Summary
Здесь мы представляем модифицированный метод скрининга, который может быть широко использован для быстрого скрининга РНК глушителей в растительных патогенных микроорганизмов.
Abstract
РНК-глушитель является эволюционно сохраненным, последовательность конкретных механизмой регулировки генов в эукариотах. Несколько возбудителей растений развивались белки с возможностью ингибировать хозяина завода РНК глушитель пути. В отличие от белков вирус-эффектора, только несколько выделяемых белков-эффекторов показали способность подавлять заглушения РНК в бактериальных, омицете и грибковых патогенах, а молекулярные функции большинства эффекторов остаются в значительной степени неизвестными. Здесь мы подробно описываем слегка измененную версию соинфинигционного анализа, который может служить общим методом наблюдения заглушинием РНК и для характеристики белков-эффекторов, выделяемых растительными патогенами. Ключевыми шагами подхода являются выбор здоровых и полностью разработанных листьев, адаптация культуры бактерий к соответствующей оптической плотности (OD) на уровне 600 нм, а также наблюдение за флуоресценцией зеленого флуоресцентного белка (GFP) в оптимальное время на проникнув листья, чтобы избежать опущения эффекторов со слабой активностью подавления. Этот улучшенный протокол будет способствовать быстрому, точному и обширному скринингу супрессоров ЗАглушения РНК и служить отличной отправной точкой для исследования молекулярных функций этих белков.
Introduction
За последние два десятилетия ускорение секвенирования генома микроорганизмов, вызывающих заболевания растений, привело к постоянному увеличению разрыва в знаниях между информацией о последовательности и биологическими функциями закодированных белков1. Среди молекул, выявленных секвенированием проектов являются молекулы-эффекторы, которые подавляют врожденный иммунитет и способствуют колонизации хозяина; эти факторы выделяются разрушительными возбудителями растений, включая бактерии, нематоды и нитевидные микробы. Чтобы ответить на эти угрозы, принимающие растения развили новые рецепторы, которые распознают эти эффекторы, что позволяет восстановить иммунный ответ. Таким образом, эффекторы подвергаются различным селективным давлениям, что приводит к диверсификации репертуаров эффекторов среди патогенных линий2. В последние годы, предполагается, эффекторы из растительных патогенов было показано, нарушить растительный врожденный иммунитет, препятствуя принимающей клеточных процессов в интересах микробов в различных отношениях, в том числе дисрегуляции сигнальных путей, транскрипции, внутриклеточного транспорта, цитоскелет стабильности, везикулы торговли, и РНК улащивания3,4. Однако подавляющее большинство патогенных эффекторов, особенно от нитевидных патогенных микроорганизмов, остаются загадочными.
РНК глушитель является гомология-опосредованного гена инактивации механизма, который сохраняется среди эукариот. Этот процесс срабатывает длинной двухцепочечной РНК (dsRNA) и нацелен на гомологичную одноцепочечную РНК (ssRNA) в последовательности-специфической манере, и он манипулирует широким спектром биологических процессов, включая противовирусную защиту6. Чтобы преодолеть врожденные иммунные реакции хозяина, некоторые вирусы эволюционировали, чтобы компенсировать замалчивание РНК, в том числе способность размножаться внутри внутриклеточных отсеков или вырваться из глушителя реорганизованного сигнала. Тем не менее, наиболее общая стратегия, с помощью которой вирусы защищают свои геномы от РНК глушитель-зависимой потери генной функции является кодирование конкретных белков, которые подавляют РНК глушитель7,8. Несколько механически различных подходов были созданы для скрининга и характеристики вирусных супрессоров РНК глушитель (VSRs), в том числе совместное проникновение агробактерии tumefaciens культур, трансгенных растений, выражающих побудители, прививки и клеточной культуры9,10,11,12,13.
Каждый из этих анализов имеет преимущества и недостатки, и определяет VSRs по-своему. Один из наиболее распространенных подходов основан на совместной инфильтрации отдельных культур A. tmuefaciens укрывательство потенциального вирусного белка и репортер гена (обычно зеленый флуоресцентный белок (GFP) на Nicotiana benthamiana 16c растений, составляющих GFP под контролем мозаичного вируса цветной капусты 35S промоутер. При отсутствии активного вирусного глушителя суитоля, GFP определяется как экзогенный клетками хозяина и заглушается в течение 3 дней после инфильтрации (dpi). В отличие от этого, если вирусный белок обладает активностью подавления, уровень экспрессии GFP остается стабильным за 3'9 dpi9. Это совместное проникновение анализ прост и быстр; однако она не является ни высокой стабильной, ни чувствительной. Тем не менее, анализ выявил многочисленные VSRs с различными последовательностями и структурами белка во многих РНК-вирусах7,8.
В последнее время несколько эффектор белков, которые могут ингибировать клеточной РНК глушитель деятельности были охарактеризованы от бактериальных, oomycete, и грибковых патогенов растений14,15,16. Эти выводы подразумевают, что подавление РНК-заглушения является общей стратегией для облегчения инфекции, которая используется патогенами в большинстве королевств. Теоретически, многие, если не все, из эффекторов могут кодировать РНК глушитель супрессоров (RSSs); однако на сегодняшний день было выявлено лишь несколько из них, главным образом из-за отсутствия надежной и общей стратегии скрининга. Кроме того, супрессоры заглушения РНК не были исследованы в подавляющем большинстве возбудителей растений17.
В этом отчете мы представляем оптимизированный и общий протокол для выявления эффекторов патогенных патогенов растений, которые могут подавлять локальную и системную РНК-глушитель с помощью агроинфильтрационного асссса. Главной целью этого исследования было подчеркнуть ключевые аспекты протокола и подробно описать шаги, тем самым предоставив скрининговый анализ, который подходит почти для всех эффекторов растительных патогенов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы процедуры должны проводиться при комнатной температуре (RT).
ВНИМАНИЕ: Депозит всех средств, содержащих патогенные микробы, а также растений и растительных тканей, используемых в анализе, в соответствующие контейнеры отходов и автоклав перед отказом.
1. Подготовка плазмидных конструкций, содержащих ориентировочные эффекты
- Выберите прогнозные секретированные эффекторы, которые высоко выражены во время инфекции, как это определено секвенированием РНК (РНК-Сек), а далее по количественному реальному времени пЦР (qRT-PCR) метод.
- Определите место расщепления пептида сигнала каждого эффектора с помощью программного средства, такого как SignalP18.
- Дизайн праймеров и выполнять ПЦР для усиления гена кодирования эффектор интереса с использованием высокой точности ДНК полимераза. Выполните агарозный гель электрофорез, чтобы проверить продукт ПЦР, а затем клонировать ампликон в вектор входа шлюза p'BV3 с помощью комплекта клонирования без перевязок(Таблица материалов), а затем в направлении выражения вектора pEG100 с помощью реакции рекомбинации LR19.
- Преобразуйте 3-5 л реакционных смесей LR в 100 л компетентных клеток кишечной палочки (например, TOP10, DH5), распространяйте преобразованные бактериальные клетки на агар-среде Лурия-Бертани (LB), дополненной 50 мкг/мл канамицином, и инкубировать при 37 градусах по Цельсию для 16–20 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Положительные трансформаторы могут быть определены колонии PCR20 и далее проанализированы плазмид минипреп и секвенирования. - Ввести 50-100 нг рекомбинантных плазмидов, несущих протеин эффектора, в 100 л химически компетентных клеток A. tumefaciens (например, GV3101 или C58C1), аккуратно перемешайте, а затем заморозьте в жидком азоте на 1 мин. Оттепель клетки в воде 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут.
- Добавьте 500 кЛ бульона LB и инкубировать при 30 градусах По цельсии в течение 4-6 ч с нежной тряской, а затем переложить и распространить все клетки агробактерий на среде агара LB, дополненной 50 мкг/мл канамицина и 50 мкг/мл рифампицин омчицин омовой в течение 2 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Положительные клоны могут быть проверены колонии PCR. - Используйте одну преобразованную колонию для агроинфильтрационных экспериментов, если иное не направлено.
ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании, ни один из проверенных генов эффектора, содержащихся предсказал интроны; каждый из генов был непосредственно усилен из геномной ДНК изолята Phytophthora sojae. Вектор экспрессии растения Gateway без каких-либо тегов рекомендуется, но не обязательно.
2. Подготовка растений Н. Бентамиана 16c
- Приготовьте смеси почвы для заливки, состоящие (по объему) 50% торфяного мха, 30% перлита и 20% вермикулита, а также автоклав при 120 градусах По Цельсию в течение 20 мин.
- Замочите автоклавированные смеси почвы с раствором растительных удобрений (1 г/л) и упакуйте их в более мелкие горшки (80 мм x 80 мм x 75 мм), хранящиеся в более крупном лотке (540 мм x 285 мм x 60 мм).
- Посеять один или два семена N. benthamiana 16c на поверхность почвы каждого горшка. Накройте лоток пластиковым куполом и дайте семенам прорасти.
- Поместите лоток под светлые и температурно-контролируемые камеры роста с температурой 23-25 градусов по Цельсию, 50-60% относительной влажности, и долгосрочный фотопериод (14 ч свет/10 ч темный, с освещением на 130-150йE'm -2s-1).
- Снимите пластиковый купол после прорастания семян (3–4 дня) и дайте саженцы расти в тех же условиях, которые используются для прорастания шага.
- Добавьте соответствующее количество воды, сохраняя влажную почву, но не замачивая, каждые 2–3 дня; добавлять удобрения каждые 10 дней, чтобы способствовать дальнейшему росту. Поддерживать растения N. benthamiana 16c в нормальных условиях до тех пор, пока они не будут готовы к использованию; на этом этапе растение должно иметь не менее пяти полностью разработанных истинных листьев и отсутствие видимых подмышечных или цветочных почек, а листья должны иметь здоровый зеленый вид).
- Используйте 3-4 недельные листья N. benthamiana 16c для местных анализов замалчивания РНК, а молодые растения N. benthamiana 16c (10–14 дней) для системных анализов замалчивания РНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Условия роста растений и объекты варьируются в разных лабораториях; выбрать здоровые, хорошо развитые и полностью расширенные листья для инфильтрации.
3. Подготовка агробактерии культуры для инфильтрации
- Выберите положительную колонию из пластины LB и привить клетки в стеклянную трубку, содержащую 5 мл среды LB дополнен50 мкг/мл канамицин и 50 мкг/мл рифампицин. Выращивайте клетки при 30 градусах Цельсия при встряхивании при 200 об/мин при 24-48 ч.
- Передача 100 мл культуры в 5 мл среды LB дополнены теми же антибиотиками, 10 мМ 2-(N-морфолино) этанесульфоновой кислоты (MES; pH 5.6) и 20 мкм ацетосирингона (АС). Выращивайте бактерии при 30 градусах Цельсия при встряхивании при 200 об/мин при 16–20 ч.
- Клетки центрифуги при 4000 х г в течение 10 мин. Налейте супернатант и отдохните гранулы в 2 мл 10 мм mgCl2 буфера.
- Повторите шаг 3.3 для обеспечения полного удаления антибиотиков.
- Определить плотность агробактерии культуры путем измерения оптической плотности на 600 нм (OD600). Отрегулируйте к OD600 из 1.5'2.0 с буфером 10 mM MgCl2.
- Добавьте 10 мМ МЧС (pH 5.6) и 150 мкм AS к конечным культурам подвески и инкубировать клетки на RT, по крайней мере 3 ч без тряски.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте окончательные культуры подвески на ночь.
4. Со-инфильтрация Н. Бентамиана листья
- Смешайте равные объемы агробактерии культуры, содержащей 35S-GFP с культурой агробактерий, содержащей 35S- огуречной мозаики вирус супрессор 2b (CMV2b), ориентировоченный эффектор, или пустой вектор (EV).
- Тщательно и медленно проникают смешанные суспензии агробактерий на абсаксиальных сторонах листьев N. benthamiana 16c с использованием шприца без иглы 1 мл.
- Удалите оставшуюся бактериальную подвеску из листьев с помощью стеклоочистителей мягких тканей и обведите поля проникших патчей пером.
- Оставьте проникнутые растения в камеру роста при тех же условиях роста.
ПРИМЕЧАНИЕ: По соображениям безопасности и здоровья, защитные очки для глаз и маска должны носить во время инфильтрации. Для предотвращения перекрестного загрязнения перчатки следует менять или стерилизовать с помощью этанола между инфильтрациями. Обычно для проникновения требуется не менее 1 мл агробактерии на лист. Для системного замалчивания, по крайней мере два листа будут необходимы для проникновения.
5. Анализ изображений GFP
- Визуально обнаружить флуоресценцию GFP в недавно выращенных листьях целых растений 2 недели после инфильтрации (для системного замалчивания РНК) или проникнутые участки листьев 3'4 dpi с помощью длинноволновой ультрафиолетовой (УФ) лампы без сбора листьев.
- Фотография собранных растений и/или отдельных листьев с цифровой камерой, оснащенной как ультрафиолетовыми, так и желтыми фильтрами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализов местных заглушая подавления, исследовать проникли патчи N. benthamiana 16c листья, в то время как для системного замалчивания подавления деятельности, исследовать вновь выращенные листья. Активность подавления РНК может варьироваться в зависимости от отдельных эффекторов. Таким образом, наблюдать патчи или листья в течение нескольких дней, начиная с 3 dpi. Используйте CMV2b и EV в качестве положительного и отрицательного контроля, соответственно.
6. Северный анализ помот gFP мРНК в проникнутых листьях
- Изоляция общей РНК от листовой ткани с помощью реагента изоляции РНК(Таблица материалов)
- Соберите ткани листьев из проникнутых N. benthamiana 16c патчи на 4'7 dpi, распылить в жидком азоте в мелкий порошок, и передать порошок в стерильной 2 мл трубки.
- Добавить РНК изоляционных реагента (1 мл/ 100 мг ткани) сразу же в пробы трубки в капюшоне, встряхнуть энергично гомогената, и инкубировать на RT в течение 5 мин.
- Добавьте хлороформ (200 л/1 мл РНК изоляционный реагент) к каждой трубке в капюшоне, энергично встряхните в течение 15 с, и инкубировать на RT в течение 5 мин. Центрифуге гоменат при 12000 х г в течение 15 мин при 4 градусах по Цельсию.
- Перенесите супернатант в новую трубку без RNase и отбросьте гранулы. Добавьте 0,7 тома изопропанола в супернатант, аккуратно инвертировать несколько раз, и инкубировать смесь на RT в течение 10 минут.
- Осажгите гранулы РНК центрифугированием при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия.
- Откажитесь от супернатанта, промойте гранулы 70% этанола и высушите гранулы в капоте. Растворите РНК в диэтил-пирокарбонат (DEPC) - обработать водой, инкубируя в водяной бане 65 градусов по Цельсию в течение 10-20 минут.
- Северный анализ помот GFP мРНК в проникнутых листьях
- Подготовка 1,2% формальдегида денатурирование агарозный гель в 1x MOPS работает буфер.
- Смешайте РНК 1:1 с РНК-погрузочным красищем и денатурацияю путем инкубации при уровне 65 градусов по Цельсию в течение 10 мин, немедленно охладите денатурированные образцы на льду в течение 1 мин.
- Загрузите образцы на гель и электрофорез на 100 В в течение 50 минут, пока РНК хорошо разделена.
- Промыть гель в 20x солевой цитрат натрия (SSC) буфер для удаления формальдегида и передачи геля на нейлоновую мембрану капиллярной передачи в 20x SSC буфера в одночасье. Замочите мембрану в 2x SSC и исправить РНК в мембрану, подвергая мокрой мембраны для УФ-кросс связи.
- Добавьте соответствующее количество буфера гибридизации (10 мл на 100 см2 мембраны; Таблица материалов) в трубке гибридизации и агитировать при температуре 60 градусов по Цельсию в духовке гибридизации.
- Положите мембрану в трубку гибридизации и инкубировать в течение 60 мин при 60 градусах Цельсия. Разбавить 5'DIG-маркированный зонд ДНК (окончательная концентрация, 50 нг/мл) в раствор гибридизации, содержащий преднагреваемый буфер гибридизации.
- Откажитесь от буфера предгибридизации и немедленно замените раствором гибридизации, содержащим зонд с маркировкой DIG. Инкубировать пятно с зондом при 60 градусах Цельсия на ночь, с нежным возбуждением.
- После гибридизации, мыть мембрану дважды в буферах увеличения строгости на 60 градусов по Цельсию в течение 20 минут каждый. Аккуратно протрите мембрану, чтобы удалить дополнительный буфер для мытья и добавить реагенты, как это предлагается в химилюминесцентной гибридизации и обнаружения комплекта (Таблица материалов).
- Обнаружение гибридизированных сигналов с помощью хемилюминесцентной реакции в сочетании с системой визуализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Выше мы описываем пошаговую процедуру для улучшения скринингового обследования для оценки активности RSS P. sojae RxLR. В общей сложности эксперимент занимает от 5 до 6 недель. Впоследствии, RSSs определены анализ может быть дополнительно характеризуется с точки зрения функции и молекулярного механизма. В качестве примера нашего подхода, мы использовали P. sojae RxLR effecto Phytophthora супрессор РНК глушитель 1 (PSR1), который выделяется и поставляется в клетки-хозяина через haustoria во время инфекции.
Чтобы подтвердить, что PSR1 имеет rsS деятельности и, таким образом, подходит для этого метода, каждый преобразованный штамм агробактерий был смешан с штаммом укрывательство 35S-GFP и проник в листья N. benthamiana 16c. EV и CMV2b использовались в качестве отрицательного и положительного контроля, соответственно(рисунок 1). Выражение GFP достигло наивысшего уровня в листьях, проникших со всеми смесями на 2'3 dpi. Интенсивность зеленой флуоресценции оставалась сильной в патчах, совместно проникших с 35S-GFP плюс CMV2b в течение 6-9-дневного периода наблюдения21. Совместное проникновение GFP с PSR1 также привело к усилению флуоресценции GFP в течение 3,5–4,5-дневного периода наблюдений, о чем свидетельствует повышенная флуоресценция в инфильтрабельных патчах. Тем не менее, интенсивность флуоресценции в патчи проникли с 35S-GFP и EV ослаблены на 3 dpi. На 4'5 dpi, GFP флуоресценция была едва обнаруживаемым(рисунок 1).
Северная подёт показала, что GFP mRNA накапливается выше в листьях, выражающих 35S-GFP плюс 35S-CMV2b или 35S-GFP плюс 35S-PSR1, чем в листьях, выражающих 35S-GFP плюс EV (Рисунок 2). Таким образом, транскрипционное выражение PSR1, а также CMV2b способствовали стабилизации GFP мРНК, что привело к повышенной флуоресценции GFP.
Мы также использовали агроинфильтрационный анализ для оценки распространения глушитель сигнала в листьях 2-недельного Н. benthamiana 16c саженцев. Для этого мы обычно выбирали 3х4 больших листьев для инъекций цельных листьев. На 14 dpi, более 98% EV выставлены очевидные не GFP сигнализации в системных листьев, в то время как PSR1 и CMV2b эффективно препятствует системному распространению глушителя сигнала, наблюдая GFP флуоресценции около 80% совместно проникнунных растений, а в оставшихся 20% проинфильтрированных растений только с несколькими красными жилами появились в недавно появились3).
Рисунок 1: Phytophthora sojae RxLR эффектор PSR1 подавляет местные РНК глушитель в Nicotiana benthamiana (N. benthamiana) 16c растений. Полностью разработанные листья 3-4-недельного N. benthamiana 16c растений (левая панель) были совместно проникли в патчи с агробактерии смесей, несущих 35S-GFP и конструкций, указанных выше каждого изображения. GFP флуоресценции инфильтративаемых области был изображен под естественным светом (средняя панель) и длинноволнового ультрафиолетового света (правая панель) на 4 dpi. Эксперимент повторялся дважды с аналогичными результатами. Красные стрелки представляют проинфильтрированные листья. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Накопление GFP мРНК в проникших N. benthamiana 16c листья. CK и EV представляют N. benthamiana 16c листья в одиночку и 16c листья совместно проникли с 35S-GFP плюс EV. Образцы EV и CMV2b использовались соответственно в качестве отрицательного и положительного контроля. Кроме того, rRNA использовался в качестве погрузочного контроля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: P. sojae RxLR эффектор PSR1 подавляет системное замалчивание РНК в N. benthamiana 16c растений. Три или четыре листа 2-недельного N. benthamiana 16c саженцев (левая панель) были пресловуто совместно проникли Agrobacterium укрывательство 35S-GFP и либо EV или вектор, выражающий PSR1 или CMV2b от 35S промоутер. GFP флуоресценция вновь выращенных листьев была изображена под естественным светом (верхняя панель) и длинноволновым ультрафиолетовым светом (нижняя панель) на 14 dpi. Этот эксперимент повторялся дважды с аналогичными результатами. Красные стрелы указывали на проникнутые листья. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
РНК глушитель является ключевым защитным механизмом, используемым растениями для борьбы с вирусными, бактериальными, омицетами и грибковыми патогенами. В свою очередь, эти микробы эволюционировали глушитель белков супрессора для противодействия противовирусным глушителям, и эти RSS вмешиваться в различные шаги РНК глушитель путь22,23. Несколько скрининговых анализов были разработаны для выявления RSSs10.
Здесь мы описываем улучшенный протокол для скрининга эффектор белков, выделяемых P. sojae в клетку-хозяина при инфекции за их способность подавлять РНК глушитель в хосте. Этот модифицированный ассеий основан на вирусном соинфильтрационном ажиотаже, но отличается несколькими важными способами. Во-первых, как бактерии, так и растения N.benthamiana 16c должны быть энергичными и здоровыми; это очень важно для стабильного выражения эффекторов от бактерий и использование полностью разработанного N.benthamiana 16c обеспечивает экспериментальную воспроизводимость и надежность. Мы часто используем только два или три полностью разработанных листьев на растение на стадии вегетативного роста, старые и вновь возникшие листья непригодны. Во-вторых, OD600 бактериальной культуры должен быть скорректирован с оптимальным значением, как правило, 0,75-1,0 для агробактерий. Более низкий OD600 (даже как низко как 0.2) можно использовать для того чтобы экранировать VSRs но не PSRs24. В-третьих, идеальный момент времени для исследования зеленой флуоресценции должен быть оптимизирован для каждого эффектора. В вирус, листья совместно вводят с культурами, содержащими GFP плюс по-прежнему VSRs экспонат заметное увеличение зеленой флуоресценции в проникнутой области на 3 dpi, и сигнал остается высоким до 9 dpi22, но он был выставлен только на 4 или 5 dpi для PSRs в нашем настоящем исследовании. Поэтому важно также дополнительно подтвердить активность ЗАглушения РНК путем количественной оценки накопления GFP mRNA. Наконец, необходимо использовать надлежащий контроль. VSRs не всегда являются идеальным положительным элементом контроля для выявления белков-эффекторов, потому что эти белки имеют гораздо более сильную подавляющую активность, чем ПСР. Это может привести к неспособности обнаружить слабые супрессоры заглушения РНК.
В этом отчете мы демонстрируем использование нашего модифицированного исследования для проверки супрессоров РНК-глушителей у патогенов Phytophthora и Puccinia graminis. Таким образом, наш метод представляет собой полезный инструмент для характеристики потенциальных эффекторов, которые кодируют RSS, которые способствуют восприимчивости к болезни путем ингибирования малого накопления РНК15,16,17. Поэтому мы считаем, что наш протокол может быть широко использован для проверки эффектов, выделяемых возбудителями растений. Будущая работа будет сосредоточена на выявлении большего количества RSS в других патогенных микроорганизмов, а также на выяснение роли РНК глушить в защите растений от вторжения микробов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от "Шугуан программы" Шанхайского фонда развития образования и Шанхайской комиссии муниципального образования, Национальной ключевой программы исследований и разработок Китайской национальной ключевой программы НИОКР Китая ( 2018YFD0201500), Национальный фонд естественных наук Китая (No 31571696 и 31660510), Программа «Тысячи талантов» для молодых специалистов Китая и Комиссия по науке и технике муниципалитета Шанхая (18D-2260500).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
| 2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
| Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Induction of Agrobacterium |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medium |
| Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Electrophoresis |
| Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
| Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medium |
| Bacto Yeast Extraction | BD Biosciences | 212750 | LB medium |
| Camera | Nikon | D5100 | Photography |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chemiluminescent detection module component of dafa kits | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Luminescence detection |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | Antibiotics |
| ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
| DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Hybridization buffer |
| Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Plasmid Extraction |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | TransGen Biotech | EG101-02 | Gel Extraction |
| EDTA disodium salt dihydrate | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
| Electrophoresis Power Supply | LiuYi | DYY6D | Nucleic acid electrophoresis. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Vector digestion |
| Gel Image System | Tanon | Tanon3500 | Image |
| Gentamycin | Amresco | 0304-5G | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibiotics |
| LR Clonase II enzyme | Invitrogen | 11791020 | LR reaction |
| Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
| NORTH2south biotin random prime dna labeling kit | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Biotin labeling |
| PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
| Peat moss | PINDSTRUP | Dark Gold + clay | Plants |
| Peters Water-Soluble Fertilizer | ICE | Peter Professional 20-20-20 | Fertilizer |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzyme |
| Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | Antibiotics |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA Gel Loading Dye |
| Sodium Acetate Hydrate | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
| Sodium Chloride | Amresco | 0241-10KG | LB medium |
| Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation reagent |
| UV lamp | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observation |
| UVP Hybrilinker Oven | Analytik Jena | OV2000 | Northern |
References
- Waterfield, N. R., et al. Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).
- Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes. Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).
- Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. Taking the stage: effectors in the spotlight. Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).
- Lee, A. H., et al. Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).
- Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).
- Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).
- Pumplin, N., Voinnet, O. RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence. Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).
- Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence. Virology. 479-480, 85-103 (2015).
- Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).
- Powers, J. G., et al. A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).
- Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103 (1), 157-167 (2000).
- Deleris, A., et al. Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense. Science. 313 (5783), 68-71 (2006).
- Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
- Navarro, L., et al. A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling. Science. 312 (5772), 436-439 (2006).
- Qiao, Y., et al. Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors. Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).
- Yin, C., et al. A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses. New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).
- Zhang, P., et al. The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity. New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).
- Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).
- Earley, K. W., et al. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).
- Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Current Protocols in Microbiology. 42 (1), Appendix 3D 1-7 (2016).
- Cao, X., et al. Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus. Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).
- Burgyan, J., Havelda, Z. Viral suppressors of RNA silencing. Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).
- Incarbone, M., Dunoyer, P. RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses. Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).
- Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways. Virology. 376 (2), 346-356 (2008).
