Summary
Hier presenteren we een aangepaste screeningmethode die uitgebreid kan worden gebruikt om RNA-uitschakelingssuppressors in plantenpathogenen snel te screenen.
Abstract
RNA-uitschakeling is een evolutionair geconserveerd, sequentiespecifiek genregulatiemechanisme in eukaryoten. Verschillende plantenpathogenen hebben eiwitten ontwikkeld met de mogelijkheid om de gastheer plant RNA uitschakeling pad remmen. In tegenstelling tot virus effector eiwitten, slechts een aantal uitgescheiden effector eiwitten hebben aangetoond dat de mogelijkheid om RNA-uitschakeling te onderdrukken in bacteriële, oomycete, en schimmelpathogenen, en de moleculaire functies van de meeste effectors blijven grotendeels onbekend. Hier beschrijven we in detail een enigszins gewijzigde versie van de co-infiltratietest die kan dienen als een algemene methode voor het observeren van RNA-uitschakeling en voor het karakteriseren van effector-eiwitten die worden afgescheiden door plantaardige pathogenen. De belangrijkste stappen van de aanpak zijn het kiezen van de gezonde en volledig ontwikkelde bladeren, het aanpassen van de bacteriecultuur aan de juiste optische dichtheid (OD) op 600 nm, en het observeren van groene fluorescerende eiwitten (GFP) fluorescentie op het optimale moment op de geïnfiltreerd bladeren om te voorkomen dat effectoren met een zwakke onderdrukkingsactiviteit worden weggenomen. Dit verbeterde protocol zal bijdragen aan een snelle, nauwkeurige en uitgebreide screening van RNA-uitschakelingssuppressors en dient als een uitstekend uitgangspunt voor het onderzoeken van de moleculaire functies van deze eiwitten.
Introduction
In de afgelopen twee decennia heeft versnelling van genoomsequencing van micro-organismen die plantenziekten veroorzaken geleid tot een steeds grotere kenniskloof tussen sequentie-informatie en de biologische functies van gecodeerde eiwitten1. Onder de moleculen onthuld door sequencing projecten zijn effector moleculen die aangeboren immuniteit te onderdrukken en te vergemakkelijken gastheer kolonisatie; deze factoren worden afgescheiden door destructieve plantenpathogenen, waaronder bacteriën, aaltjes en filamenteuze microben. Om op deze bedreigingen te reageren, hebben waardplanten nieuwe receptoren ontwikkeld die deze effectoren herkennen, waardoor herstel van de immuunrespons mogelijk is. Effectoren zijn dus onderhevig aan verschillende selectieve druk, wat leidt tot diversificatie van effectorrepertoires onder pathogene lijnen2. In de afgelopen jaren is aangetoond dat putatieve effectoren van plantenpathogenen de immuniteit van planteningeboren en ontkracht door druk te maken tot cellulaire processen van de gastheer om de microben op verschillende manieren ten goede te komen, waaronder dysregulatie van signaleringstrajecten, transcriptie, intracellulair vervoer, cytoskeletstabiliteit, blaashandel en RNA-uitschakeling3,4,5. De overgrote meerderheid van de pathogene effectoren, met name die van filamenteuze ziekteverwekkers, is echter raadselachtig gebleven.
RNA-uitschakeling is een homologie-gemedieerde geninactivatiemachines die worden bewaard onder eukaryoten. Het proces wordt geactiveerd door lange dubbelstrengs RNA (dsRNA) en richt zich op het homologe single-stranded RNA (ssRNA) op een sequentiespecifieke manier, en het manipuleert een breed scala aan biologische processen, waaronder antivirale verdediging6. Om aangeboren immuunreacties van de gastheer te overwinnen, zijn sommige virussen geëvolueerd om RNA-uitschakeling te compenseren, inclusief de mogelijkheid om te repliceren in intracellulaire compartimenten of te ontsnappen aan het gereorganiseerde signaal. Niettemin is de meest algemene strategie waarmee virussen hun genoom beschermen tegen RNA-uitschakelingsafhankelijk verlies van genfunctie, het coderen van specifieke eiwitten die RNA-uitschakelingonderdrukken 7,8. Verschillende benaderingen zijn vastgesteld om virale suppressors van RNA-uitschakeling (VSRs) te screenen en te karakteriseren, waaronder de co-infiltratie van Agrobacterium tumefaciens culturen, transgene planten die putatieve suppressors, enting en celcultuur9,10,11,12,13.
Elk van deze tests heeft voor- en nadelen, en identificeert VSRs op zijn eigen verschillende manier. Een van de meest voorkomende benaderingen is gebaseerd op de co-infiltratie van individuele A. tmuefaciens culturen herbergen de potentiële virale eiwit en een reporter gen (typisch groene fluorescerende eiwit [GFP]) op de Nicotiana benthamiana 16c planten constitutief uitdrukken GFP onder de controle van de bloemkool mozaïek virus 35S promotor. Bij afwezigheid van een actieve virale uitschakelingsuppressor wordt GFP door de gastheercellen als exogene geïdentificeerd en wordt het binnen 3 dagen na infiltratie het zwijgen opgelegd (dpi). Als het virale eiwit daarentegen onderdrukkingsactiviteit bezit, blijft het expressieniveau van GFP stabiel boven 3−9 dpi9. Deze co-infiltratie test is eenvoudig en snel; het is echter niet zeer stabiel of gevoelig. Niettemin heeft de test tal van VSR's geïdentificeerd met diverse eiwitsequenties en structuren in veel RNA-virussen7,8.
Onlangs zijn verschillende effector eiwitten die de cellulaire RNA-uitschakelingsactiviteit kunnen remmen, gekenmerkt door bacteriële, oomycete- en schimmelplantenpathogenen14,15,16. Deze bevindingen impliceren dat RNA-uitschakelingsonderdrukking een gemeenschappelijke strategie is voor het vergemakkelijken van infectie die door ziekteverwekkers in de meeste koninkrijken wordt gebruikt. In theorie zouden veel, zo niet alle, van de effectoren RNA-uitschakelingsonderdrukkenden (RSS'en) kunnen coderen; tot op heden zijn er echter slechts enkele geïdentificeerd, voornamelijk als gevolg van het tekort aan de betrouwbare en algemene screeningstrategie. Bovendien zijn suppressors van RNA-uitschakeling niet onderzocht in de overgrote meerderheid van de plantenpathogenen17.
In dit rapport presenteren we een geoptimaliseerd en algemeen protocol voor het identificeren van plantenpathogene effectoren die lokale en systemische RNA-uitschakeling kunnen onderdrukken met behulp van de agro-infiltratietest. Het belangrijkste doel van deze studie was om de belangrijkste aspecten van het protocol te benadrukken en de stappen in detail te beschrijven, waardoor een screeningtest werd verstrekt die geschikt is voor bijna alle effectoren van plantenpathogenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle stappen van de procedure moeten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT).
LET OP: Stort alle media die pathogene microben bevatten, evenals de planten en plantenweefsel die in de test worden gebruikt, in de juiste afvalcontainers en autoclave voordat ze worden weggegooid.
1. Bereiding van plasmidconstructies die putavestoffen bevatten
- Selecteer putative gescheiden effectoren die sterk worden uitgedrukt tijdens infectie, zoals bepaald door RNA sequencing (RNA-Seq), en verder door kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) techniek.
- Bepaal het signaal peptide splitsing site van elke effector met behulp van een software tool zoals SignalP18.
- Ontwerp primers en voer PCR uit om de gencodering van de effector van belang te versterken met behulp van high fidelity DNA polymerase. Voer agarose gel elektroforese uit om het PCR-product te controleren en kloon vervolgens de amplicon in Gateway entry vector pQBV3 met behulp van de ligatievrije kloonkit(Tabel met materialen), en vervolgens in de doelexpressievector pEG100 met behulp van de LR-recombinatiereactie19.
- Transformeer 3−5 μL LR-reactiemengsel in 100 μL competente E. coli-cellen (bijvoorbeeld TOP10, DH5α), verdeel de getransformeerde bacteriële cellen op Luria-Bertani (LB) agarmedium aangevuld met 50 μg/mL kanamycine en incubeer bij 37 °C gedurende 16-20 uur.
OPMERKING: Positieve transformatoren kunnen worden geïdentificeerd door kolonie PCR20 en verder geanalyseerd door plasmid miniprep en sequencing. - Introduceer 50−100 ng recombinant plasmiden die effector-eiwit dragen in 100 μL chemisch competente A. tumefaciens cellen (bijvoorbeeld GV3101 of C58C1), meng zachtjes en vries vervolgens in vloeibare stikstof gedurende 1 min. Ontdooi de cellen in een waterbad van 37 °C gedurende 5 min.
- Voeg 500 μL LB-bouillon toe en incubeer bij 30 °C gedurende 4−6 uur met zacht schudden, en breng vervolgens alle agrobacteriëncellen over en spreid ze uit op LB agar medium aangevuld met 50 μg/mL kanamycine en 50 μg/mL rifampicin bij 30 °C gedurende 2 dagen.
OPMERKING: Positieve klonen kunnen worden geverifieerd door kolonie PCR. - Gebruik een enkele getransformeerde kolonie voor agro-infiltratie experimenten, tenzij anders gericht.
OPMERKING: In het huidige onderzoek bevatte geen van de geteste effectorgenen voorspelde introns; elk van de genen werd direct versterkt uit genomic DNA van een Phytophthora sojae isolaat. Een Gateway plant expressie vector zonder tag wordt aanbevolen, maar niet nodig.
2. Bereiding van N. benthamiana 16c planten
- Bereid potgrondmixen bestaande uit (in volume) 50% veenmos, 30% perliet en 20% vermiculiet en autoclave bij 120 °C gedurende 20 min.
- Week autoclaved bodemmengsels met plantaardige meststofoplossing (1 g/L) en verpak ze in kleinere potten (80 mm x 80 mm x 75 mm) opgeslagen in een grotere lade (540 mm x 285 mm x 60 mm).
- Zaai een of twee zaden van N. benthamiana 16c op het bodemoppervlak van elke pot. Bedek de lade met een plastic koepel en laat zaden ontkiemen.
- Plaats de lade onder licht en temperatuurgestuurd groeikamers met een temperatuur van 23−25 °C, 50−60% relatieve vochtigheid en een lange-daagse fotoperiode (14 uur licht/10 uur donker, met verlichting bij 130−150 μE·m-2s-1).
- Neem de plastic koepel af nadat de zaden ontkiemen (3−4 dagen) en laat de zaailingen groeien onder dezelfde omstandigheden die worden gebruikt voor de kiemstap.
- Voeg elke 2−3 dagen een passende hoeveelheid water toe, waarbij de grond vochtig blijft, maar niet wekend; voeg elke 10 dagen kunstmest toe om verdere groei te bevorderen. Handhaven N. benthamiana 16c planten onder normale omstandigheden totdat ze klaar zijn voor gebruik; in dit stadium moet de plant ten minste vijf volledig ontwikkelde echte bladeren en geen zichtbare axillaire of bloemknoppen hebben, en de bladeren moeten een gezonde groene uitstraling hebben).
- Gebruik 3−4 week oude bladeren van N. benthamiana 16c voor lokale RNA-uitschakelingstesten, en jonge N. benthamiana 16c planten (10−14 dagen oud) voor systemische RNA-uitschakelingstesten.
OPMERKING: De groeiomstandigheden en faciliteiten van planten verschillen per laboratoria; kies gezonde, goed ontwikkelde en volledig uitgebreide bladeren voor infiltratie.
3. Voorbereiding van de Agrobacterium cultuur voor infiltratie
- Kies een positieve kolonie uit de LB-plaat en inenten de cellen in glazen buis met 5 mL LB medium aangevuld met 50 μg/mL kanamycine en 50 μg/mL rifampicin. Laat de cellen groeien bij 30 °C met schudden bij 200 tpm gedurende 24−48 uur.
- Breng 100 μL cultuur over in 5 mL LB-medium aangevuld met dezelfde antibiotica, 10 mM 2-(N-morpholino) ethaanzuur (MES; pH 5.6) en 20 μM acetosyringone (AS). Kweek bacteriën bij 30 °C met schudden bij 200 tpm gedurende 16−20 uur.
- Centrifugecellen bij 4.000 x g gedurende 10 min. Giet de supernatant af en breg de pellet opnieuw op in 2 mL van 10 mM MgCl2 buffer.
- Herhaal stap 3.3 om ervoor te zorgen dat antibiotica volledig worden verwijderd.
- Bepaal de dichtheid van de Agrobacterium cultuur door de optische dichtheid op 600 nm (OD600)te meten. Pas aan op een OD600 van 1,5−2.0 met 10 mM MgCl2 buffer.
- Voeg 10 mM MES (pH 5.6) en 150 μM AS toe aan de uiteindelijke suspensieculturen en incubeer de cellen bij RT gedurende ten minste 3 uur zonder te schudden.
LET OP: Laat de laatste schorsingsculturen niet van de ene op de andere dag achter.
4. Co-infiltratie N. benthamiana bladeren
- Meng gelijke volumes van een Agrobacterium cultuur die 35S-GFP bevat met een Agrobacterium cultuur met 35S- komkommer mozaïek virussuppressor 2b (CMV2b), putative effector, of lege vector (EV).
- Voorzichtig en langzaam infiltreren in de gemengde agrobacterium suspensusspen aan de abaxiale zijden van N. benthamiana 16c bladeren met behulp van een 1 mL naaldloze spuit.
- Verwijder de resterende bacteriële suspensie van de bladeren met zachte weefselruitenwissers en omcirkel de marges van de geïnfiltreerd patches met een makerpen.
- Laat de geïnfiltreerd planten in de groeikamer onder dezelfde groeiomstandigheden.
OPMERKING: Om veiligheidsredenen moeten beschermende oogbrillen en een masker worden gedragen tijdens infiltratie. Om kruisbesmetting te voorkomen, moeten handschoenen worden vervangen of gesteriliseerd met ethanol tussen infiltraties. Normaal gesproken is ten minste 1 mL agrobacterium suspensingen per blad nodig voor infiltratie. Voor systemische uitschakeling zijn ten minste twee bladeren nodig voor infiltratie.
5. GFP-beeldvormingsanalyse
- Visueel detecteren GFP fluorescentie in nieuw geteelde bladeren van hele planten 2 weken na de infiltratie (voor systemische RNA silencing) of geïnfiltreerd patches van bladeren 3−4 dpi met behulp van een lange golf ultraviolet (UV) lamp zonder bladeren collectie.
- Fotografeer verzamelde planten en/of vrijstaande bladeren met een digitale camera voorzien van zowel UV- als gele filters.
OPMERKING: Voor tests van lokale uitschakeling onderdrukking, onderzoeken geïnfiltreerd patches van N. benthamiana 16c bladeren, terwijl voor systemische uitschakeling onderdrukking activiteit, onderzoeken nieuw geteelde bladeren. RNA-uitschakelingsonderdrukkingsactiviteit kan variëren tussen individuele effectoren. Daarom, let op de patches of bladeren over een paar dagen vanaf 3 dpi. Gebruik CMV2b en EV als respectievelijk positieve en negatieve controles.
6. Noordelijke vlekanalyse van GFP mRNA-niveaus in geïnfiltreerd blad
- Isolatie van totaal RNA van bladweefsel met behulp van het RNA isolatiereagen(Tabel met materialen)
- Verzamel bladweefsels van geïnfiltreerd N. benthamiana 16c patches op 4−7 dpi, verpulver in vloeibare stikstof naar een fijn poeder en breng het poeder over naar een steriele 2 mL buis.
- Voeg het RNA isolatiereagen (1 mL/100 mg weefsel) onmiddellijk toe aan de bemonsterde buis in een kap, schud krachtig om te homogeniseren en uitbroed bij RT gedurende 5 min.
- Voeg chloroform (200 μL/1 mL RNA isolatiereagen) toe aan elke buis in een kap, schud krachtig gedurende 15 s en en broed bij RT gedurende 5 min. Centrifugeer het homogenaat bij 12.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C.
- Breng de supernatant over in een nieuwe RNase-vrije buis en gooi de pellet weg. Voeg 0,7 volume isopropanol toe aan de supernatant, omkeer meerdere keren zachtjes en incubeer het mengsel bij RT gedurende 10 min.
- Stort de RNA-pellet neer door centrifugeren op 12.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C.
- Gooi de supernatant weg, was de pellet met 70% ethanol en droog de pellet in een kap. Los het RNA op in diethylpyrocarbonaat (DEPC)-behandeld water door gedurende 10-20 min in een waterbad van 65 °C uit te broeden.
- Noordelijke vlekanalyse van GFP mRNA niveau in de geïnfiltreerd bladeren
- Bereid een 1,2% formaldehyde denatureren agarose gel in 1x MOPS lopende buffer.
- Meng RNA 1:1 met RNA laden kleurstof en denature door incubatie op 65 °C gedurende 10 min, onmiddellijk chill de gedenatureerde monsters op ijs voor 1 min.
- Laad de monsters op de gel en elektroforrese bij 100 V gedurende 50 minuten tot het RNA goed gescheiden is.
- Spoel de gel in 20x zout-natriumcitrate (SSC) buffer om formaldehyde te verwijderen en breng de gel over naar nylon membraan door capillaire overdracht in 20x SSC buffer 's nachts. Week het membraan in 2x SSC en bevestig het RNA aan het membraan door het natte membraan bloot te stellen aan UV-kruiskoppeling.
- Voeg de juiste hoeveelheid hybridisatiebuffer (10 mL per 100 cm2 membraan) toe; Materiaaltabel) in een hybridisatiebuis en ageert bij 60 °C in een hybridisatieoven.
- Doe het membraan in de hybridisatiebuis en incubeer gedurende 60 min bij 60 °C. Verdun een 5'DIG-gelabelde DNA-sonde (eindconcentratie, 50 ng/mL) in de hybridisatieoplossing die vooraf verwarmde hybridisatiebuffer bevat.
- Gooi de prehybridisatiebuffer weg en vervang onmiddellijk door vooraf verwarmde hybridisatieoplossing met de DIG-gelabelde sonde. Incubeer de vlek met sonde bij 60 °C 's nachts, met zachte agitatie.
- Na hybridisatie, was het membraan twee keer in buffers van toenemende strengheid bij 60 °C gedurende 20 min elk. Veeg het membraan voorzichtig af om extra wasbuffer te verwijderen en voeg reagentia toe zoals voorgesteld in de chemiluminescenthybridisatie- en detectiekit(Tabel met materialen).
- Detecteer gehybridiseerde signalen door chemiluminescente reactie in combinatie met het beeldvormingssysteem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hierboven beschrijven we de stapsgewijze procedure voor een verbeterde screening test voor het beoordelen van de RSS-activiteit van P. sojae RxLR effectors. In totaal duurt het experiment 5−6 weken. Vervolgens kunnen de RSS'en die door de test worden geïdentificeerd, verder worden gekarakteriseerd in termen van functie en moleculair mechanisme. Als voorbeeld van onze aanpak gebruikten we de P. sojae RxLR effecto Phytophthora suppressor van RNA silencing 1 (PSR1), die wordt uitgescheiden en geleverd in gastheercellen door middel van haustoria tijdens infectie.
Om te bevestigen dat PSR1 RSS-activiteit heeft en dus geschikt is voor deze methode, werd elke getransformeerde agrobacterium stam gemengd met een stam met 35S-GFP en werd geïnfiltreerd in bladeren van N. benthamiana 16c. EV en CMV2b werden gebruikt als respectievelijk negatieve en positieve controles (figuur 1). GFP expressie bereikte het hoogste niveau in bladeren geïnfiltreerd met alle mengsels op 2−3 dpi. Groene fluorescentieintensiteit bleef sterk in patches mede geïnfiltreerd met 35S-GFP plus CMV2b tijdens een periode van 6−9-dagen observatie21. Co-infiltratie van GFP met PSR1 resulteerde ook in sterkere GFP fluorescentie tijdens een periode van 3,5−4,5 dagen van waarnemingen, zoals blijkt uit verhoogde fluorescentie in de geïnfiltreerd patches. Echter, de fluorescentie intensiteit in patches geïnfiltreerd met 35S-GFP en EV verzwakt op 3 dpi. Bij 4−5 dpi was GFP-fluorescentie nauwelijks detecteerbaar (figuur 1).
Noordelijke vlek bleek dat GFP mRNA zich hoger opgehoopt in de bladeren uitdrukken 35S-GFP plus 35S-CMV2b of 35S-GFP plus 35S-PSR1 dan in de bladeren uitdrukken 35S-GFP plus EV (Figuur 2). Zo droegen transcriptieexpressie van PSR1 en CMV2b bij aan de stabilisatie van GFP mRNA, wat resulteerde in verhoogde GFP-fluorescentie.
We gebruikten ook de agro-infiltratie test om de verspreiding van het uitschakelingssignaal in de bladeren van 2 weken oude N. benthamiana 16c zaailingen te evalueren. Hiervoor hebben we meestal 3−4 grotere bladeren geselecteerd voor hele bladeren injectie. Bij 14 dpi vertoonde meer dan 98% van de EV duidelijk geen GFP-signalering in systemische bladeren, terwijl zowel PSR1 als CMV2b de systemische verspreiding van het uitschakelingssignaal efficiënt remden door gfp-fluorescentie in ongeveer 80% van de medegeïnfiltreerd planten waar te nemen, en in de resterende 20% van de geïnfiltreerd planten met slechts enkele rode aders in nieuw verschenen bladeren (figuur 3).
Figuur 1: Phytophthora sojae RxLR effector PSR1 onderdrukt lokale RNA-uitschakeling in Nicotiana benthamiana (N. benthamiana) 16c planten. Volledig ontwikkelde bladeren van 3−4-week-oude N. benthamiana 16c planten (linkerpaneel) werden mede geïnfiltreerd in patches met Agrobacterium mengsels die 35S-GFP en de constructies aangegeven boven elk beeld. GFP fluorescentie van het geïnfiltreerd gebied werd afgebeeld onder natuurlijk licht (middenpaneel) en lange golf UV-licht (rechterpaneel) op 4 dpi. Het experiment werd twee keer herhaald met vergelijkbare resultaten. Rode pijlen vertegenwoordigen geïnfiltreerd bladeren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Accumulatie van GFP mRNA in geïnfiltreerd N. benthamiana 16c bladeren. CK en EV vertegenwoordigen N. benthamiana 16c laat met rust en 16c bladeren co-geïnfiltreerd met 35S-GFP plus EV. Monsters van EV en CMV2b werden gebruikt als een negatieve en positieve controles, respectievelijk. Daarnaast werd rRNA gebruikt als laadregeling. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: P. sojae RxLR effector PSR1 onderdrukt systemische RNA-uitschakeling in N. benthamiana 16c planten. Drie of vier bladeren van 2 weken oude N. benthamiana 16c zaailingen (linkerpaneel) werden tijdelijk mede-geïnfiltreerd door Agrobacterium herbergen 35S-GFP en ofwel EV of vector uitdrukken PSR1 of CMV2b van de 35S promotor. GFP fluorescentie van nieuw gegroeide bladeren werd afgebeeld onder natuurlijk licht (bovenste paneel) en lange golf UV-licht (onderste paneel) op 14 dpi. Dit experiment werd twee maal herhaald met vergelijkbare resultaten. Rode pijlen aangegeven geïnfiltreerd bladeren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNA-uitschakeling is een belangrijk afweermechanisme dat door planten wordt gebruikt om virale, bacteriële, oomycete- en schimmelpathogenen te bestrijden. Op hun beurt hebben deze microben ontwikkeld uitschakeling suppressor eiwitten tegen te gaan antivirale uitschakeling, en deze RSSs interfereren met verschillende stappen van de RNA silencing pad22,23. Verschillende screeningtests zijn ontwikkeld om RSSs te identificeren10.
Hier beschrijven we een verbeterd protocol voor screening effector eiwitten afgescheiden door P. sojae in de gastheer cel op infectie voor hun vermogen om RNA-uitschakeling te onderdrukken in gastheer. Deze gewijzigde test is gebaseerd op een virale co-infiltratie test, maar verschilt op verschillende belangrijke manieren. Ten eerste moeten zowel bacteriën als N.benthamiana 16c planten krachtig en gezond zijn; dit is zeer belangrijk voor stabiele expressie van effectoren van de bacteriën en het gebruik van volledig ontwikkelde N.benthamiana 16c zorgt voor experimentele reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid. We gebruiken vaak slechts twee of drie volledig ontwikkelde bladeren per plant in de vegetatieve groeifase, de oude en nieuw opgedoken bladeren zijn ongeschikt. Ten tweede moet OD600 van de bacteriële cultuur worden aangepast aan een optimale waarde, meestal 0,75−1.0 voor Agrobacterium. Een lagere OD600 (zelfs zo laag als 0,2) kan worden gebruikt om VSRs scherm, maar niet PSRs24. Ten derde moet het ideale tijdspunt voor het onderzoeken van groene fluorescentie worden geoptimaliseerd voor elke effector. In het virus, bladeren mede-geïnjecteerd met culturen die GFP plus vermeende VSRs vertonen een duidelijke toename van groene fluorescentie in het geïnfiltreerd gebied op 3 dpi, en het signaal blijft hoog tot 9 dpi22, maar het werd alleen tentoongesteld op 4 of 5 dpi voor PSRs in onze huidige studie. Daarom is het ook belangrijk om de RNA-uitschakelingsactiviteit verder te bevestigen door de accumulatie van GFP mRNA te kwantificeren. Tot slot is het van essentieel belang om de juiste controle te gebruiken. VSRs zijn niet altijd de ideale positieve controles voor het identificeren van effector eiwitten, omdat deze eiwitten hebben veel sterkere onderdrukkende activiteit dan PSRs. Dit kan leiden tot het niet detecteren van zwakke suppressors van RNA-uitschakeling.
In dit rapport tonen we het gebruik van onze gewijzigde test om te screenen op suppressors van RNA-uitschakeling in Phytophthora en Puccinia graminis pathogenen. Zo is onze methode een nuttig instrument voor het karakteriseren van potentiële effectoren die RSS'en coderen, die de gevoeligheid van de ziekte bevorderen door kleine RNA-accumulatie15,16,17te remmen. Daarom geloven we dat ons protocol breed kan worden gebruikt om effectoren te screenen die worden afgescheiden door plantenpathogenen. Toekomstige werkzaamheden zullen zich richten op het identificeren van meer RSS's in andere ziekteverwekkers, en op het verduidelijken van de rol van RNA-uitschakeling in de verdediging van planten tegen binnenvallende microben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het "Shuguang Program" van Shanghai Education Development Foundation en Shanghai Municipal Education Commission, het National Key Research and Development Program van China National Key R & D Program of China ( 2018YFD0201500), de National Natural Science Foundation of China (nr. 31571696 en 31660510), het Thousand Talents Program for Young Professionals of China, en de Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (18DZ2260500).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
| 2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
| Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Induction of Agrobacterium |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medium |
| Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Electrophoresis |
| Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
| Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medium |
| Bacto Yeast Extraction | BD Biosciences | 212750 | LB medium |
| Camera | Nikon | D5100 | Photography |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chemiluminescent detection module component of dafa kits | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Luminescence detection |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | Antibiotics |
| ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
| DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Hybridization buffer |
| Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Plasmid Extraction |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | TransGen Biotech | EG101-02 | Gel Extraction |
| EDTA disodium salt dihydrate | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
| Electrophoresis Power Supply | LiuYi | DYY6D | Nucleic acid electrophoresis. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Vector digestion |
| Gel Image System | Tanon | Tanon3500 | Image |
| Gentamycin | Amresco | 0304-5G | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibiotics |
| LR Clonase II enzyme | Invitrogen | 11791020 | LR reaction |
| Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
| NORTH2south biotin random prime dna labeling kit | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Biotin labeling |
| PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
| Peat moss | PINDSTRUP | Dark Gold + clay | Plants |
| Peters Water-Soluble Fertilizer | ICE | Peter Professional 20-20-20 | Fertilizer |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzyme |
| Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | Antibiotics |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA Gel Loading Dye |
| Sodium Acetate Hydrate | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
| Sodium Chloride | Amresco | 0241-10KG | LB medium |
| Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation reagent |
| UV lamp | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observation |
| UVP Hybrilinker Oven | Analytik Jena | OV2000 | Northern |
References
- Waterfield, N. R., et al. Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).
- Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes. Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).
- Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. Taking the stage: effectors in the spotlight. Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).
- Lee, A. H., et al. Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).
- Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).
- Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).
- Pumplin, N., Voinnet, O. RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence. Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).
- Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence. Virology. 479-480, 85-103 (2015).
- Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).
- Powers, J. G., et al. A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).
- Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103 (1), 157-167 (2000).
- Deleris, A., et al. Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense. Science. 313 (5783), 68-71 (2006).
- Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
- Navarro, L., et al. A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling. Science. 312 (5772), 436-439 (2006).
- Qiao, Y., et al. Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors. Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).
- Yin, C., et al. A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses. New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).
- Zhang, P., et al. The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity. New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).
- Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).
- Earley, K. W., et al. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).
- Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Current Protocols in Microbiology. 42 (1), Appendix 3D 1-7 (2016).
- Cao, X., et al. Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus. Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).
- Burgyan, J., Havelda, Z. Viral suppressors of RNA silencing. Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).
- Incarbone, M., Dunoyer, P. RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses. Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).
- Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways. Virology. 376 (2), 346-356 (2008).
