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Biochemistry

KRAS4b recombinante totalmente processado: Isolando e caracterizando a proteína farnesylated e metilada

doi: 10.3791/60703 Published: January 16, 2020

Summary

A prenimação é uma modificação importante nas proteínas de ligação da membrana periférica. As células de insetos podem ser manipuladas para produzir KRAS4b farnesilado e carboximetilado em quantidades que permitem medições biofísicas de interações proteína-proteína e proteína-lipídios

Abstract

A prenimação proteica é uma modificação fundamental que é responsável pela segmentação de proteínas para membranas intracelulares. Kras4b, que é mutado em 22% dos cânceres humanos, é processado por farnização e carboximetilação devido à presença de um motivo de caixa 'CAAX' no C-terminus. Um sistema de baculovírus projetado foi usado para expressar KRAS4b farnesilado e carboximetilado em células de insetos e foi descrito anteriormente. Aqui, descrevemos a purificação detalhada e prática e caracterização bioquímica da proteína. Especificamente, a afinidade e a cromatografia de troca de íons foram usadas para purificar a proteína à homogeneidade. A espectrometria de massa intacta e nativa foi utilizada para validar a modificação correta do KRAS4b e para verificar a ligação do nucleotídeo. Finalmente, a associação da membrana de KRAS4b farnesylated e carboxymethylated aos lipossomos foi medida usando a espectroscopia da ressonância do plasmon de superfície.

Introduction

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As modificações pós-translacionais desempenham um papel fundamental na definição da atividade funcional das proteínas. Modificações como fosforilação e glicosilação estão bem estabelecidas. As modificações lipídicas são menos bem caracterizadas, no entanto. Estima-se que até 0,5% de todas as proteínas celulares podem ser pré-nylated1. Prenimação é a transferência de um farnesyl de 15 carbonoou uma cadeia lipídica geranylgeranyl de 20 carbono para uma proteína aceitante contendo o motivo CAAX2. Proteínas pré-lafoladas têm sido implicadas na progressão de várias doenças humanas, incluindo o envelhecimento prematuro3,Alzheimer4,disfunção cardíaca5, choroideremia6, e câncer7. Os pequenos GTPases, HRAS, NRAS e KRAS1,laminados nucleares e as kinetochores CENP-E e F são proteínas farnesilado a condição basal. Outros pequenos GTPases, ou seja, RhoA, RhoC, Rac1, cdc-42 e RRAS são geranylgeranylated8, enquanto RhoB pode ser farnesylated ou geranylgeranylated9.

O pequeno GTPase KRAS4b funciona como um interruptor molecular, essencialmente transmitindo fator de crescimento extracelular sinalizando para vias intracelulares de transdução de sinal que estimulam o crescimento e proliferação de células, através de múltiplas interações proteína-proteína. Existem dois aspectos-chave da bioquímica KRAS4b que são essenciais para a sua atividade. Primeiro, os ciclos de proteína entre um PIB inativo e um estado vinculado ao GTP ativo pelo qual ele se envolve ativamente com efíores. Em segundo lugar, uma região de poliliina terminal C e uma cisteína farnesilado e carboximetilada direcionam a proteína para a membrana plasmática, permitindo o recrutamento e a ativação de emigrantes a jusante. MutantKRAS4b é um motorista oncogênico no câncer pancreático, colorretal e pulmonar10,e, como tal, a intervenção terapêutica teria um enorme benefício clínico. A produção de proteína recombinante autenticamente modificada que é farnesilado e carboximetilado permitiria triagem bioquímica usando KRAS4b em combinação com substitutos de membrana, como lipossomas ou nanodiscos lipídicos11,12.

Farnesyl transferase (FNT) catalisa a adição de pirofosfato farnério ao cisteína c-terminal no motivo CAAX em KRAS4b. Após a pré-nimação, a proteína é traficada para o retículo endoplasmático (ER), onde a enzima de conversão ras (RCE1) divide os três resíduos do terminal C. O passo final no processamento é a metilação do novo resíduo de farnesylcisteína c-terminal pela proteína da membrana er, isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase (ICMT). A expressão de KRAS4b recombinante em E. coli resulta na produção de uma proteína não modificada. Tentativas anteriores de produzir KRAS4b processados foram limitadas devido a rendimentos insuficientes para experimentos estruturais ou de rastreamento de drogas ou não conseguiram recapitular a proteína madura nativa de corpo inteiro13,14. O protocolo apresentado aqui utiliza um sistema de expressão de células de insetos à base de baculovírus projetado e método de purificação que gera KRAS4b altamente purificado e totalmente processado a rendimentos de 5 mg/L da cultura celular.

A caracterização cuidadosa da proteína é essencial validar a qualidade das proteínas recombinantes antes de embarcar em biologia estrutural ou estudos de triagem de medicamentos. Dois parâmetros-chave do KRAS4b totalmente processado são a validação da modificação prenimita correta e a disponibilidade do C-terminus (FMe) farnesylatelado e carboximetilado para interação com substitutos de membrana ou lipídios. A espectrometria de massa de ionização de eletrospray (ESI-MS) do KRAS4b-FMe foi usada para medir o peso molecular e confirmar a presença das modificações de farnése e carboximetil. A espectrometria de massa nativa, onde as amostras são pulverizadas com solventes não desativação, foi usada para demonstrar que kras4b-fme também estava vinculado ao seu cofator do PIB. Finalmente, a espectroscopia de ressonância plasmon superficial foi usada para medir a ligação direta do KRAS4b-FMe com lipossomas imobilizados.

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Protocol

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1. Purificação de proteínas

  1. Prepare buffers A-H, como visto na Tabela 1.
Solução tampão Agente tampão (todos os 20 mM) pH P H NaCl (mM) NaCl (mM) imidazol (mM) imidazol (mM) MgCl 2 MgCl2 TCEP TCEP
Um HEPES HEPES 7.3 300 - 5 1
B HEPES HEPES 7.3 300 35 5 1
C HEPES HEPES 7.3 300 500 5 1
D MES MES 6.0 200 - 5 1
E E MES MES 6.0 - - 5 1
F MES MES 6.0 100 - 5 1
G MES MES 6.0 1000 - 5 1
H HEPES HEPES 7.3 300 - 1 1
  1. Prepare os materiais de purificação (ver Tabela de Materiais):coquetel inibidor de protease sem EDTA ou outros quelantes; coluna de cromatografia de afinidade metálica imobilizada (IMAC); coluna de cromatografia de troca de cation (CEX); filtro de seringa de 0,45 μm; 2 M imidazol (pH = 7,5); ultracentrífuga capaz de 100.000 x g; centrífuga de bancada de alta velocidade capaz de 4.000 x g; Unidades de filtro centrífuga (10 KDa NMWL); espectrômetro capaz de ler a 280 nm; His6-tobacco etch virus (TEV) protease; e instrumentação cromatográfica capaz de misturar duas soluções tampão, aplicando soluções para colunas, criando eluções de gradiente da coluna e coletando frações de colunas.
  2. Descongelar células de ~ 2 L da cultura de células de insetos anteriormente armazenados a -80 °C ou usar células recém-colhidas. Veja Gillette et al. 201915 para obter detalhes sobre os protocolos de expressão e linha de insetos Tni.FNL. Suspenda cuidadosamente as células com 200 mL de Buffer A com inibidor de protease 1:200 v/v adicionado sem introduzir ar ou criar espuma.
    NOTA: Passo 1.3 e etapas subsequentes (exceto como observado) devem ser realizadas à temperatura ambiente (~ 22 °C). É importante que a amostra seja homogênea para permitir lise completa na próxima etapa.
  3. Pelota de célulade lyse em um microfluidizer a 7.000 psi por dois passes ou em um sistema de lyse equivalente. Métodos alternativos de lyse não foram explorados.
  4. Esclarecer a lysates da pilha do inseto é problemático devido à presença dos compostos que obstruem filtros. Assim, a ultracentrífugação (100.000 x g por 30 min a 4 °C) é muito importante. Um resíduo lipídico branco na superfície do supernatant deve ser evitado e pode ser removido ou reduzido usando cotonetes de algodão. Filtre o supernatant decantado através de um filtro de 0,45 μm PES. Use a amostra clarificada imediatamente ou guarde a -80 °C.
    NOTA: Os resíduos bloqueiam filtros rapidamente e muitos filtros podem ser necessários. A falha reduzir a quantidade deste material conduzirá à pressão traseira elevada da coluna em etapas subseqüentes.
  5. Determinar o volume do lysate clarificado e ajustar a amostra para 35 mM imidazole pela adição de 2 M imidazole. Carregue a amostra em 3 mL/min em uma coluna IMAC de 20 mL (coluna HisPrep FF 16/10) pré-equilibrada no Buffer B para três volumes de coluna (Currículos).
  6. Embora a proteína alvo seja tipicamente quantitativamente adsorda para a coluna, é melhor coletar o fluxo de coluna para análise posterior. Lave a coluna até que o Abs280 atinja uma linha de base constante (<100 milliabsorbance units [mAU]) com Buffer B em 3 mL/min para 20 mL (1 CV), em seguida, para ~ 3 CV em 4 mL/min para o restante da etapa de lavagem. Normalmente, 60-80 mL de Buffer B é necessário para alcançar a absorção de linha de base.
  7. Elute a proteína com um gradiente de 400 mL (20 CV) do Buffer B ao Buffer C ao coletar 8 frações do mL. Normalmente, as proteelas alvo de proteína na primeira metade do gradiente (Figura 1A;nem todas as frações posteriores são mostradas).
  8. Analise frações de proteína usando manchas SDS-PAGE/Coomassie. As frações máximas da associação e diállita a associação durante a noite de encontro a 2 L do tampão D em 4 °C.
    NOTA: O baixo pH é fundamental para garantir a ligação à proteína na próxima etapa. No entanto, a mudança de pH durante esta diálise ocorre lentamente, e este é um passo conveniente para a incubação durante a noite. Não foram investigadas estratégias alternativas de troca de buffer (por exemplo, maior concentração tampão para acelerar a alteração do pH). A proteína começará a precipitar lentamente ao longo do tempo em menor pH e menores concentrações de sal e uma pequena quantidade de precipitação é normal durante esta etapa. Devido a isso, evitamos trocar o buffer para o NaCl de 100 mM necessário para a ligação para a próxima coluna durante a diálise. Em vez disso, uma concentração de NaCl de 200 mM é usada para diálise e a proteína é diluída a 100 mM (veja abaixo) imediatamente antes da aplicação da coluna. Nós não investigamos se esta precipitação é específica para KRAS4b, mas a proteína que precipitar foi confirmada como KRAS4b-FMe. Por esta razão, sugerimos o uso da maior concentração de NaCl no buffer de diálise para qualquer proteína de interesse como precaução até que a estabilidade da proteína alvo no buffer de ligação possa ser determinada.
  9. Retire a amostra da diálise e centrífuga a 4.000 x g por 10 min para remover qualquer precipitação. A amostra final dinada e clarificada neste momento ainda é muitas vezes nebulosa, mas pode ser aplicada sem processamento adicional na coluna CEX subsequente.
  10. Prepare uma coluna de troca de cation de 20 mL (ver Tabela de Materiais)lavando com três currículos de Buffer G, em seguida, com três currículos de Buffer F.
    NOTA: Embora não tenhamos avaliado meticulosamente outras resinas, vários colegas encontraram má resolução com resinas que não seja sp sepharose resina de alto desempenho.
  11. Diluir 20 mL da amostra dilacerada a uma concentração final de NaCl de 100 mM adicionando 20 mL de Buffer E e aplique a amostra diluída na coluna de troca de cation.
  12. Continue a carregar a coluna adicionando amostras recém-diluídas preparadas como descrito acima para o tubo de carga como a diluição anterior está se aproximando do final da carga.
    NOTA: Diluir toda a amostra de uma só vez a 100 mM NaCl resultou em perda significativa de proteína alvo devido à precipitação.
  13. Lave a coluna para a linha de base Abs280 com Buffer F. Isso normalmente requer 3 CV. A proteína é eluted da coluna durante um gradiente de 400 mL (20 CV) de Buffer F para 65% Buffer G, coletado em frações de 6 mL(Figura 1B).
  14. Continue lavando a coluna para um CV adicional de 1,5 (65% Buffer G) uma vez que o gradiente seja concluído. Escolha frações positivas com base na análise de manchas azuis SDS-PAGE/Coomassie e inspeção do traço UV do cromatograma.
    NOTA: O traço UV normalmente contém cinco picos. Começando em concentrações mais baixas do sal, o pico inicial é geralmente unprocessed e/ou proteína proteolizada. O segundo e terceiro picos são uma mistura de duas formas de proteína processada: o segundo pico é principalmente um intermediário farnesylated (FARN), enquanto o terceiro é principalmente a proteína de interesse FMe totalmente processada. Os picos quatro e cinco representam proteínas de fusão His6-MBP-KRAS4b (toda a proteína está neste formato neste momento, como não ocorreu nenhuma digestão tev). Estes não são N-acetillated no N-terminus e são farnesylated (pico quatro) e farnesylated e carboxymethylated (pico cinco) no C-terminus. Como pico dois e pico quatro irá produzir proteínas idênticas após a remoção de etiquetas (ou seja, KRAS4b-FARN) estes podem ser agrupados nesta fase, se desejar. Da mesma forma, o pico três e o pico cinco podem ser combinados para produzir um único lote de KRAS4b-FMe (Figura 1B, Figura 2). No entanto, é aconselhável que este agrupamento só seja feito quando a natureza da proteína nos picos separados tiver sido confirmada.
  15. Dime a proteína agrupada no passo 1.15 com protease His6-TEV (~200 μg de protease/mL de amostra.
    NOTA: Nós fazemos His6-TEV protease usando o plasmídeo e protocolos disponíveis a partir de Addgene(https://www.addgene.org/92414). Diálise o tev digerir contra buffer a (10 kDa MWCO diálise tubulação com um mínimo de 40 mL de buffer a por mL de amostra) para 2 h à temperatura ambiente e, em seguida, durante a noite em 4 °C.
  16. Após a digestão e diálise, carregue a proteína diretamente para uma coluna IMAC de 20 mL equilibrada com Buffer A a 3 mL/min.
    NOTA: Coletar 7 frações mL durante toda esta cromatografia, porque a proteína alvo tem uma baixa afinidade com a coluna, mas pode não ser totalmente ligada à resina. Lave a coluna a 3 mL/min com buffer A para um total de 3 currículos ou até que uma absorção de linha de base seja alcançada.
  17. A proteína alvo é eluted com um gradiente cv 5 de Buffer C de 0%-10%, coletando 7 frações mL. Como precaução, proteínas vinculadas adicionais podem ser eluted com 100% Buffer C. Frações positivas são identificadas após análise por SDS-PAGE(Figura 1C). Normalmente, a proteína alvo elutes em uma baixa concentração de imidazol (ou seja, no gradiente Buffer C de 0%-10%, mas às vezes elutes no fluxo através ou lavagem de coluna.
  18. Diálise o pool final contra Buffer H. Determinar a concentração de proteína por espectrofotometria em 280 nm.
    NOTA: Certifique-se de explicar a presença do nucleotídeo ao determinar o coeficiente de extinção para usar para este cálculo.
  19. A proteína pode ser concentrada a ~2-5 mg/mL usando uma unidade centrífuga do filtro (10 K NMWL) sem perda significativa da proteína. Filtro com um filtro de seringa de 0,22 μM. Medir a absorção da solução em A280 para calcular a concentração final de proteínas(Figura 1D). Snap congela alíquotas em nitrogênio líquido e armazena amostras congeladas a -80 °C.
    NOTA: A proteína purificada está vinculada ao PIB. KRAS4b-FMe pode ser trocado em GppNHp usando protocolos previamente publicados16.

2. Preparação da amostra para a análise de massa intata e a análise de massa nativa

  1. Preparação da amostra para a análise de massa intata
    1. Descongele a amostra de proteína no gelo antes da análise. Para análise de massa intacta, diluir a proteína para 0,1 mg/mL em 20 mM amônio bicarbonato (pH = ~ 8,4). Para análise de massa nativa, diluir a proteína a uma concentração de 0,1 mg/mL em 50 mM acetato de amônio (pH = ~ 7,5). Vortex cada amostra para 5-10 s, em seguida, centrífuga em 12.500 x g para 1 min para pelota qualquer material sólido na solução. Retire 10-20 μL de cada supernatant e transfira para um frasco de autosampler de vidro. Tampa cada frasco firmemente para impedir a contaminação ou a evaporação.
      NOTA: Para análise de massa intacta ou análise de massa nativa, a amostra pode ser dessaled antes da análise usando um filtro de membrana de celulose 10 kDa MWCO para buffer-troca no buffer de diluição final.
  2. Preparação da espectroscopia de massa estendida (EMR) para análise de massa
    NOTA: Antes de executar qualquer análise sobre o espectrômetro de massa, certifique-se de que ele foi recentemente calibrado. Além disso, use sempre luvas e outros equipamentos de proteção individual, conforme necessário, para evitar quaisquer produtos químicos nocivos e para evitar contaminar amostras e solventes. A calibração é feita usando uma solução de calibração obtida comercialmente e uma solução de iodeto de césio 2 mg/mL preparada internamente.
    1. Abra o software de análise e carregue o arquivo do método de instrumento apropriado. Para análise de massa intacta das proteínas KRAS4b, os parâmetros iniciais adequados são os seguintes: modo positivo de detecção; três microsscans, resolução = 70.000; Meta aGC = 3e6; tempo máximo de integração = 200 ms; e uma faixa de digitalização = 70-1.800 relação massa-carga (m/z). Para análise de massa nativa das proteínas KRAS4b, parâmetros iniciais adequados são os seguintes: modo positivo de detecção; 10 microsscanos, resolução = 17.500; dissociação induzida por colisão na fonte (CID) = 20 eV; Meta aGC = 3e6; energia da colisão (CE) = 20; tempo máximo de integração = 200 ms; e uma faixa de digitalização = 500-10.000 m/z.
  3. Preparação de solventes cromatográficos e coluna
    1. Prepare os solventes necessários para a análise de massa intacta. Solvente A é água com 0,1% de ácido fórmico. Solvente B é 80% acetônio e 0,1% ácido fórmico na água.
    2. Prepare os solventes necessários para a análise de massa nativa. Solvente A é de 0,1 M acetato de amônio em água e solvente B é água.
    3. Depois que os solventes apropriados são preparados, remoção do sistema de modo que a tubulação esteja enchida com os solventes apropriados e todas as bolhas de ar sejam removidas das linhas.
    4. Instale a coluna apropriada (uma coluna de fase invertida para análise de massa intacta e uma coluna de exclusão de tamanho para análise de massa nativa). Para análise de massa intacta, a taxa de fluxo é de 0,5 mL/min, e a temperatura da coluna (usando um aquecedor de coluna) é de 50 °C. Equilibre a coluna por 15-20 min. Para análise de massa nativa, a taxa de fluxo é de 0,25 mL/min.
      NOTA: Sempre monitore a coluna de pressão para trás para garantir que ela não se elevou acima do limite superior, o que poderia indicar uma linha entupida ou que a matriz da coluna está comprometida. Substitua a coluna, se necessário.
  4. Análise de amostras
    1. Coloque a amostra de proteína preparada no frasco de autosampler de vidro no rack de frasco apropriado no autosampler de sistemas LC. Crie uma lista de amostras no programa de software com o método de instrumento adequado para a análise desejada. Depois que a lista de amostras estiver concluída, clique no botão Play para iniciar a análise.
    2. Injete 1-2 μL de amostra por análise, com água em branco antes e depois de cada amostra, para garantir que não haja transporte.
      NOTA: A análise de massa intacta é muito diferente da análise de massa nativa e requer configurações de método de instrumentomuito diferentes. Isso ocorre porque com a análise de massa intacta, a proteína é "relaxada" na presença de um solvente orgânico e, portanto, é capaz de aceitar mais encargos. É mais fácil desconvolute e resolver a distribuição isotópica dos estados da carga. A análise de massa nativa fornece uma distribuição de carga estreita dos íons proteicos, e com base na proteína, requer diferentes configurações de energia de tensão e colisão.
  5. Análise de dados e desconvolução de proteína
    1. Exportar o espectro da amostra para o software onde ele pode ser transformado para o espectro descomplicado que irá exibir a massa intacta (ou massa nativa) da proteína. A massa intacta terá uma distribuição de pico isotópico devido à alta abundância de picos espectrais carregados. A massa nativa terá tipicamente muito poucos picos devido à baixa abundância dos picos espectrais carregados(figura 3D).
    2. Expandir a escala da relação da massa-à-carga (m/z) do d máximo para confirmar que a massa medida é consistente com a massa prevista. Ocasionalmente, devido à adição de cargas à proteína, pode haver uma ligeira variação entre o peso molecular esperado (MW) e o MW observado. Além disso, como acontece com muitas análises de espectrometria de massa, adutores como o sódio podem contribuir para o aparecimento de picos adicionais nos dados, mesmo com amostras cuidadosamente dessalgadas. Picos abundantes mais baixos com um m/z que é menor do que o esperado às vezes são observados. Isto é provavelmente devido a uma perda neutra, que é a perda de um grupo funcional devido ao processo de ionização.
      NOTA: Como esperado, haverá diferenças entre a massa intacta e os picos de massa nativa. A exposição de massa intata mostrará o MW esperado da proteína. Ele não terá o MW extra do nucleotídeo anexado ou outras modificações. No entanto, o pico de massa nativa mostrará a proteína com qualquer nucleotídeo adicionado.

3. Validação de KRAS4b-FMe ligando-se a lipossomas

  1. Preparação de lipossomos de membrana
    1. Prepare um buffer composto por 20 mM HEPES (pH = 7,3), 150 mM NaCl e 1 mM TCEP.
    2. Os materiais de preparação para lipossoma incluem 25 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) e 10 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serina (POPS) estoques em clorofórmio; um extruder lipídico conjunto com um suporte e bloco de aquecimento; gás argônio e nitrogênio líquido; um banho ultrassônico; frascos de fio de parafuso de vidro com forros de espuma PTFE; e um leitor de placa capaz de detecção de dispersão de luz dinâmica.
    3. Descongelar estoques lipofóridos em clorofórmio à temperatura ambiente por 30 min. Prepare-se 1 mL de 5 mM 70:30 POPC: lipossomos POPS por alíquota de 106 μL de 25 mM POPC (estoque) e 118 μL de 10 mM POPS (estoque) em um frasco de vidro.
      NOTA: Não avulte lipídios com uma ponta de plástico, porque o clorofórmio poderia dissolver certas pontas de plástico.
    4. Lipídios secos um fluxo constante de gás argônio. Gire lentamente o frasco de vidro ao aplicar o gás do argônio para dar forma a uma camada fina de película seca.
    5. Coloque amostras um lyofilizer vácuo durante a noite para remover o excesso de clorofórmio.
    6. Reconstitua os lipídios adicionando 1 mL de buffer ao filme seco e vórtice as misturas por 5 min. Hidrate as misturas lipídicas balançando por 1 h a 25 °C.
      NOTA: A amostra será muito turva após a adição do buffer para a camada de filme seco de lipídios.
    7. Realize cinco ciclos de congelamento/degelo alternando a colocação do frasco de amostra entre uma água gelada (4 °C ou inferior) e um banho de água morna (25 °C ou superior).
    8. Coloque o frasco de amostra no banho ultrassônico e sonore a amostra por cerca de 0,5 h ou até que a amostra se torne semitransparente.
    9. Extrudir as amostras usando o conjunto de extruder lipídico. Monte o kit de extrusão, como mostrado nas instruções do fabricante. Extrude as amostras usando 0,1 μm de papel filtro. Carregue as amostras em uma seringa de vidro e anexe-as a uma extremidade do aparelho de extrusão. Adicione uma seringa vazia do outro lado do aparelho de extrusão. Empurre para frente e para trás 10-20x até que suas amostras se tornem totalmente transparentes.
    10. Gire as amostras finais para 30 min em 20.000 x g para remover quaisquer grandes agregados.
    11. Use dispersão de luz dinâmica (DLS) para determinar o tamanho e a homogeneidade dos lipossomos (opcional). Coloque 30 μL dos lipossomas em um leitor de placa de 384 poços. Gire a placa a 1.000 x g por 30 min. Coloque a placa em um leitor de placa e colete 10 medições de dispersão de luz.
  2. Caracterizando KRAS4b-FMe que liga aos lipossomos através da ressonância do plasmon de superfície (SPR)
    1. Montar os materiais necessários: um instrumento SPR; chip de sensor L1; Tubos de frasco de 7 x 14 mm; e CHAPS.
    2. Prepare um buffer contendo 20 mM HEPES (pH = 7,3), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP. Prepare uma série de diluição 2:1 de KRAS4b-FMe de 60 μM-0,06 μM em um volume total de 200 μL (10 titrations total). Transfira as amostras diluídas finais em tubos de frasco (ver Tabela de Materiais),coloque os tubos de frasco em um rack e insira as amostras no instrumento SPR.
    3. Insira o chip de sensor L1 no instrumento SPR. Anexar o buffer e prime o sistema com buffer por 7 min.
    4. Configure um método automatizado da seguinte forma:
      1. Definir a temperatura do instrumento para 25 °C.
      2. Ative o chip de sensor L1 enxaguando-o com duas injeções de 1 minuto de 20 mM CHAPS dissolvidas em água a 30 μL/min taxa de fluxo.
      3. Realize ciclos de start-up de dez injeções de 1 minuto de tampão de corrida para hidratar a superfície do chip.
        1. Deposite os lipossomos no chip de sensor L1 injetando os lipossomas na célula de fluxo (FC)-2 do chip L1 com 2 injeções de min a 5 μL/min. Aponte para um nível de captura de pelo menos ~3.000 unidades de resposta (RUs).
          NOTA: Aumentar o tempo de injeção até atingir o nível de captura adequado.
      4. Injete três ciclos de reserva sobre fc-1 e FC-2 com injeções de 1 min a 30 μL/min.
        1. Injete as várias titrations kras4b-FMe das mais baixas à mais alta série de concentração. Injete as proteínas usando injeções de 1 min para a fase de associação e 2 injeções de min para a fase de dissociação em 30 μL/min taxa de fluxo sobre ambos os FCs.
        2. Regenerar o chip de sensor L1 enxaguando-o com duas injeções de 1 minuto de 20 mM CHAPS a 30 μL/min.
    5. Ajuste os dados usando o software de avaliação SPR usando um modelo de ligação de um único site para obter afinidades de ligação aparentes (veja a seção discussão para uma explicação da montagem de dados).

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Representative Results

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Uma das maiores variáveis do protocolo é a quantidade de proteína alvo expressa (His6-MBP-tev-KRAS4b). Este protocolo foi desenvolvido usando um isolado de uma linha celular Trichoplusia ni, Tni-FNL17,adaptado para o crescimento da suspensão e desmamado do soro. Dada a ampla gama de resultados relatados em todas as várias linhas de células insetos com o sistema de expressão de baculovírus, é aconselhável que tni-FNL ser usado, pelo menos inicialmente, para produzido KRAS4b-FMe.

Uma proteína escura que migra para ~65 kDa deve ser óbvia no lysate esclarecido, bem como nas frações de elução (Figura 1A). A proteína de fusão deve ser uma das duas bandas manchadas mais proeminentes no lisato, sendo a outra a FNTA/B co-expressa que se irrita em ~48 kDa.

Dentro da purificação, a etapa cex é fundamental por duas razões: 1) serve para reduzir a extensão da proteólica como a região hipervariável (HVR) é bastante suscetível, e 2) enriquece para a proteína totalmente processada, como indicado nas notas para esta etapa do protocolo. É, no entanto, a parte mais complicada do protocolo. Isso ocorre porque a proteína processada tende a precipitar-se em concentrações de sal mais baixas, mesmo fundidas ao MBP. Felizmente, este não é um fenômeno tudo ou nenhum, e também ocorre um pouco lentamente ao longo do tempo. O protocolo aproveita isso discando para 200 mM NaCl antes da etapa CEX. Nesta concentração, a precipitação não foi tão significativa quanto a 100 mM. Portanto, o protocolo é projetado para limitar o período de tempo que a proteína está em um amortecedor desta concentração de sal. A mistura de pequenos alíquotas da carga da coluna CEX com volumes iguais de buffer de sal zero imediatamente antes do carregamento da coluna limita a exposição (em termos de tempo) a condições de sal baixas e, assim, limita a precipitação. A Figura 2A retrata o resultado mais típico da etapa CEX, com o mais proeminente sendo o pico 3, que contém predominantemente KRAS4b-FMe. A Figura 2B retrata perfis de elução observados para dar uma noção da variabilidade do resultado do procedimento. Porque estes podem às vezes ser enganadores, é prudente criar associações de todos os picos e armazená-los em -80 °C até que o pico do interesse esteja purificado inteiramente e passado testes da qualidade.

Como observado no protocolo, o uso de colunas de alto desempenho HiPrep SP Sepharose parece ser fundamental para alcançar a separação observada na Figura 2A. Embora ainda não esteja claro por que o pico três freqüentemente abriga kras4b farnesylated-only, além do desejado kras4b farnesylated e carboxymethylated, a resolução pobre outros relataram com resinas CEX alternativas (comunicação pessoal) sugere que este fenômeno não é apenas um resultado de interações iônicas.

Os rendimentos típicos variaram de 1-6 mg/L, com 3-5 mg/L alcançados com freqüência (>90%, n > 50). A análise de massa intacta usando ESI-MS confirmou a massa molecular precisa das proteínas e, assim, a proporção relativa de farnseeção e/ou carboximetilação (Figura 3). Embora os lotes finais típicos contenham alguns KRAS4b-FARN detectáveis, essa proporção foi inferior a 15% em termos de altura máxima a partir desta análise. Figura 3A mostra dados representativos para KRAS4b que não é pré-nylated expressa em E. coli, Figura 3B mostra KRAS4b-FMe eluted nos picos 3 e 5 da CEX, e Figura 3C mostra KRAS4b-Farn eluted no pico 2 de CEX.

A massa do KRAS4b vinculado ao PIB também foi determinada para essas amostras usando análise de massa nativa (Figura 3D). A troca das amostras em acetato de amônio garantiu uma ionização "mais suave" e o complexo nativo permaneceu intacto, fornecendo confirmação da natureza do nucleotídeo vinculado ao KRAS4b.

Para validar essa farnésilação e carboxilmetilação são necessárias para KRAS4b-FMe para ligar às membranas, medimos a interação de KRAS4b-FMe para lipossomas via SPR. Como mostrado na Figura 4, KRAS4b-FMe ligado aos lipossomas, enquanto KRAS4b não processado não, demonstrando assim que kras4b-fme processado é necessário para a interação com as membranas.

Figure 1
Figura 1: SDS-PAGE géis do processo de purificação. (A)Captura de IMAC de lysate. FNTA/B são as bandas escuras que migram a ~48 kDa e o His6-MBP-tev-KRAS4b é a banda escura que migra a ~67 kDa. M = proteína escada de peso molecular; T = proteína total; L = carga clarificada de lysate/coluna; F = fluxo de coluna através. As frações são eluted com um gradiente crescente da concentração do imidazole. (B) As frações CEX rotuladas de 1 a 5 correspondem às frações de pico dos picos de elução mostrados no cromatograma da Figura 2. (C)Digestão TEV e segundo IMAC. C = piscina de cex passo pré-TEV clivagem; L = carga amostra pós-TEV clivagem. As espécies de interesse são rotuladas. (D)Um e cinco microgramas de proteína KRAS4b-FMe final. Os géis retratados são resultados representativos de várias produções. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 2
Figura 2: Perfil de elução de cromatografia CEX. (A)O perfil típico de elução CEX tem quatro a cinco grandes picos. Além do pico 1, que normalmente é uma forma proteolizada de KRAS4b não processado sem os quatro aminoácidos c-terminais, os quatro picos numerados 2 a 5 no painel resultam da variabilidade no processamento do N- e C-termini da proteína, com moléculas progressivamente mais carregadas positivamente que se elutam mais tarde no gradiente (ver passo 1.15). (B) Exemplos adicionais de perfis de elução CEX. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 3
Figura 3: Análise intacta e nativa da espectrometria de massa das proteínas KRAS4b purificadas. Espectro de massa intacto e resultados de análise de pico deconvolizados para(A)KRAS4b 2-185 não processado, MW previsto = 21.064; (B) KRAS4b 2-185-FMe, picos 3 e 5 da CEX, previsto MW = 21.281; (C) KRAS4b 2-185-Farn, pico 2 da CEX, previu MW = 21.267. (D)A massa nativa desconvolvedanálise máxima para E. coli expressou KRAS4b 2-185 (i), KRAS-FMe 2-185 (ii), e KRAS-Farn 2-185 (iii), tudo no estado vinculado ao GDP-nucleotide. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 4
Figura 4: KRAS4b-FMe ligando-se a lipossomas via SPR. Distribuição de tamanho de 70:30 POPC:POPS lipossomos obtidos pela DLS. (A)Os dados do DLS mostram um diâmetro médio de ~200 nm para os lipossomos com uma polidispersão de 18%. (B) Sensorgramas de ligação SPR de 60-0,6 μM KRAS4b-FMe às 70:30 lipossomos capturados em um sensor l1 chip. C) O ajuste dos isotérmicos de ligação de estado constante derivados dos dados spr forneceu um KD aparente de 1 μM de KRAS4b-FMe ligando aos lipossomas. A resposta vinculativa é normalizada dividindo-se pelo nível de captura superficial dos lipossomas. (D)Cinética de ligação SPR de 60-0,6 μM KRAS4b-2-185 a 70:30 lipomas capturados em um sensor L1 chip. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

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Discussion

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Conforme observado na seção resultados representativos, o passo mais crítico durante a purificação é o manuseio da amostra durante o tempo em que está em sal inferior. Limitar o tempo em que a amostra é exposta a menos de 200 mM NaCl ajudará a reduzir a precipitação e aumentar o rendimento da amostra. A interpretação dos resultados do CEX pode ser difícil se o perfil não corresponder às expectativas (ver Figura 2). Até que o protocolo se torne rotina, é aconselhável que as frações de elução cex que não são tomadas para a frente sejam armazenadas a -80 °C até que a análise de massa intacta tenha sido concluída para garantir que o material adequado fosse levado adiante. Fora dos parâmetros observados acima para a etapa CEX, o protocolo é relativamente fácil de modificar nas etapas de lise e IMAC. Também vale a pena notar que não há nenhuma etapa de separação de cromatografia de exclusão de tamanho (SEXO) no protocolo. Isso é omitido devido às perdas que observamos durante o desenvolvimento precoce do método (resultados inéditos). Vale ressaltar que essas perdas não são observadas quando a proteína está complexa com nanodiscos, sugerindo que a perda na ausência de lipídios se deve à interação hidrofóbica entre a proteína e a resina.

Este método representa um grande aumento tanto na quantidade (>10x superior) quanto na qualidade (em comparação com kras4b processado de boa-fé expresso em células humanas) que tem sido relatado na literatura14,18, 19. O rendimento de 3-5 mg/L permitiu esforços estruturais da biologia que exigem exigências elevadas da proteína16,20. Modificações pós-translacionais adicionais para outros membros da família RAS, bem como modificações pós-translacionais adicionais em geral estão sendo investigadas.

Para análise de massa intacta do KRAS4b, uma concentração de 0,1 mg/mL funciona bem. Concentrações mais baixas podem ser usadas devido à capacidade da configuração de proteína relaxada de aceitar taxas. No entanto, na análise de massa nativa, onde a proteína está em sua conformação dobrada nativa, há menores proporções de massa para carga e concentrações mais altas são necessárias. Assim, o uso de concentrações mais baixas de proteína resulta em uma diminuição do sinal e produz resultados menos confiáveis. A vantagem da espectrometria de massa nativa é que o amortecedor é compatível com a manutenção do complexo de nucleotídeos ligados ao KRAS4b. Portanto, é possível confirmar as formas ligadas ao nucleotídeo das proteínas(Figura 3D). Tal como acontece com qualquer análise de espectrometria de massa, as perdas neutras (como um grupo de metilo) são observadas (ver espécies menores com perda de 18 na análise de massa intacta, Figura 3A-C). Na análise de espectrometria de massa nativa, os adutores de proteína com Na+ ou K+, presentes após extensa troca de buffer, podem ser observados. Isto é evidente nos picos menores de +23 na Figura 3D, painéis i-iii).

Nossos dados SPR(Figura 4)mostram que a forma totalmente processada de KRAS4b é necessária para recapitular a interação kras4b-membrana in vitro. Uma grande vantagem de usar o chip L1 para capturar os lipossomos em nossos experimentos SPR é que a superfície do chip L1 é dextran revestido e modificado com grupos lipofílicos21,permitindo assim a captura direta dos lipossomos sem qualquer modificação adicional. A SPR é uma técnica poderosa para estudar interações de ligande fornecendo informações sobre stoichiometria e afinidade vinculativa. Sensorgramas que funcionam corretamente devem ter uma fase de associação que atinja um estado estável. Esta resposta de ligação máxima (Rmax)fornece uma estimativa da stoichiometria para a interação. A taxa de dissociação deve seguir uma única decadência exponencial, assumindo uma interação de ligação 1:122. No entanto, proteínas que se ligam a uma superfície de membrana geralmente ocorrem com stoichiometries maiscomplexas 23 e múltiplas afinidades que resultam em sensorgramas com cinética mais complexa. Nós não conseguimos encaixar a cinética para um modelo de ligação multisite. No entanto, os isotérmicos de ligação de equilíbrio podem estar aptos usando software de avaliação comercial para fornecer uma aparente afinidade de equilíbrio obrigatório (KD). Independentemente disso, nossos dados spr claramente diferencia entre como kras4b não processado e KRAS4b-FMe ligar a lipossomos. Assim, o SPR ainda fornece uma ferramenta útil para decifrar interações proteína-lipídios.

Coletivamente, usando SPR demonstramos que kras4b-fme totalmente processado é necessário para a ligação da membrana. A produção da forma totalmente farnesilada e carboximetilada de KRAS4b usando essa abordagem fornece a quantidade e a qualidade do material necessário para a biologia estrutural20,caracterização biofísica das interações de membrana23,e estudos de triagem contra o complexo KRAS4b-FMe:RAF na presença de bilayers lipídicos.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

Reconhecemos o apoio à clonagem e expressão de Carissa Grose, Jen Melhalko e Matt Drew no Laboratório de Expressão de Proteínas, Frederick National Laboratory for Cancer Research. Este projeto foi financiado no todo ou em parte com fundos federais do Instituto Nacional do Câncer, Institutos Nacionais de Saúde, o Contrato Nº. HHSN261200800001E. O conteúdo desta publicação não reflete necessariamente as opiniões ou políticas do Departamento de Saúde e Serviços Humanos, nem menciona nomes comerciais, produtos comerciais ou organizações implicam endosso do Governo dos EUA

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural Eppendorf 22363204
11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials Thermo Scientific 30211SS-1232
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) AVANTI POLAR LIPIDS 850457 purchase as liquid stocks in chloroform
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) AVANTI POLAR LIPIDS 840034 purchase as liquid stocks in chloroform
5427R Centrifuge Eppendorf
Acetonitrile, HPLC Grade Fisher Chemical A998-1 1L
Ammonium Acetate Sigma-Aldrich 09689-250g
Argon gas Airgas ARUP
Assay Plate 384 CORNING 3544
Biacore T200 Instrument GE Healthcare
Blue Snap-It Seals, T/S Thermo Scientific C4011-54B
Branson Ultrasonic Bath Thermo Fisher 15-336-1000
Cation Exchange Chromatography (CEX) column GE Healthcare Life Sciences 29018183 HiPrep SP Sepharose High Performance
CHAPS Sigma C3023
Dyna Pro Plate Reader Wyatt Technologies
Exactive Plus EMR Mass Spectrometer Thermo Scientific
Formic Acid Sigma-Aldrich F0507-500Ml Use Reagent Grade or better
Gilson vials 7x14 mm Tubes GE Healthcare BR-1002-12
Glass screw thread vials with PTFE foam liners Scientific Specialities B69302
High speed/benchtop centrifuge Thermo Fischer Scientific 05-112-114D capable of up to 4,000 xg
His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease Addgene 92414 Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY
Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column GE Healthcare Life Sciences 28-9365-51 HisPrep FF 16/10
In-House Water Supply, Arium Advance Sartorius Stedim Resistivity of 18 MΩ0-cm
Lipid extruder set with holder AVANTI POLAR LIPIDS 610023
Liquid nitrogen Airgas NI-DEWAR
M110-EH microfluidizer Microfluidics
MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm Thermo Scientific 088645
MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mm Thermo Scientific 088790
MagTran software Thermo Scientific
Methanol, HPLC Grade VWR Chemicals BDH20864.400
NGC Chromatography System BioRad 78880002 NGC QuestTM 100 Chromatography system
Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators Millipore Sigma P8849
Rubber Caps type 3 GE Healthcare BR-1005-02
Series S Sensor Chip L1 GE Healthcare 29104993
Spectrophotometer Thermo Fischer Scientific 13-400-519 Absorbace at 280nm
Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL Millipore Sigma UFC901008 PES membrane
Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters Amicon UFC501024
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima - L80K capable of 100,000 xg
Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System) Thermo Scientific
Vortex Genie 2 Fisher 12-812
Water, HPLC Grade Sigma-Aldrich 270733-1L May use in-house water source (see below)
Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter GE Healthcare - Whatman 6994-2504
Xcalibur QualBrowser Thermo Scientific proteomics software

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References

  1. Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4, (6), 1008-1016 (1992).
  2. Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).
  3. Hottman, D. A., Li, L. Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease. Molecular Neurobiology. 50, (1), 177-185 (2014).
  4. Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. HDL and cognition in neurodegenerative disorders. Neurobiology of Disease. 72, Pt A 22-36 (2014).
  5. Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms. Annals of Medicine. 35, (6), 398-403 (2003).
  6. Kohnke, M., et al. Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease. PLoS One. 8, (12), 81758 (2013).
  7. Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. Targeting protein prenylation for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11, (11), 775-791 (2011).
  8. Kho, Y., et al. A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, (34), 12479-12484 (2004).
  9. Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB. Journal of Biological Chemistry. 270, (14), 7864-7868 (1995).
  10. Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. Dragging ras back in the ring. Cancer Cell. 25, (3), 272-281 (2014).
  11. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics. Chemical Reviews. 117, (6), 4669-4713 (2017).
  12. Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles. Journal of Visualized Experiments. (66), e3910 (2012).
  13. Dementiev, A. K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation. Protein Expression and Purification. 84, (1), 86-93 (2012).
  14. Lowe, P. N., et al. Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems. Journal of Biological Chemistry. 266, (3), 1672-1678 (1991).
  15. Gillette, W., et al. Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System. Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).
  16. Agamasu, C., et al. KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner. Biophysical Journal. 116, (6), 1049-1063 (2019).
  17. Talsania, K., et al. Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies. Genes. 10, (2), 79 (2019).
  18. Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nature Chemical Biology. 13, (1), 62-68 (2016).
  19. Lowe, P. N., et al. Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system. Biochemical Society Transactions. 20, (2), 484-487 (1992).
  20. Dharmaiaha, S., et al. Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDEδ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (44), 6766-6775 (2016).
  21. Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore. Analytical Biochemistry. 328, (2), 233-243 (2004).
  22. Fisher, R. J., et al. Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34, (2), 472-484 (2006).
  23. Lakshman, B., et al. Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).
KRAS4b recombinante totalmente processado: Isolando e caracterizando a proteína farnesylated e metilada
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Agamasu, C., Frank, P., Perkins, S., Waybright, T., Messing, S., Gillette, W., Stephen, A. G. Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein. J. Vis. Exp. (155), e60703, doi:10.3791/60703 (2020).More

Agamasu, C., Frank, P., Perkins, S., Waybright, T., Messing, S., Gillette, W., Stephen, A. G. Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein. J. Vis. Exp. (155), e60703, doi:10.3791/60703 (2020).

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