영역을 마스크 버튼을 사용하여 관심 있는 영역에 마스크를 만듭니다. 마스크 통계 및 마스크 범위에서 개체를 선택합니다. 그런 다음 피처 및 강도아래에서 평균 강도 및 분산을 표시합니다.
- 데이터를 내보내고 각 박테리아의 극성 점수를 평균 강도에 대한 분산 사이의 비율로 계산합니다.
- 처리량이 높은 애플리케이션의 경우 위상 목표와 적절한 콘덴서 설정을 사용하여 위상 및 488nm 채널을 사용하여 이미지를 수집합니다. 박테리아가 완전히 분리된 시야를 선택해야 합니다.
- 박테리아가 명확하게 보이는 수준으로 이미지의 위상 채널 대비를 조정합니다. 듀얼 채널 이미지를 열고 세그먼트 마스크 만들기 창을 시작하고 채널을 단계로 변경합니다.
- 개체 정의 단추를 사용 하 고 적절 한 임계값을 조정 하 고 작은 개체를 제거 합니다. 미세 조정 마스크에서 가장자리 오브젝트 제거를 선택하고 나중에 서로 인접한 박테리아 마스크를 분리합니다.
- 앞서 4.1.2-4.3 단계에서 설명한 바와 같이 각 셀에 대한 488 채널에서 신호의 극성 점수를 계산합니다.
- sfGFP 융합 단백질에 대한 역학정량화(그림 6)
참고: 3절의 지침에 따라 이미지 수집을 위한 샘플을 준비합니다. 역학은 시간에 따른 강도의 변화로 정의되며 다음 단계는 짧은 이미징 기간(즉, 몇 분)을 위해 설계되었습니다. 더 긴 이미징 기간이 필요한 경우 패드에 적절한 보충제를 추가하십시오.- 이미지 캡처 창에서 타임랩스를표시하고 간격 상자에 간격 시간을 입력하고 # 시간 포인트 상자에 2를 입력합니다. 관심 있는 형광 단백질을 발현하는 L. 폐렴구기의 2개의 연속적인 영상을 획득한다.
- 셀이 선명할 때까지 이미지 대비를 조정합니다. 그림 6A와 아래 설명을 따라 세 가지 다른 마스크를 배치합니다. 영역 도구를 사용하여 0.25 x 0.25 μm 정사각형을 400개 이상의 셀 중간에 배치합니다.
- 영역을 사용하여 마스크 단추를 사용하여 관심 있는 사각형의 마스크(마스크 1)를 만듭니다. 새 빈 마스크(마스크 2)를 만들고 픽셀 도구 또는 다각형 도구를 사용하여 형광 표백을 계산하는 데 사용되는 최소 25개의 임의 셀의 전체 셀 영역을 표시합니다. 새 빈 마스크(마스크 3)를 만들고 큰 브러시 도구를 사용하여 셀 사이의 영역을 표시하여 배경 빼기에 사용됩니다.
- 마스크 통계 및 마스크 범위에서마스크 1에 대한 개체를 선택하고 마스크 2를 선택합니다. 그런 다음 피처 및 강도아래에서 평균 강도를 선택하고 두 마스크의 데이터를 내보냅니다. 마스크 3의 경우 전체 마스크의 평균 강도를 내보냅니다.
- 다음 수식을 사용하여 마스크 1의 각 개체에 대한 형광 강도 변화를 계산합니다.
여기서 마스크1은 셀 중심에 배치된 0.25 μm×0.25 μm 정사각형이고, 마스크 2는 세포 들 사이의 배경이고, 마스크 3은 세포 들 사이의 배경이고, t1은 첫 번째 시점의 평균 강도이고, t2는 두 번째 시점의 평균 강도이다.
5. 저온 ET를 가진 sfGFP 질량 밀도의 검출
- 샘플 준비, 데이터 수집 및 재구성
- CYE-agar-streptomycin 플레이트에 형광 태그가 붙은 도트/Icm 단백질을 37°C에서 48시간 동안 발현하여 L. 폐렴구균의 무거운 패치를 성장시. ddH2O에서 OD600~0.7로 세포를 재중단한다. 콜로이드 금 입자 5 μL(BSA 트레이서, 10 nm)을 세포 현탁액의 20 μL에 추가합니다.
- 피펫 5 μL을 갓 광채배출된 홀리 카본 그리드(Cu 200 메쉬상에서 R2/1)에 놓고, 앞서설명한 바와같이 중력 구동 플런저 장치를 사용하여 필터 페이퍼로 블롯및 액체 에탄에 동결하여 1분 동안 방치한다.
- 300 kV 투과 전자 현미경으로 동결 수화 된 시편을 현장 방출 총, 에너지 필터, Volta 위상 플레이트 및 직접 검출 장치가 장착된 이미지. 단일 축 틸트 계열을 26,000x 및 42,000x 배율로 수집하여 표본 수준에서 각각 5.4 Å/픽셀 또는 3.4 Å/픽셀의 픽셀 크기를 생성합니다.
- 토모그래피 패키지 SerialEM을 사용하여 ~0 μm 디포커스에서 이미지 스택을 수집하고 3° 단계 증분 및 누적 용량으로 -60°에서 +60°의 기울기 각도를 사용하여 ~ 60 e - /Å2,16의누적 용량을 수집합니다. MotionCor217을사용하여 각 스택에서 용량 분별 된 영화 이미지를 정렬합니다. TOMOAUTO14를사용하여 드리프트 보정 스택을 조립합니다.
- IMOD 마커 종속 정렬18에의해 드리프트 보정 스택을 정렬합니다. 세분화 및 직접 이미지 분석 및 WBP방법(20)에대한 SIRT 방법19로 토모그램을 재구성합니다.
- sfGFP 융합 샘플의 서브토모그램 분석
- 소토모그램분석14,21,22에대한 토모그래피 패키지 I3 (0.9.3)을 사용합니다.
참고: 각 반복은 참조 및 분류 마스크가 생성되고, 하위 토모그램이 정렬및 분류되고, 클래스 평균이 서로 정렬되는 세 부분으로 구성된 각 반복을 통해 반복적으로 진행됩니다. - 초기 정렬을 위해 4 x 4 x 4 binned 하위 토모그램을 사용합니다. 클래스 평균에 속하는 입자를 병합하고 sfGFP에 해당하는 전자 밀도를 표시합니다. sfGFP 융합으로 입자를 정렬한 후, 관심 영역(예: 도트/Icm 세포질 ATPase 복합체)의 집중정렬을 위해 2 x 2 x 2 가닝 된 서브토모그램을 사용하여 고해상도 구조를 얻습니다.
- 소토모그램분석14,21,22에대한 토모그래피 패키지 I3 (0.9.3)을 사용합니다.
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Representative Results
두 단계로 이중 선택과 상동성 재조합은 sfGFP의 정의된 삽입을 구성하는 데 사용되었다. 첫 번째 단계에서는 삼부모교교는, 대장균 조제균 MT616으로부터 pRK600 연상 플라스미드(IncP 플라스미드)를 두 개의 상동 부위에 의해 측면에 있는 sfGFP 유전자를 함유하는 자살 벡터 pSR47S를 가진 조균 균주 에게 동원된, 이식 오리의 기원과 바실러스의 기원을 수행하였다. 다음으로, pRK600으로부터의 컨쥬게이션 시스템은 pSR47S 유도체의 동원을 L. 뉴모필라(Lp01, 도 2A)로지원하였다. 단일 크로스오버 이벤트에 의해 pSR47S를 성공적으로 통합한 클론은 항생제 내성 유전자 KanR로 인해 선택되었고 제2 크로스오버를 허용하도록 전파되었다. 제2 크로스오버 동안 sacB 유전자를 잃은 클론은 역선택성 제제 자당 상에 세포를 도금하여 선택하였다(도2, 도 3). 항 GFP 항체(α-GFP)를 가진 면역블롯 분석은 sfGFP가 절단되었는지 여부를 결정하고 야생 형 또는 완전한 도트/icm 결실 돌연변이체에서 융합 단백질의 안정성 및 발현 수준을 평가하기 위해 수행되었다. 또한, 현미경 검사로 진행하기 전에, 염색체에 sfGFP 유전자의 정확한 통합은 PCR에 의해 확인되었다(그림 3). 일단 융합의 안정성과 통합이 확인되면, 살아있는 세포 형광 현미경 검사법을 수행하고, 형광 신호 클론의 특이성을 부모 sfGFP 음성 균주와 비교하였다. 또한, 밝은 필드 또는 위상 현미경을 사용하여 이중 이미징은 특정 형광 신호를 소유한 세포의 비율을 검사하는 데사용되었다(도 4).
DotB-sfGFP를 생성한 세포의 일부만이 융합 단백질의 극성 국소화를 나타내고있었다(도 5A). DotB 형광 신호의 분포를 특성화하기 위해, 이들 세포에서 종축을 따라 DotB-sfGFP의 세기를 정량화하였다. 극에서의 DotB 강도는 시토솔(도5B)보다약 2배 높았다. 형광태그융합단백질의 국소화가 생물학적 관련성을 가지고 있는지 를 결정하는 것이 중요하기 때문에, 우리는 DotB-sfGFP 극국화가 완전히 조립된 T4BSS에 의존했는지 물었다. 따라서, DotB-sfGFP의 극성 점수는 세포의 중간 부근에서 측정된 형광과 비교하여 극에서 측정된 평균 형광의 비율을 나타내는 것으로, 야생 형및 T4BSS 돌연변이체에서 개별 세포에 대해 결정하였다(도5C–E). 실제로, 전체 도트 /Icm 시스템의 삭제는 DotB-sfGFP의 극지 위치를 폐지, 극성 punctaT4S와 도트의 협회를 나타내는 것을 확인하고이 ATPase의 모집을위한 도트 / Icm 기계의 중요성. 대부분의 L. 폐렴구균 세포에서 DotB-sfGFP는 또한 세포질 운동을 표시하여 동적 세포질 집단에 존재하지만 극성 도트 /Icm 복합체와 연관될 수도 있음을 나타냅니다. DotO와 DotB ATPases 사이의 동적 움직임의 차이를 정량화하기 위해 두 개의 연속적인 이미지를 획득하고 형광 강도의 변화를 결정하고 sfGFP(그림 6A)와비교했습니다. sfGFP 및 DotO-sfGFP는 동적 패턴을 거의 또는 전혀 나타내지 않았지만, 시토솔의 DotB-sfGFP 강도 변화는 이동되었고 상당히 높았습니다. 이러한 관찰은 DotB ATPase가 동적 세포토솔릭 집단에 존재하고 후기 조립 반응에서, 공간적으로 역동적인 DotB ATPase가 극성 지역화 된 도트 / Icm T4SS(그림 6B)에모집되었음을 나타냅니다.
도트/Icm 기계에 대한 DotB의 공간 위치를 정의하기 위해, 고처리량 저온-ET는 DotB-sfGFP를 발현하는 L. 뉴모필라 균주에서 손상되지 않은 T4BSS 장치를 시각화하는 데 사용되었다. 먼저, DotB-sfGFP를 발현하는 L. 폐렴구균 세포의 재구성을 수행하고 세포 봉투에 내장된 전형적인 다중 원뿔형 복합체를 밝혀냈다(도7A, B). 우리는 이전에 DotB가 ATPase DotO10의독특한 어셈블리 아래에 공간적으로 위치하는 다양한 도트 /Icm 돌연변이체, 형광 현미경 검사법 및 극저온 ET를 사용하여 epistatic 실험을 사용한다는 것을 입증했습니다. DotB-sfGFP를 발현하는 스트레인의 서브토모그램 평균은 손상되지 않은 T4BSS 기계와 관련하여 DotB의 전반적인 위치를 결정하였다. 이 분석은 sfGFP의 추가 질량과 상관 관계가 있는 추가 밀도를 밝혀냈다(도7C). 마지막으로, 전체 도트/Icm T4SS의 3차원 표면 렌더링은 sfGFP가 도트B hexamer 아래에 위치한다는 것을 나타내며, 이는 세포질 ATPase 복합체의 기지에서 디스크로 조립된다(도8)10.
그림 1: L. 폐렴구균 도트/Icm T4SS의 3차원 표면 렌더링. OM = 외부 멤브레인, IM = 내부 멤브레인, PG = 펩티도글리칸. 이미지는 Chetrit D. 외10에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: SfGFP를 L. 폐렴구기 염색체에 삽입하는 데 사용되는 상동 재조합 및 알레릭 교환의 개략적 개요. (A)대조되는 플라스미드 pRK600(IncP plasmid), 자살 벡터 pSR47S로 형질전환되는 공여자 대장균 균주, 및 L. 폐렴구균을 수용자로서 수용자로 하는 대장균 MT616 도우미 균주 간에 삼부모 결합이 수행되었다. (B)C 말단 sfGFP 융합 단백질을 생성하기 위해 L. 폐렴구기 염색체내로 sfGFP를 삽입하는 데 필요한 단계를 묘사하는 회로도 모델. 말기 교환 돌연변이체의 선택은 카나마이신 및 카운터 선택 가능한 마커 sacB를사용하여 2단계로 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 모든전자 교환 분석 워크플로우. L. 폐렴구균은 적절한 선택 및 성장 시간에 줄무늬가 있었다 (자세한 내용은 프로토콜 섹션을 참조하십시오). 나중에, 염색체 내로 sfGFP의 삽입은 sfGFP 유전자및 삽입 부위측면에 있는 염색체 부위에 상보적인 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR로 확인되었다. 융합 단백질의 안정성은 항-GFP 항체를 이용한 면역블롯 분석에 의해 조사되었다. 왼쪽 아래 패널: 레인 1 = 태그가 지정되지 않은 Lp01,Lane2 = 도트B 오페론으로부터 표현된 sfGFP, 레인 3 = DotB-sfGFP는 완전한 도트/icm 결실 돌연변이로 표현, 레인 4 = 도트-sfGFP는 와일드 타입 배경으로 표현되었다. WB = 웨스턴 블롯. 각 단계에서 분석된 클론 의 수는 괄호 안에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 형광태그된 도트/Icm 소단위를 발현하는 L. 폐렴구균의 라이브 세포 영상. (A)L. 중증 패치로부터 의 L. 폐렴구균은 ddH2O에서 재중단시키고 1% 낮은 용융 아가로즈 패드 위에 놓였다. (b)염색체적으로 DotB-sfGFP를 인코딩하는 균주의 형광 신호의 특이성을 부모 GFP 음성 Lp01 균주와 비교하였다. 배율 막대 = 3 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 도트/Icm 시스템 하위 단위의 극성 지역화 정량화. (a) Lp01로 표현된 DotB-sfGFP의 실시간 시각화는 극성 국소화를 나타냈다. DotB-sfGFP는 전체 도트/icm 유전자 클러스터가 삭제된 균주에서 발현될 때 확산 패턴을 나타냈다(́T4SS). 도트B 오페론으로부터 발현된 융합되지 않은 sfGFP는 확산 시토솔릭 패턴을 나타내고 대조군으로 작용했다. 배율 막대 = 3 μm. (B)극성 또는 확산 패턴을 가진 세포의 세로 축을 따라 DotB-sfGFP 형광 강도의 정량화. 샘플 크기는 극성 및 비극성 세포에 대한 n = 20 셀이었다. *p = 0.02, **p ≤ 0.0001. 그 중요성은 두 꼬리 학생의 t-test에 의해 계산되었고 극의 강도와 비교되었습니다. (C)극성을 정량화하는 데 사용되는 마스크의 회로도 모델. (D) 도 5A에 나타난 바와 같이 도트B-sfGFP는 극성을 정량화하는 데 사용되는 마스크와 함께 사용된다. (E)극에서 DotB-sfGFP의 풍부, 야생형 배경으로 표현될 때 또는 전체 점/icm 유전자 클러스터가 삭제되었을 때, 주파수 곡선으로 표시된다. 샘플 크기는 각 균주에 대해 n = 200 셀이었다. * p < 0.0001. 유의는 두 꼬리 만 휘트니 시험에 의해 계산되고 도트B 오페론으로부터 표현된 sfGFP와 비교되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 도트/Icm 형광 융합의 역학정량화. (A)동적 또는 정적 sfGFP 융합 단백질에 대한 형광 강도의 변화를 정량화하는 데 사용되는 마스크를 묘사하는 회로도 모델. T1,2는 제1 및 제2 타임 포인트의 시간이고 m1,2,3은 마스크 1, 마스크 2 및 마스크 3이다. (B)도트B-sfGFP, 도트-sfGFP 및 도트B 오페론에서 표현된 sfGFP의 역학이 주파수 곡선으로 표시됩니다. 샘플 크기는 각 균주에 대해 n = 400 셀이었다. *p = 3.4 × 10-12, ** p = 1.0 × 10-147. 그 중요성은 sfGFP에 비해 두 꼬리 학생의 t 테스트에 의해 계산되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7: 서브토모그램 평균화는 DotB-sfGFP의 sfGFP 밀도를 결정하는 데 사용된다. (a)대표적인 L. 폐렴구균 세포로부터 26,000배 배율로 획득한 토모그래피 슬라이스는 DotB-sfGFP를 발현하여, 세포 봉투에 내장된 여러 개의 도트/Icm 기계를 나타냈다. (B) A에도시된 동일한 L. 폐렴구균 세포 극의 42,000x 배율로 획득한 토모그래피 슬라이스. OM = 외부 멤브레인, IM = 내부 멤브레인. (C)DotB-sfGFP를 발현하는 스트레인으로부터의 재구성은 DotB 및 sfGFP(노란색 화살표)에 해당하는 밀도를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 도트/Icm 시토솔릭 컴플렉스의 3차원 표면 렌더링. 전체 도트-Icm T4SS의 3차원 표면 렌더링은 □dotB (A),야생형(B), 및 도트B-gfp(C) L. 폐렴구균 균주에서. (D)시비토솔릭 복합체의 구조는 DotB(보라색)과 sfGFP(녹색)의 위치를 나타낸다. 도트B(PDB: 6GEB23)의X선 구조를 도킹하여 도킹하였다. IM = 내부 멤브레인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
세균 성 분 비 시스템의 기능을 해명 하는 호스트 병원 체 상호 작용의 완전 한 이해에 열쇠. 분비 시스템은 이펙터 단백질을 숙주 세포에 주입할 수 있는 복잡한 기계이며, 경우에 따라 세균 복제를 지원하는 세포내 틈새 시장 설립을 촉진합니다. 위의 방법은 호흡기 세균성 병원체 레지오넬라 폐렴구균의 도트 /Icm 분비 시스템을 연구하기위한 중요한 새로운 도구를 제공, 그 병원성에 필수적인 이펙터 전좌의 메커니즘에 단서를 산출. 이 접근은 분자 수준에서 그들의 활동을 해부하기 위하여 살아있는 세균성 세포 화상 진찰 및 구조적인 연구 결과를 채택해서 그밖 분비 시스템에 적용될 수 있습니다. 이것은 타임랩스 비디오 현미경을 사용하여 형광 태그가 붙은 분비 시스템 구성 요소의 시공간 역학을 연구함으로써 달성될 수 있습니다.
우리는 유전자가 변형된 대립 유전자에 의해 태그되거나 대체된 깨끗하고 표시되지 않은 돌연변이를 구성했는데, 이는 분자 수준에서 병원성을 이해하는 데 필요한 근본적인 접근법일 뿐만 아니라 약물요법의생산으로 이어질 수 있는 구조 기능 관계의 정의에 대한24,25. 개별 도트 및 Icm 단백질을 제거하기 위해 유전자 변형된 L. 폐렴구균의 균주는 저온 ET에 의해 도트/Icm 시스템의 구조를 결정하는데 사용될 수 있다. 프로토콜의 중요한 단계는 N-종단 및 C-종점 태그가 지정된 단백질의 기능을 비교하는 것입니다. 따라서, 융합을 코딩하는 균주는 진핵 숙주 세포에서 복제를 위해 시험되어야 하며, 현미경검사법에 의해 가시화되어 세균 세포에서 태그된 단백질 국소화가 완전히 조립된 분비 기계에 의존하는지 여부를 결정하고, 상류 및 하류 유전자로부터 발현된 단백질의 안정성을 평가한다.
이 프로토콜은 신호 변환, 자가 조립, 활성 인신 매매 및 유전자 조절과 같은 복잡한 생물학적 과정을 연구하는 데 널리 사용되는 라이브 세포 현미경 실험을 활용합니다. 세포에서 단일 입자의 역학, 궤적 및 상호 작용을 이해하는 것은 세포 생물학26에서근본적인 접근법을 나타낸다. 그러나 빠른 분자 이동 이나 낮은 신호 대 잡음 비율로 인해 단일 입자를 추적하는 것이 항상 가능하지 않을 수 있다는 점을 감안할 때 형광 강도의 변화를 평가하는 것은 역학 패턴의 차이를 정량화하는 간단한 접근 방식으로 작용할 수 있습니다. 또한 분석에 두 개의 시간 지점만 필요하기 때문에 이 방법론은 형광광에 대한 시료의 최소한의 노출만보장하여 sfGFP 형광 강도의 주요 표백을 방지합니다. 아가로즈 패드는 영양소의 어떤 근원도 포함하지 않기 때문에, 살아있는 화상 진찰은 CYE 한천 접시에서 세포를 취한 후에 즉시 수행되어야 한다는 것을 주의하는 것이 중요합니다. 이미징 시간의 더 긴 기간이 필요한 경우, 다음 보충 지원 L. 뉴 모필라 생존 및 성장 패드에 추가 해야 합니다. 형광 태그가 지정된 단백질의 극성을 결정하는 것은 또한 높은 처리량 응용 을 위해 수정될 수 있습니다. 필요한 경우 이중 채널 이미지(예: 위상 및 형광 채널)를 획득하려면 위상 목표와 적절한 응축기 설정을 사용해야 합니다. 박테리아가 완전히 분리된 분야를 선택하는 것이 중요합니다. 위상 채널을 사용하여 전체 세포를 마스크하고 위에서 설명한 것과 같은 강도의 비율을 정량화합니다.
극저온 전자 현미경 검사법 (저온 EM) 및 저온 ET는 나노 입자의 강력한 시각화를 제공합니다. 이 기술은 그들의 세포 환경27에서존재하는 나노 입자의 본질적으로 가시화를 허용하는 동결 된 수화 상태에서 샘플의 이미징을 포함합니다. 해상도는 시료의 두께에 의해 제한되기 때문에 저온-ET에 의해 얻어진 구조는 저온 EM에 의해 얻어진 구조보다 낮은 분해능을 가지고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 각 이미지 토모그램 유형 IV 기계는 여러 복사본에 존재하기 때문에, 서브토모그램 평균화에 대한 샘플 크기를 증가시킴으로써 증가된 분해능을 얻을 수 있다. Cryo-ET의 주요 장점 중 하나는 그대로 세균 세포에 있는 복잡한 어셈블리의 시각화가 그들의 구조를 더 잘 보존할 수 있다는 것입니다, 이는 그들의 자연 환경에서 추출시 급격한 변화를 겪을 수 있습니다.
결론적으로, 동적 프로세스의 연구 와 분자의 국소화는 생물학적 시스템의 기능을 이해하기위한 첫 번째 단계 중 하나입니다. 여기에 설명된 방법의 강도와 초점은 살아있는 박테리아의 Dot/Icm 구성 요소의 직접 시각화이며, 이는 유형 IVB 기계 또는 기타 다단 단백질 어셈블리의 기능을 지배하는 동적 프로세스를 발견할 수 있는 가능성을 제공합니다. 또한, 라이브 이미징을 cryo-ET에 결합하는 것은 레지오넬라 폐렴 분비 시스템의 더 큰 구조와 관련하여 Dot/Icm 기계의 주요 구성 요소의 특성화를 허용하고 장치의 형태 변화를 조립하고 직접 하는 방법에 대한 이해를 허용하는 전략입니다. 살아있는 세포에 있는 단백질 행동을 공부하기 위해 이용된 형광성 단백질 꼬리표의 한가지 제한은 태그가 붙은 단백질의 기능 그리고 속성에 영향을 미칠 수 있는 그들의 상대적으로 큰 크기입니다. 그 후 안정성과 기능에 대한 평가가 필요합니다. 이 방법의 또 다른 제한사항은 샘플 두께로 인한 제한된 분해능으로 인해 현재 원자 구조를 얻을 수 없다는 것입니다. 모델링 및 피팅은 밀도를 분석하는 효과적인 방법이 될 수 있으므로 하위 단위의 국소화 또는 형태 변화 평가가 가능합니다. 향후 조사와 이 접근 방식의 추가 완성은 서로 다른 하위 어셈블리가 기능형 IV 장치를 구성하는 방법을 더 잘 이해할 수 있도록 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
D.C. 및 C.R.R.은 NIH(R37AI041699 및 R21AI130671)에 의해 지원되었습니다. D.P., B.H., 및 J.L은 건강의 국가 학회에 의해 지원되었습니다 (R01AI087946 및 R01GM107629).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 nm colloidal gold particles | Aurion | 25486 | |
| 100x Plan Apo objective (1.4 NA) | Nikon | ||
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C5510 | |
| Agaroze GPG/LMP, low melt | American bioanalytical | AB00981 | |
| Bacto dehydrated agar | BD | 214010 | |
| CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera | Photometrics | ||
| Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 µL | Fisher Scientific | AB-0578 | |
| Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh | Quantifoil | Q225-CR1 | |
| Iron(III) nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | 216828 | |
| K2 Summit camera for cryo-EM | GATAN | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| Microscope cover slides 22x22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope cover slides 24x50 mm | Fisher Scientific | 12-545K | |
| Microscope slides 25x75x1 mm | Globe Scientific | 1380 | |
| SlideBook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Spectra X light engine | Lumencor | ||
| Taq 2X Master Mix | New England BioLabs | M0270 | |
| Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | ||
| Yeast Extract | BD | 212750 |
References
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