Summary
La prenilazione è una modifica importante sulle proteine che legano la membrana periferica. Le cellule degli insetti possono essere manipolate per produrre farnesylated e carboxymethylated KRAS4b in quantità che consentono misurazioni biofisiche delle interazioni proteina-proteina e proteina-lipidi
Abstract
La prenilazione delle proteine è una modifica chiave che è responsabile del targeting delle proteine alle membrane intracellulari. KRAS4b, che è mutato nel 22% dei tumori umani, viene elaborato da farnesilazione e carboxymetilation a causa della presenza di un motivo scatola 'CAAX' al capolinea C. Un sistema di baculovirus ingegnerizzato è stato utilizzato per esprimere kraS4b farnesylated e carboxymethylated nelle cellule degli insetti ed è stato descritto in precedenza. Qui descriviamo la purificazione dettagliata e pratica e la caratterizzazione biochimica della proteina. In particolare, l'affinità e la cromatografia di scambio ioleomatico sono stati utilizzati per purificare la proteina per l'omogeneità. La spettrometria di massa intatta e nativa è stata utilizzata per convalidare la corretta modifica di KRAS4b e per verificare l'associazione dei nucleotidi. Infine, l'associazione della membrana di farnesylated e carboxymethylaed KRAS4b ai liposomi è stata misurata utilizzando la spettroscopia della risonanza del plasonanza del plasonco superficiale.
Introduction
Le modifiche post-traduzionali svolgono un ruolo chiave nella definizione dell'attività funzionale delle proteine. Modifiche come il fosfororylazione e la glicosilazione sono ben consolidate. Le modifiche dei lipidi sono tuttavia meno ben caratterizzate. Si stima che per quanto 0.5% di tutte le proteine cellulari possono essere prenylated1. La presilazione è il trasferimento di un farnesyl di 15 carbonio o di una catena di lipidi geranilgeranyl a 20 carbonio a una proteina accettante contenente il motivo CAAX2. Proteine prenylated sono stati implicati nella progressione di diverse malattie umane tra cui l'invecchiamento precoce3, MorbodiAlzheimer 4 , disfunzione cardiaca5, chioderemia6, e cancro7. I piccoli GTPases, HRAS, NRAS e KRAS1, lamininine nucleari, e le cinetocori CENP-E e F sono proteine farnesylated sotto la condizione basale. Altri piccoli GTPases, vale a dire RhoA, RhoC, Rac1, cdc-42 e RRAS sono geranilgeranylated8, mentre RhoB può essere farnesylated o geranylgeranylated9.
Il piccolo GTPase KRAS4b funziona come un interruttore molecolare, essenzialmente trasmettendo fattore di crescita extracellulare che segnala alle vie di trasduzione del segnale intracellulare che stimolano la crescita e la proliferazione cellulare, attraverso molteplici interazioni proteina-proteina. Ci sono due aspetti chiave della biochimica KRAS4b che sono essenziali per la sua attività. In primo luogo, le proteine si scatenano tra un PIL inattivo e uno stato legato gtP attivo in base al quale si impegna attivamente con gli effetti. In secondo luogo, una regione poli-lisina c-terminale e una cisteina farnesillaata e carboxymethylated indirizzano la proteina verso la membrana plasmatica, consentendo il reclutamento e l'attivazione di esedotti a valle. Il kraS4b mutante è un fattore oncogenico nel cancro del pancreas, del colon-retto e del polmone10e, come tale, l'intervento terapeutico avrebbe un enorme beneficio clinico. La produzione di proteine ricombinanti autenticamente modificate che è farnesilata e carboxymethylated consentirebbe lo screening biochimico utilizzando KRAS4b in combinazione con surrogati di membrana come liposomi o nanodischi lipidi11,12.
Farnesyl transferase (FNT) catalizza l'aggiunta di farnesil pirofosfato alla cisteina c-terminale nel motivo CAAX in KRAS4b. Dopo la prenylazione, la proteina viene trafficata al reticolo endoplasmico (ER) dove l'enzima di conversione del ras (RCE1) fende i tre residui del terminale C. L'ultima fase nella lavorazione è la metilazione del nuovo residuo di farnesylcysteine terminale C dalla proteina della membrana ER, isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase (ICMT). L'espressione di KRAS4b ricombinante in E. coli determina la produzione di una proteina non modificata. Precedenti tentativi di produrre KRAS4b elaborati sono stati limitati a causa di rese insufficienti per esperimenti di screening strutturale o farmacologico o non sono riusciti a ricapitolare la proteina matura nativa a lunghezza intera13,14. Il protocollo qui presentato utilizza un sistema di espressione delle cellule di insetti a base di baculovirus ingegnerizzato e un metodo di purificazione che genera KRAS4b altamente purificato e completamente elaborato a rese di 5 mg/L di coltura cellulare.
Un'attenta caratterizzazione delle proteine è essenziale per convalidare la qualità delle proteine ricombinanti prima di intraprendere studi di biologia strutturale o di screening farmacologico. Due parametri chiave di KRAS4b completamente elaborati sono la convalida della corretta modifica prenyl e la disponibilità del c-terminus (FMe) farnesylated e carboxymethylated (FMe) per l'interazione con i sostituti della membrana o i lipidi. La spettrometria di massa di ionizzazione elettrospray (ESI-MS) del KRAS4b-FMe è stata utilizzata per misurare il peso molecolare e confermare la presenza delle modifiche al farnesil e al carboxymethyl. La spettrometria di massa nativa, in cui i campioni sono spruzzati con solventi non incustoditi, è stata utilizzata per dimostrare che ANCHE KRAS4b-FMe era legato al suo cofattore del PIL. Infine, è stata utilizzata la spettroscopia per la risonanza del plasonanza superficiale per misurare il legame diretto di KRAS4b-FMe con liposomi immobilizzati.
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Protocol
1. Purificazione delle proteine
- Preparare i buffer A–H, come illustrato nella tabella 1.
| Soluzione buffer | Agente di buffering (tutti i 20 mM) | pH | NaCl (mM) | imidazolo (mM) | MgCl2 | TCEP |
| Un | HEPES | 7.3 | 300 | - | 5 | 1 |
| B | HEPES | 7.3 | 300 | 35 | 5 | 1 |
| C | HEPES | 7.3 | 300 | 500 | 5 | 1 |
| D | Mes | 6.0 | 200 | - | 5 | 1 |
| E (in questo modo | Mes | 6.0 | - | - | 5 | 1 |
| F | Mes | 6.0 | 100 | - | 5 | 1 |
| G | Mes | 6.0 | 1000 | - | 5 | 1 |
| H | HEPES | 7.3 | 300 | - | 1 | 1 |
- Preparare i materiali di purificazione (vedi Tabella dei materiali):cocktail inibitore della proteasi senza EDTA o altri chelatori; colonna di cromatografia di affinità metallica immobilizzata (IMAC); colonna cation exchange chromatoography (CEX); 0,45 m filtro siringa; 2 M imidazolo (pH - 7,5); ultracentrifuga in grado di 100.000 x g; centrifuga di panchine ad alta velocità in grado di 4.000 x g; unità filtrate centrifughe (10 KDa NMWL); spettrofotometro in grado di leggere a 280 nm; La sua proteasi del virus dell'etch del tabacco (TEV); e strumentazione cromatografica in grado di combinare due soluzioni buffer, applicare soluzioni alle colonne, creare sluzioni sfumature da colonna e raccogliere frazioni dalle colonne.
- Scongelare le cellule provenienti da 2 L di coltura di cellule di insetti precedentemente immagazzinate a -80 gradi centigradi o utilizzare cellule appena raccolte. Vedere Gillette et al. 201915 per informazioni dettagliate sui protocolli di espressione e linea cellulare degli insetti Tni.FNL. Risospendere con attenzione le cellule con 200 mL di Buffer A con l'inibitore della proteasi 1:200 v/v senza introdurre aria o creare schiuma.
NOTA: il passaggio 1.3 e i passaggi successivi (ad eccezione di quanto indicato) devono essere eseguiti a temperatura ambiente (22 gradi centigradi). È importante che il campione sia omogeneo per consentire una lisis completa nella fase successiva. - Pellet a cellule di Lyse in un microfluidizzatore a 7.000 psi per due passate o in un sistema di lisi equivalente. I metodi alternativi di lisi non sono stati esplorati.
- Chiarire i lismi delle cellule di insetti è problematico a causa della presenza di composti che intasano i filtri. Pertanto, l'ultracentrifugazione (100.000 x g per 30 min a 4 gradi centigradi) è molto importante. Un residuo lipidico bianco sulla superficie del supernatante dovrebbe essere evitato e può essere rimosso o ridotto utilizzando tamponi di cotone. Filtrare la supernata decantata con un filtro PES da 0,45 m. Utilizzare immediatamente il campione chiarificato o conservarlo a -80 gradi centigradi.
NOTA: i filtri residui bloccano rapidamente i filtri e potrebbero essere necessari molti filtri. La mancata riduzione della quantità di questo materiale comporterà un'elevata pressione posteriore della colonna nei passaggi successivi. - Determinare il volume del lisato chiarificato e regolare il campione a 35 mM imidazole con l'aggiunta di 2 M di brodo imidazole. Caricare il campione a 3 mL/min su una colonna IMAC da 20 mL (colonna HisPrep FF 16/10) pre-equilibrata nel Buffer B per volumi a tre colonne (CV).
- Anche se la proteina di destinazione è in genere quantitativamente adsorbita alla colonna, è meglio raccogliere il flusso della colonna per l'analisi successiva. Lavare la colonna fino a quando l'Abs280 raggiunge una linea di base costante (<100 milliabsorbance units [mAU]) con buffer B a 3 mL/min per 20 mL (1 CV) quindi per 3 CV a 4 mL/min per il resto della fase di lavaggio. In genere, sono necessari 60-80 mL di buffer B per ottenere l'assorbimento della linea di base.
- Elutare la proteina con un gradiente di 400 mL (20 CV) dal Buffer B al Buffer C mentre si raccolgono frazioni 8 mL. In genere, la proteina di destinazione eviene nella prima metà del gradiente (Figura 1A; non tutte le frazioni successive sono mostrate).
- Analizzare le frazioni proteiche utilizzando la colorazione SDS-PAGE/Coomassie. Piscina frazioni di picco e diallyze la piscina durante la notte contro 2 L di Buffer D a 4 gradi centigradi.
NOTA: Il pH basso è fondamentale per garantire il legame proteico nella fase successiva. Tuttavia, il cambiamento di pH durante questa dialisi si verifica lentamente, e questo è un passo conveniente per l'incubazione notturna. Le strategie alternative di scambio di buffer (ad esempio, una maggiore concentrazione del buffer per accelerare il cambiamento di pH) non sono state studiate. La proteina inizierà a precipitare lentamente nel tempo a pH inferiore e concentrazioni di sale più basse e una piccola quantità di precipitazioni è normale durante questa fase. Per questo motivo, evitiamo di scambiare il buffer al NaCl da 100 mM necessario per l'associazione alla colonna successiva durante la dialisi. Piuttosto, una concentrazione di NaCl di 200 mM viene utilizzata per la dialisi e la proteina viene diluita a 100 mM (vedi sotto) immediatamente prima dell'applicazione alla colonna. Non abbiamo studiato se questa precipitazione è specifica di KRAS4b, ma la proteina che fa precipitare è stata confermata come KRAS4b-FMe. Per questo motivo, suggeriamo di utilizzare la maggiore concentrazione di NaCl nel tampone di dialisi per qualsiasi proteina di interesse come precauzione fino a quando non è possibile determinare la stabilità della proteina bersaglio nel buffer di legame. - Togliere il campione dalla dialisi e centrifugare a 4.000 x g per 10 min per rimuovere eventuali precipitati. L'ultimo campione dialyzed, chiarito a questo punto è ancora spesso confuso, ma può essere applicato senza ulteriori elaborazioni sulla successiva colonna CEX.
- Preparare una colonna di scambio di 20 mL (vedere Tabella dei materiali) lavando con tre CV del Buffer G, quindi con tre CV del Buffer F.
NOTA: Anche se non abbiamo valutato meticolosamente altre resine, diversi colleghi hanno trovato una cattiva risoluzione con resine diverse da SP Sepharose ad alte prestazioni. - Diluire 20 mL del campione dializzato a una concentrazione finale di NaCl di 100 mM aggiungendo 20 mL di Buffer E e applicare il campione diluito alla colonna di scambio cation.
- Continuare a caricare la colonna aggiungendo campioni appena diluiti preparati come descritto sopra al tubo di carico mentre la diluizione precedente si sta avvicinando alla fine del carico.
NOTA: La diluizione dell'intero campione in una sola volta a 100 mM NaCl ha provocato una significativa perdita di proteine bersaglio a causa di precipitazioni. - Lavare la colonna sulla linea di base Abs280 con buffer F. Questo richiede in genere 3 CV. La proteina viene elata dalla colonna durante un gradiente di 400 mL (20 CV) dal buffer F al 65% Buffer G, raccolto in frazioni da 6 mL (Figura 1B).
- Continuare a lavare la colonna per un ulteriore 1,5 CV (65% Buffer G) una volta completato il gradiente. Scegli le frazioni positive in base all'analisi delle macchie blu SDS-PAGE/Coomassie e all'ispezione della traccia UV del cromatogramma.
NOTA: la traccia UV contiene in genere cinque picchi. A partire da concentrazioni di sale più basse, il picco iniziale è di solito proteine non lavorate e/o proteolizzate. Il secondo e il terzo picco sono una miscela di due forme di proteina elaborata: il secondo picco è principalmente un intermedio farnesillato intermedio (FARN), mentre il terzo è principalmente la proteina FMe completamente elaborata di interesse. I picchi quattro e cinque rappresentano le proteine di fusione His6-MBP-KRAS4b (tutte le proteine sono in questo formato a questo punto, poiché non si è verificata alcuna digestione TEV). Questi non sono acetilati al N-terminus e sono farnesylated (picco quattro) e farnesylated e carboxymethylated (picco cinque) al capolinea C. Poiché il picco due e il picco quattro produrranno proteine identiche dopo la rimozione del tag (cioè KRAS4b-FARN), queste possono essere raggruppate in questa fase, se lo si desidera. Analogamente, il picco tre e il picco cinque possono essere combinati per produrre un singolo lotto di KRAS4b-FMe(Figura 1B, Figura 2). Tuttavia, si consiglia di raggruppare solo quando la natura della proteina nei picchi separati è stata confermata. - Digerire la proteina in pool al punto 1.15 con la proteasi His6-TEV (200 dollari di proteasi/mL di campione.
NOTA: Realizziamo la proteasi His6-TEV utilizzando il plasmide e i protocolli disponibili da Addgene (https://www.addgene.org/92414). Dialze il digest TEV contro buffer A (10 kDa MWCO dialisi con un minimo di 40 mL di buffer A per mL di campione) per 2 h a temperatura ambiente e poi durante la notte a 4 gradi centigradi. - Dopo la digestione e la dialisi, caricare la proteina direttamente in una colonna IMAC da 20 mL equilibrata con buffer A a 3 mL/min.
NOTA: Raccogliere 7 frazioni mL durante l'intera cromatografia, perché la proteina bersaglio ha una bassa affinità per la colonna, ma potrebbe non essere interamente associata alla resina. Lavare la colonna a 3 mL/min con il buffer A per un totale di 3 CV o fino a quando non viene raggiunta un'assorbimento della linea di base. - La proteina bersaglio è elaiata con un gradiente di 5 CV di Buffer C da 0%–10%, raccogliendo 7 mL di frazioni. Per precauzione, ulteriori proteine associate possono essere eluite con 100% Buffer C. Le frazioni positive sono identificate dopo l'analisi da SDS-PAGE (Figura 1C). Tipicamente, la proteina bersaglio si eviene a bassa concentrazione di imidazolo (cioè nel gradiente 0%–10% Buffer C) ma a volte si eluisce nel flusso attraverso o nel lavaggio della colonna.
- Dialyze il pool finale contro Buffer H. Determinare la concentrazione di proteine da spettrofotometria a 280 nm.
NOTA: Assicurarsi di tenere conto della presenza del nucleotide quando si determina il coefficiente di estinzione da utilizzare per questo calcolo. - La proteina può essere concentrata fino a 2-5 mg/mL utilizzando un'unità filtrante centrifuga (10 K NMWL) senza perdita significativa di proteine. Filtrare con un filtro di siringa da 0,22 M. Misurare l'assorbimento della soluzione a A280 per calcolare la concentrazione proteica finale (Figura 1D). Lo snap si congela con l'aliquota in azoto liquido e conserva campioni congelati a -80 gradi centigradi.
NOTA: la proteina purificata è legata al PIL. KRAS4b-FMe può essere scambiato in GppNHp utilizzando protocolli16pubblicati in precedenza.
2. Preparazione del campione per l'analisi di massa intatta e l'analisi di massa nativa
- Preparazione del campione per l'analisi di massa intatta
- Scongelare il campione di proteine sul ghiaccio prima dell'analisi. Per un'analisi di massa intatta, diluire la proteina a 0,1 mg/mL in bicarbonato di ammonio da 20 mm (pH - 8,4 USD). Per l'analisi di massa nativa, diluire la proteina a una concentrazione di 0,1 mg/mL in acetato di ammonio da 50 mM (pH 7,5). Vorticare ogni campione per 5-10 s, quindi centrificare a 12.500 x g per 1 min a pellet qualsiasi materiale solido nella soluzione. Togliere 10-20 l di ogni supernatante e trasferirli su una fiala di vetro autocampionatore. Capovolgere saldamente ciascuna fiala per evitare contaminazioni o evaporazione.
NOTA: Per l'analisi di massa intatta o l'analisi di massa nativa, il campione può essere dissalato prima dell'analisi utilizzando un filtro di membrana di cellulosa MWCO da 10 kDa per lo scambio tampone nel buffer di diluizione finale.
- Scongelare il campione di proteine sul ghiaccio prima dell'analisi. Per un'analisi di massa intatta, diluire la proteina a 0,1 mg/mL in bicarbonato di ammonio da 20 mm (pH - 8,4 USD). Per l'analisi di massa nativa, diluire la proteina a una concentrazione di 0,1 mg/mL in acetato di ammonio da 50 mM (pH 7,5). Vorticare ogni campione per 5-10 s, quindi centrificare a 12.500 x g per 1 min a pellet qualsiasi materiale solido nella soluzione. Togliere 10-20 l di ogni supernatante e trasferirli su una fiala di vetro autocampionatore. Capovolgere saldamente ciascuna fiala per evitare contaminazioni o evaporazione.
- Preparazione della spettroscopia di massa estesa (EMR) per l'analisi di massa
NOTA: prima di eseguire qualsiasi analisi sullo spettrometro di massa, assicurarsi che sia stato calibrato di recente. Inoltre, indossare sempre guanti e altre attrezzature di protezione personale, se necessario, per evitare sostanze chimiche nocive e per evitare di contaminare campioni e solventi. La calibrazione viene eseguita utilizzando una soluzione di calibrazione ottenuta commercialmente e una soluzione di iodio di cesio da 2 mg/mL preparata internamente.- Aprire il software di analisi e caricare il file del metodo dello strumento appropriato. Per l'analisi di massa intatta delle proteine KRAS4b, i parametri di partenza adatti sono i seguenti: modalità positiva di rilevamento; tre microscani, risoluzione : 70.000; Obiettivo AGC - 3e6; tempo massimo di integrazione: 200 ms; e un intervallo di scansione: 70-1.800 rapporto massa-carica (m/z). Per l'analisi di massa nativa delle proteine KRAS4b, i parametri di partenza adatti sono i seguenti: modalità positiva di rilevamento; 10 microscansioni, risoluzione 17.500; dissociazione indotto dalla collisione in sorgente (CID) - 20 eV; Obiettivo AGC - 3e6; energia da collisione (CE) - 20; tempo massimo di integrazione: 200 ms; e un intervallo di scansione: 500-10.000 m/z.
- Preparazione di solventi cromatografici e colonna
- Preparare i solventi necessari per un'analisi di massa intatta. Il solvente A è acqua con acido formica dello 0,1%. Il solvente B è l'80% di acetonitrile e lo 0,1% dell'acido formico nell'acqua.
- Preparare i solventi necessari per l'analisi di massa nativa. Il solvente A è acetato di ammonio da 0,1 m in acqua e il Solvente B è acqua.
- Dopo aver preparato i solventi appropriati, svuotare il sistema in modo che il tubo venga riempito con i solventi appropriati e tutte le bolle d'aria vengano rimosse dalle linee.
- Installare la colonna appropriata (una colonna in fase inversa per un'analisi di massa intatta e una colonna di esclusione delle dimensioni per l'analisi di massa nativa). Per l'analisi di massa intatta, la portata è di 0,5 mL/min e la temperatura della colonna (utilizzando un riscaldatore a colonna) è di 50 gradi centigradi. Equilibrate la colonna per 15-20 min. Per l'analisi di massa nativa, la portata è di 0,25 mL/min.
NOTA: monitorare sempre la pressione posteriore della colonna per assicurarsi che non superi il limite superiore, il che potrebbe indicare una linea ostruita o che la matrice della colonna è compromessa. Se necessario, sostituire la colonna.
- Analisi dei campioni
- Collocare il campione di proteine preparato nella fiala dell'autocampionatore di vetro nella griglia appropriata nell'autocampionatore di sistemi LC. Creare uno o più campioni nel programma software con il metodo dello strumento appropriato per l'analisi desiderata. Una volta completato l'elenco di esempio, fare clic sul pulsante Riproduci per avviare l'analisi.
- Iniettare 1–2 l di campione per analisi, con uno spazio d'acqua prima e dopo ogni campione, per assicurarsi che non sia presente alcun riporto.
NOTA: l'analisi di massa intatta è molto diversa dall'analisi di massa nativa e richiede impostazioni del metodo dello strumento molto diverse. Questo perché con l'analisi di massa intatta, la proteina è "rilassata" in presenza di un solvente organico, e quindi è in grado di accettare più cariche. È più facile deconvolute e risolvere la distribuzione isotopica degli stati di carica. L'analisi di massa nativa fornisce una distribuzione a carica ristretta degli ioni proteici, e in base alla proteina, richiede diverse impostazioni di tensione e collisione di energia.
- Analisi dei dati e deconvoluzione delle proteine
- Esportare lo spettro del campione in un software in cui può essere trasformato nello spettro decontomato che visualizzerà la massa intatta (o massa nativa) della proteina. La massa intatta avrà una distribuzione del picco isotopico a causa dell'elevata abbondanza di picchi spettrali caricati. La massa nativa avrà in genere pochissimi picchi a causa della bassa abbondanza dei picchi spettrali caricati (Figura 3D).
- Espandere l'intervallo massa-carica (m/z) del picco d per verificare che la massa misurata sia coerente con la massa prevista. Occasionalmente, a causa dell'aggiunta di cariche alla proteina, ci può essere una leggera variazione tra il peso molecolare previsto (MW) e l'MW osservato. Inoltre, come per molte analisi di spettrometria di massa, addotti come il sodio possono contribuire alla comparsa di picchi aggiuntivi nei dati, anche con campioni accuratamente dissalati. A volte si osservano picchi più bassi con una m/z che è inferiore al previsto. Ciò è probabilmente dovuto a una perdita neutra, che è la perdita di un gruppo funzionale a causa del processo di ionizzazione.
NOTA: Come previsto, ci saranno differenze tra la massa intatta e i picchi di massa nativi. Il display di massa intatto mostrerà l'MW previsto della proteina. Non avrà il MW extra del nucleotide attaccato o altre modifiche. Tuttavia, il picco di massa nativo mostrerà la proteina con qualsiasi nucleotide aggiunto.
3. Convalida dell'associazione KRAS4b-FMe ai liposomi
- Preparazione dei liposomi di membrana
- Preparare un buffer costituito da 20 mM HEPES (pH - 7,3), 150 mM NaCl e 1 mM TCEP.
- I materiali di preparazione dei liposomi includono 25 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) e 10 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serino (POPS) scorte in cloroformio; un estrusore lipidico con supporto e blocco riscaldante; gas argon e azoto liquido; un bagno ad ultrasuoni; fiale a vite in vetro con rivestimenti in schiuma PTFE; e un lettore di piastre in grado di rilevare la dispersione dinamica della luce.
- Scorte di lipidi di tè in cloroformio a temperatura ambiente per 30 min. Preparare 1 mL di 5 mMM 70:30 POPC: liposomi POPS con 106 l un'altezza di 25 mM POPC (stock) e 118 - L l. di 10 mM POPS (stock) in una fiala di vetro.
NOTA: Non aliquote i lipidi con una punta di plastica, perché il cloroformio potrebbe sciogliere alcune punte di plastica. - Lipidi secchi sotto un flusso costante di gas argon. Ruotare lentamente la fiala di vetro quando si applica il gas argon per formare un sottile strato di pellicola secca.
- Mettere i campioni sotto un liofilizzatore sottovuoto durante la notte per rimuovere l'eccesso di cloroformio.
- Ricostituire i lipidi aggiungendo 1 mL di tampone alla pellicola essiccata e vorticare le miscele per 5 min. Idratare le miscele di lipidi dondolando per 1 h a 25 gradi centigradi.
NOTA: Il campione sarà molto torbido dopo l'aggiunta del tampone allo strato di pellicola secca di lipidi. - Eseguire cinque cicli di congelamento/scongelamento alternando il posto della fiala del campione tra un'acqua di ghiaccio (4 o inferiore) e un bagno d'acqua calda (25 gradi centigradi o superiore).
- Collocare la fiala del campione nel bagno ultrasonico e sonicare il campione per circa 0,5 h o fino a quando il campione diventa semitrasparente.
- Estrudere i campioni utilizzando il set di estrusore lipidico. Assemblare il kit di estrusione come mostrato nelle istruzioni del produttore. Estrudete i campioni usando carta da filtro da 0,1 m. Caricare i campioni in una siringa di vetro e collegarlo a un'estremità dell'apparato di estrusione. Aggiungere una siringa vuota sull'altra estremità dell'apparato di estrusione. Spingere avanti e indietro 10-20x fino a quando i campioni diventano completamente trasparenti.
- Girare i campioni finali per 30 min a 20.000 x g per rimuovere eventuali aggregati di grandi dimensioni.
- Utilizzare DLS (Dynamic Light Scattering) per determinare le dimensioni e l'omogeneità dei liposomi (opzionale). Mettere 30 l di liposomi in un lettore di 384 pozze. Ruotare la piastra a 1.000 x g per 30 min. Posizionare la piastra in un lettore di piastre e raccogliere 10 misurazioni di dispersione della luce.
- Carattere KRAS4b-FMe rilegatura ai liposomi tramite risonanza plasmona superficiale (SPR)
- Assemblare i materiali necessari: uno strumento SPR; chip sensore L1; Tubi di avversione 7 x 14 mm; e CHAPS.
- Preparare un buffer contenente 20 mM HEPES (pH - 7,3), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP. Preparare una serie di diluizione 2:1 di KRAS4b-FMe a partire da 60 M-0,06 M in un volume totale di 200 (10 titrazioni in totale). Trasferire i campioni diluiti finali in tubi di fiala (vedere Tabella dei materiali),posizionare i tubi della fiala in un rack e inserire i campioni nello strumento SPR.
- Inserire il chip del sensore L1 nello strumento SPR. Collegare il buffer e prime il sistema con buffer per 7 min.
- Impostare un metodo automatizzato come segue:
- Impostare la temperatura dello strumento a 25 gradi centigradi.
- Attivare il chip del sensore L1 risciacquandolo con due iniezioni di 1 min di CHAPS da 20 mM disciolte in acqua a una portata di 30 l/min.
- Eseguire cicli di avviamento di dieci iniezioni di 1 min di tampone in esecuzione per idratare la superficie del chip.
- Depositare i liposomi sul chip del sensore L1 iniettando i liposomi sulla cella di flusso (FC)-2 del chip L1 con 2 min iniezioni a 5 l/min.
NOTA: Aumentare il tempo di iniezione fino a raggiungere il livello di acquisizione appropriato.
- Depositare i liposomi sul chip del sensore L1 iniettando i liposomi sulla cella di flusso (FC)-2 del chip L1 con 2 min iniezioni a 5 l/min.
- Iniettare tre cicli di tampone su FC-1 e FC-2 con iniezioni di 1 min a 30 l/min.
- Iniettare i vari titrations KRAS4b-FMe dalla serie di concentrazione più bassa a quella più alta. Iniettare le proteine utilizzando 1 min iniezioni per la fase di associazione e 2 minime iniezioni per la fase di dissociazione a 30 : velocità di flusso lecc/min su entrambi gli FC.
- Rigenerare il chip del sensore L1 risciacquandolo con due iniezioni di 1 min di 20 mM CHAPS a 30 gradi l/min.
- Adattare i dati utilizzando il software di valutazione SPR utilizzando un singolo modello di associazione del sito per ottenere affinità di associazione apparenti (vedere la sezione Discussione per una spiegazione del montaggio dei dati).
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Representative Results
Una delle variabili più grandi nel protocollo è la quantità di proteina bersaglio espressa (His6-MBP-tev-KRAS4b). Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando un isolare da una linea cellulare Trichoplusia ni, Tni-FNL17, adattato per la crescita delle sospensioni e svezzato dal siero. Data l'ampia gamma di risultati riportati attraverso le varie linee di cellule di insetti con il sistema di espressione del baculovirus, è consigliabile che Tni-FNL venga utilizzato, almeno inizialmente, per produrre KRAS4b-FMe.
Una proteina scura che migra a 65 kDa dovrebbe essere evidente nel lisate chiarificato e nelle frazioni di eluizione (Figura 1A). La proteina di fusione dovrebbe essere una delle due bande colorate più importanti nel lisa con l'altra è la FNTA/B co-espressa che comigra a 48 kDa.
All'interno della purificazione, la fase CEX è fondamentale per due motivi: 1) serve a ridurre l'entità della proteolisi in quanto la regione ipervariabile (HVR) è abbastanza suscettibile e 2) si arricchisce per la proteina completamente elaborata come indicato nelle note per questa fase del protocollo. È, tuttavia, la parte più complicata del protocollo. Questo perché la proteina lavorata tende a precipitare a concentrazioni di sale più basse, anche fuse a MBP. Fortunatamente, questo non è un fenomeno tutto o nessuno, e si svolge anche un po 'lentamente nel tempo. Il protocollo sfrutta questo dialpendo a 200 mM NaCl prima del passaggio CEX. A questa concentrazione, la precipitazione non era così significativa come a 100 mM. Pertanto, il protocollo è progettato per limitare il periodo di tempo in cui la proteina si trova in un buffer di questa concentrazione di sale. La miscelazione di piccoli aliquote del carico della colonna CEX con volumi uguali di buffer a zero sale immediatamente prima del caricamento della colonna limita l'esposizione (in termini di tempo) a condizioni di sale basso e limita così le precipitazioni. Figura 2A illustra il risultato più tipico dal passo CEX, con il più prominente è picco 3, che contiene prevalentemente KRAS4b-FMe. La figura 2illustra i profili di eluizione che sono stati osservati per dare un senso della variabilità del risultato della procedura. Poiché a volte questi possono essere fuorvianti, è prudente creare piscine di tutti i picchi e conservarli a -80 gradi centigradi fino a quando il picco di interesse non è stato completamente purificato e superato i test di qualità.
Come indicato nel protocollo, l'uso di HiPrep SP Sepharose High Performance colonne sembra essere fondamentale nel raggiungimento della separazione osservata nella Figura 2A. Anche se non è ancora chiaro perché il picco tre ospita spesso farnesylated-only KRAS4b oltre al desiderato farnesylated e carboxymethylated KRAS4b, la scarsa risoluzione che altri hanno riportato con resine CEX alternative (comunicazione personale) suggerisce che questo fenomeno non è solo il risultato di interazioni ioniche.
I rendimenti tipici variavano da 1 a 6 mg/L, con 3-5 mg/L ottenuti frequentemente (>90%, n > 50). L'analisi di massa intatta mediante ESI-MS ha confermato la massa molecolare precisa delle proteine e quindi la proporzione relativa di farnesilazione e/o carboxymetilation (Figura 3). Mentre i lotti finali tipici contenevano alcuni KRAS4b-FARN rilevabili, questa proporzione era inferiore al 15% in termini di altezza di picco da questa analisi. Figura 3A Mostra dati rappresentativi per KRAS4b che non è prenylated espresso in E. coli, Figura 3B Mostra KRAS4b-FMe eluito in picchi 3 e 5 da CEX, e Figura 3C Mostra KRAS4b-Farn eluito in picco 2 da CEX.
La massa del KRAS4b legata al PIL è stata determinata anche per questi campioni utilizzando l'analisi di massa nativa (Figura 3D). Lo scambio dei campioni in acetato di ammonio ha garantito una ionizzazione "più morbida" e il complesso nativo è rimasto intatto, fornendo conferma della natura del nucleotide legato a KRAS4b.
Per verificare che la farnesilazione e il carboxythylation siano necessari affinché KRAS4b-FMe si leghi alle membrane, abbiamo misurato l'interazione di KRAS4b-FMe ai liposomi tramite SPR. Come illustrato nella Figura 4,KRAS4b-FMe è legato ai liposomi mentre KRAS4b non elaborato, dimostrando in tal modo che KRAS4b-FMe elaborato è necessario per l'interazione con le membrane.
Figura 1: gel SDS-PAGE del processo di purificazione. (A) Cattura IMAC da lysato. FNTA/B sono le bande scure che migrano al numero 48 kDa e il His6-MBP-tev-KRAS4b è la banda scura migrando a 67 kDa dollari. M - scala di peso molecolare proteico; T - proteina totale; L - carico di lisatura/colonna chiarificato; F: scorrere la colonna. Le frazioni sono eluite con un crescente gradiente di concentrazione di imidazolo. (B) Le frazioni CEX etichettate 1–5 corrispondono alle frazioni massime dei picchi di eluizione mostrati nel cromatogramma della figura 2. (C) digestione TEV e secondo IMAC. C - piscina da CEX passo pre-TEV scissione; L - caricare il campione dopo la scissione post-TEV. Le specie di interesse sono etichettate. (D) Uno e cinque microgrammi di proteina KRAS4b-FMe finale. I gel raffigurati sono risultati rappresentativi di molteplici produzioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Profilo di eluizione della cromatografia CEX. (A) Il tipico profilo di elusione CEX ha da quattro a cinque picchi principali. A parte il picco 1, che in genere è una forma proteolizzata di KRAS4b non lavorata priva dei quattro aminoacidi terminali C, i quattro picchi numerati da 2 a 5 nel pannello derivano dalla variabilità nella lavorazione dei termini N e C della proteina, con molecole progressivamente più caricate elusi più avanti nel gradiente (vedi passo 1.15). (B) Ulteriori esempi di profili di eluzione CEX. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi intatta e nativa della spettrometria di massa delle proteine KRAS4b purificate. Spettro di massa intatto e risultati di analisi dei picchi deconvoluted per (A) KRAS4b non lavorato 2-185, previsto MW - 21.064; (B) KRAS4b 2-185-FMe, picchi 3 e 5 da CEX, previsto MW - 21.281; (C) KRAS4b 2-185-Farn, picco 2 da CEX, previsto MW - 21.267. (D) L'analisi del picco di massa nativa per E. coli ha espresso KRAS4b 2-185 (i), KRAS-FMe 2-185 (ii) e KRAS-Farn 2-185 (iii), tutti nello stato legato al PIL-nucleotide. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: rilegatura KRAS4b-FMe ai liposomi tramite SPR. Distribuzione delle dimensioni di 70:30 POPC:POPS liposomes ottenuti da DLS. (A) I dati DLS mostrano un diametro medio di 200 nm per i liposomi con una polidispersità del 18%. (B) I sensori di legame SPR da 60-0,6 M KRAS4b-FMe a 70:30 liposomi catturati su un chip SensorE L1. (C) L'adattamento degli isotermi vincolanti a stato costante derivanti dai dati SPR ha fornito un KD apparente di 1 -M di rilegatura KRAS4b-FMe ai liposomi. La risposta di rilegatura viene normalizzata dividendo per il livello di cattura della superficie dei liposomi. (D) Cinetica legante SPR da 60-0,6 M KRAS4b-2-185 a 70:30 liposomi catturati su un chip SensorE L1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Come indicato nella sezione Risultati rappresentativi, la fase più critica durante la purificazione è la gestione del campione durante il periodo in cui si trova nel sale inferiore. Limitare il tempo di esposizione del campione a meno di 200 mM NaCl contribuirà a ridurre le precipitazioni e ad aumentare la resa del campione. L'interpretazione dei risultati del CEX può essere difficile se il profilo non corrisponde alle aspettative (vedere figura 2). Fino a quando il protocollo non è diventato di routine, si consiglia di conservare le frazioni di eluizione CEX che non vengono portate in avanti a -80 gradi centigradi fino a quando l'analisi di massa intatta non sia stata completata per garantire che il materiale appropriato sia stato portato avanti. Al di fuori dei parametri sopra indicati per il passaggio CEX, il protocollo è relativamente facile da modificare ai passaggi lysi e IMAC. Vale anche la pena notare che non vi è alcuna fase di separazione di esclusione di dimensione (SEX) nel protocollo. Ciò è omesso a causa delle perdite che abbiamo osservato durante lo sviluppo iniziale del metodo (risultati non pubblicati). È interessante notare che queste perdite non sono osservate quando la proteina è in complesso con nanodischi, suggerendo che la perdita in assenza di lipidi è dovuta all'interazione idrofobica tra la proteina e la resina.
Questo metodo rappresenta un grande aumento sia della quantità (>10x superiore) che della qualità (rispetto al KRAS4b elaborato in buona fede espresso nelle cellule umane) riportato nella letteratura14,18,19. La resa di 3-5 mg/L ha permesso sforzi di biologia strutturale che richiedono elevati fabbisogni proteici16,20. Ulteriori modifiche post-traduzionali per altri membri della famiglia RAS, nonché ulteriori modifiche post-traduzionali in generale sono attualmente in fase di studio.
Per l'analisi di massa intatta di KRAS4b, una concentrazione di 0,1 mg/mL funziona bene. Concentrazioni più basse possono essere utilizzate a causa della capacità della configurazione proteica rilassata di accettare cariche. Tuttavia, nell'analisi di massa nativa, dove la proteina è nella sua conformazione piegata nativa, ci sono rapporti massa-carica più bassi e sono necessarie concentrazioni più elevate. Pertanto, l'utilizzo di concentrazioni più basse di proteine comporta una diminuzione del segnale e produce risultati meno affidabili. Il vantaggio della spettrometria di massa nativa è che il buffer è compatibile con la conservazione del complesso di nucleotidi legato a KRAS4b. Pertanto, è possibile confermare le forme legate ai nucleotidi delle proteine (Figura 3D). Come per qualsiasi analisi della spettrometria di massa, si osservano perdite neutre (come un gruppo metilico) (vedi specie minori con una perdita di 18 nell'analisi di massa intatta, Figura 3A–C). Nell'analisi della spettrometria di massa nativa, possono essere osservati addotti proteici con Na, oK, presenti dopo un ampio scambio di tamponamenti. Questo è evidente nei picchi minori di 23 dollari in Figura 3D, pannelli i-iii).
I nostri dati SPR (Figura 4) mostrano che la forma completamente elaborata di KRAS4b è necessaria per ricapitolare l'interazione KRAS4b-membrana in vitro. Un grande vantaggio dell'utilizzo del chip L1 per catturare i liposomi nei nostri esperimenti SPR è che la superficie del chip L1 è ricoperta e modificata con gruppi lipofili21,consentendo così la cattura diretta dei liposomi senza ulteriori modifiche. La SPR è una tecnica potente per studiare le interazioni ligando-ligando fornendo informazioni sulla stoichiometria e l'affinità vincolante. I sensorgrammi che funzionano correttamente dovrebbero avere una fase di associazione che raggiunge uno stato stabile. Questa risposta di associazione massima (Rmax) fornisce una stima della stoichiometria per l'interazione. Il tasso di dissociazione deve seguire un singolo decadimento esponenziale, presupponendo un'interazione di rilegatura 1:122. Tuttavia, le proteine che si legano a una superficie della membrana di solito si verificano con stoichiometrie più complesse23 e affinità multiple che si traducono in grammi di sensore con cinetica più complessa. Non siamo riusciti a adattare la cinetica a un modello di rilegatura multisito. Tuttavia, gli isotherm vincolanti dell'equilibrio possono essere adattati utilizzando un software di valutazione commerciale per fornire un'apparente affinità vincolante di equilibrio (KD). Indipendentemente da ciò, i nostri dati SPR distinguono chiaramente tra il modo in cui KRAS4b non elaborati e KRAS4b-FMe si legano ai liposomi. Pertanto, SPR fornisce ancora uno strumento utile per decifrare le interazioni proteina-lipidi.
Collettivamente, utilizzando SPR dimostriamo che KRAS4b-FMe completamente elaborato è necessario per il legame della membrana. La produzione della forma completamente farnesylalateed e carboxymethylated di KRAS4b utilizzando questo approccio fornisce la quantità e la qualità del materiale necessario per la biologia strutturale20, la caratterizzazione biofisica delle interazioni di membrana23e gli studi di screening contro il complesso KRAS4b-FMe:RAF in presenza di bistrati lipidici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Riconosciamo il supporto della clonazione e dell'espressione di Carissa Grose, Jen Melhalko e Matt Drew nel Protein Expression Laboratory, Frederick National Laboratory for Cancer Research. Questo progetto è stato finanziato in tutto o in parte con fondi federali del National Cancer Institute, National Institutes of Health, sotto contratto n. HHSN261200800001E. Il contenuto di questa pubblicazione non riflette necessariamente le opinioni o le politiche del Dipartimento della Salute e dei Servizi Umani, né menziona nomi commerciali, prodotti commerciali o organizzazioni implicano l'approvazione da parte del governo degli Stati Uniti
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural | Eppendorf | 22363204 | |
| 11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | AVANTI POLAR LIPIDS | 850457 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) | AVANTI POLAR LIPIDS | 840034 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 5427R Centrifuge | Eppendorf | ||
| Acetonitrile, HPLC Grade | Fisher Chemical | A998-1 1L | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| Argon gas | Airgas | ARUP | |
| Assay Plate 384 | CORNING | 3544 | |
| Biacore T200 Instrument | GE Healthcare | ||
| Blue Snap-It Seals, T/S | Thermo Scientific | C4011-54B | |
| Branson Ultrasonic Bath | Thermo Fisher | 15-336-1000 | |
| Cation Exchange Chromatography (CEX) column | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose High Performance |
| CHAPS | Sigma | C3023 | |
| Dyna Pro Plate Reader | Wyatt Technologies | ||
| Exactive Plus EMR Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500Ml | Use Reagent Grade or better |
| Gilson vials 7x14 mm Tubes | GE Healthcare | BR-1002-12 | |
| Glass screw thread vials with PTFE foam liners | Scientific Specialities | B69302 | |
| High speed/benchtop centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | capable of up to 4,000 xg |
| His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Addgene | 92414 | Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY |
| Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column | GE Healthcare Life Sciences | 28-9365-51 | HisPrep FF 16/10 |
| In-House Water Supply, Arium Advance | Sartorius Stedim | Resistivity of 18 MΩ0-cm | |
| Lipid extruder set with holder | AVANTI POLAR LIPIDS | 610023 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI-DEWAR | |
| M110-EH microfluidizer | Microfluidics | ||
| MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm | Thermo Scientific | 088645 | |
| MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mm | Thermo Scientific | 088790 | |
| MagTran software | Thermo Scientific | ||
| Methanol, HPLC Grade | VWR Chemicals | BDH20864.400 | |
| NGC Chromatography System | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 Chromatography system |
| Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators | Millipore Sigma | P8849 | |
| Rubber Caps type 3 | GE Healthcare | BR-1005-02 | |
| Series S Sensor Chip L1 | GE Healthcare | 29104993 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | 13-400-519 | Absorbace at 280nm |
| Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL | Millipore Sigma | UFC901008 | PES membrane |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters | Amicon | UFC501024 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima - L80K | capable of 100,000 xg |
| Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System) | Thermo Scientific | ||
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | |
| Water, HPLC Grade | Sigma-Aldrich | 270733-1L | May use in-house water source (see below) |
| Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter | GE Healthcare - Whatman | 6994-2504 | |
| Xcalibur QualBrowser | Thermo Scientific | proteomics software |
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