Summary
IL DNA FISH multicolore 3D rappresenta uno strumento per visualizzare più loci genomici all'interno dei nuclei 3D conservati, definendo inequivocabilmente le loro interazioni reciproche e la localizzazione all'interno dello spazio nucleare a livello di singola cellula. Qui, un protocollo passo dopo passo è descritto per un ampio spettro di cellule primarie umane.
Abstract
Una delle principali domande nella biologia cellulare è l'organizzazione genomica all'interno dello spazio nucleare e come l'architettura della cromatina possa influenzare processi come l'espressione genica, l'identità cellulare e la differenziazione. Molti approcci sviluppati per studiare l'architettura 3D del genoma possono essere suddivisi in due categorie complementari: tecnologie basate sulla cattura della conformazione cromosomica (tecnologie C) e imaging. Mentre il primo si basa sulla cattura della conformazione cromosomica e delle interazioni del DNA prossimale in una popolazione di cellule fisse, la seconda, basata sulla fluorescenza del DNA nell'ibridazione situ (FISH) su nuclei conservati in 3D, consente la visualizzazione contemporanea più loci a livello di singola cellula (multicolore), esaminando le loro interazioni e la distribuzione all'interno del nucleo (3D DNA multicolore FISH). La tecnica del DNA FISH multicolore 3D ha una limitazione di visualizzare solo pochi loci predeterminati, non permettendo un'analisi completa dell'architettura nucleare. Tuttavia, data la robustezza dei suoi risultati, 3D DNA FISH multicolore in combinazione con 3D-microscopia e ricostruzione dell'immagine è un possibile metodo per convalidare i risultati basati sulla tecnologia C e per studiare in modo inequivocabile la posizione e l'organizzazione di loci specifici a livello di singola cellula. Qui, proponiamo un metodo passo dopo passo di 3D multicolore DNA FISH adatto per una vasta gamma di cellule primarie umane e discutere tutte le azioni pratiche, passaggi cruciali, nozioni di imaging 3D e analisi dei dati necessari per ottenere un multicolore 3D di successo e informativo DNA FISH all'interno di diversi contesti biologici.
Introduction
Gli eucarioti più alti devono condensare e compattare sistematicamente un'enorme quantità di informazioni genetiche nel minuto spazio 3D del nucleo1,2,3,4. Oggi sappiamo che il genoma è spazialmente ordinato in compartimenti e domini topologicamente associati5 e che i molteplici livelli di riduzione del DNA generano contatti tra diverse regioni genomiche che possono comportare la formazione di loop della cromatina6,7. Il loop dinamico 3D della cromatina può influenzare molti processi biologici diversi come la trascrizione8,9, la differenziazione e lo sviluppo10,11, riparazione del DNA12,13, mentre le sue perturbazioni sono coinvolte in varie malattie14,15,16 e difetti dello sviluppo15,17,18.
Molti approcci sono stati sviluppati per studiare l'organizzazione del genoma 3D. Tecnologie basate sulla conformazione cromosomica (tecnologie C, 3C, 4C, 5C, Hi-C e derivati) sono state sviluppate per studiare l'organizzazione del genoma nelle cellule fisse3,4,19,20. Tali approcci si basano sulla capacità di catturare le frequenze di contatto tra loci genomici in prossimità fisica. Le tecnologie C, a seconda della loro complessità, catturano l'organizzazione globale del genoma 3D e la topologia nucleare di una popolazione cellulare3,4,19,20. Tuttavia, le interazioni 3D sono dinamiche nel tempo e nello spazio, altamente variabili tra singole cellule costituite da interazioni multiplex, e sono ampiamente eterogenee21,22.
La fluorescenza 3D multicolore del DNA nell'ibridazione situ (FISH) è una tecnica che consente la visualizzazione di loci genomici specifici a livello di singola cellula, consentendo lo studio diretto dell'architettura nucleare 3D in modo complementare alle tecnologie C. Rappresenta una tecnologia attualmente utilizzata per convalidare in modo inequivocabile i risultati C. IL DNA FISH multicolore 3D utilizza sonde etichettate fluorescentmente complementari ai loci genomici di interessi. L'uso di diversi fluorofori e attrezzature di microscopia idonee consentono la visualizzazione contemporanea di più obiettivi all'interno dello spazio nucleare23,24. Negli ultimi anni, FISH è stato combinato con i progressi tecnologici nella microscopia per ottenere la visualizzazione di strutture su scala fine ad alta risoluzione25,26 o con approcci CRISPR-Cas per la visualizzazione degli acidi nucleici nell'imaging dal vivo27,28. Nonostante l'ampia adozione, l'approccio 3D multicolore DNA FISH è ancora considerato difficile in molti laboratori perché il materiale biologico utilizzato deve essere adattato.
Qui, forniamo un protocollo completo per il DNA FISH multicolore 3D (dalla preparazione di cellule/sonde all'analisi dei dati) applicabile a un'ampia gamma di cellule primarie umane, consentendo la visualizzazione di più loci genomici e preservando la struttura 3D dei nuclei. Per studiare l'architettura nucleare, la struttura 3D dei nuclei deve essere preservata. Per questo motivo, a differenza di altri protocolli esistenti29,30,31, evitiamo l'uso di un gradiente di alcol e lo stoccaggio dei copricapi nell'alcool che possono influenzare la struttura della cromatina32. Il metodo è adattato dai protocolli 3D DNA FISH conservati24,33 da applicare a una vasta gamma di cellule primarie umane, sia isolate ex vivo che coltivate in vitro. Ci sono parametri di permeabilizzazione e deproteinizzazione per diverse morfologia nucleare e caratteristiche citologiche (ad esempio, diversi gradi di compattazione nucleare, abbondanza di citoscheletri)34. Questi parametri sono spesso generalmente descritti in altri protocolli24,33, senza fornire una chiara discriminazione della procedura all'interno di diversi tipi di cellule. Inoltre, abbiamo sviluppato uno strumento specifico chiamato NuCLsD (localizzatore di contatti nucleari in 3D)16, fornendo principi per l'analisi dei dati che miglioreranno la vicinanza 3D tra diversi loci e la loro distribuzione topologica nucleare all'interno dello spazio nucleare in modo automatizzato.
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Protocol
1. Procedure di preparazione ed etichettatura della sonda del DNA con traduzione nick
- Purificare e pulire i cromosomi artificiali batterici (BAC), plasmidi o prodotti PCR con kit specifici (Tabella dei materiali), risospendere in ddH2O, controllare per elettroforesi su un gel di agarose e quantificare.
- Eseguire la traslazione del nick su 1,5,5 g di DNA dal punto 1,1 in un volume finale di 50 gradi, mescolando tutti i reagenti in un tubo DNA a bassa legatura di 0,5 mL secondo la tabella 1.
NOTA: le sonde etichettate direttamente possono migliorare il rapporto segnale/rumore. Sono disponibili in commercio in commercio kit per la produzione indiretta e diretta di sonde con vari fluorocrodi Alexa. - Incubare la miscela di traduzione nick in un mixer termico a 16 gradi centigradi per un certo tempo a seconda della lunghezza del materiale DNA iniziale: 45 min per i prodotti PCR (un pool di prodotti PCR di 2.000 bp ciascuno) e fino a 4 h per IL DNA BAC e i plasmidi.
- Controllare le dimensioni delle sonde prodotte al passaggio 1.3 mediante elettroforesi su un gel di agarose del 2,2%.
NOTA: la dimensione ottimale del probe è <200 bp (Figura 1A).- Se il DNA non viene digerito abbastanza, aggiungere 5 U di DNA polymerase I e 0.05 U di DNase I alla reazione e incubare per 1/2 h a 16 gradi centigradi e successivamente ricontrollare. Interrompere la reazione con 0,5 m EDTA (concentrazione finale). Conservare le sonde a -20 gradi centigradi.
- Per ogni esperimento DNA FISH, far precipitare le seguenti quantità di sonde a seconda del materiale DNA iniziale da cui vengono prodotte le sonde: 200 ng da prodotti PCR tradotti in nick, 100 ng da NICK tradotti AC o 300 ng da plasmide tradotte nick. Aggiungere ddH2O fino a 150 gradi l, 20 g di DNA di spermatozoi di salmone non etichettato, 3,5 g di DNA Cot-1 specifico per specie, 3 volumi di 100% EtOH e un volume di 3 M di acetato di sodio pH 5.2. Precipitare a -80 gradi centigradi per 1 ora.
- Centrifuga alla massima velocità per 1 h a 4 gradi centigradi e scartare il supernatante. Lavare il pellet due volte con il 70% EtOH.
- Risospendere il pellet in 2 o L di 100% formamide pH 7,0, agitare a 40 gradi centigradi per 30 min (può richiedere fino a poche ore) e quindi aggiungere un volume uguale di 4x di citrato salina-sodio (SSC)/20% dextransofato.
- Preparare 20 volte SSC mescolando 175,3 g di NaCl e 88,2 g di citrato di sodio in un volume finale di 1 L di H2aliquota, filtrare e preparare.
NOTA: Per DNA FISH multicolore, le diverse sonde possono essere precipitate insieme ad eccezione delle sonde che possono anneal tra loro. In questi casi specifici, trattarli separatamente, precipitare e risospendere le sonde che dividono i reagenti menzionati nei passaggi 1.5-1.7 rispetto al numero di sonde. Raggruppare le sonde solo dopo la sospensione in formamide. Se si utilizzano copricapi di vetro con dimensioni maggiori di 10 mm o inferiori a 10 mm, scalare il volume verso l'alto o verso il basso dei reagenti utilizzati nei passaggi 1,5,1,7 in modo proporzionale alla dimensione della diapositiva. Le sonde di ibridazione possono essere conservate a -20 gradi centigradi per un lungo periodo di tempo (fino a due mesi).
- Preparare 20 volte SSC mescolando 175,3 g di NaCl e 88,2 g di citrato di sodio in un volume finale di 1 L di H2aliquota, filtrare e preparare.
2. Fissazione cellulare, pretrattamento e permeabilizzazione
NOTA: I passaggi di permeabilizzazione e deproteinizzazione sono passi cruciali. Il tempo di reazione e concentrazione dei reagenti dipende fortemente dal tipo di cellula, dall'abbondanza di citoplasma e dalla morfologia nucleare.
- Fissazione cellulare, pretrattamento e permeabilizzazione per i linfociti T primari dell'uomo
NOTA: Questo protocollo è adatto per piccole cellule, con piccoli nuclei e una bassa quantità di citoplasma.- Utilizzare coprivele in vetro (10 mm, spessore no. 1,5H).
- Lavare il bicchiere con ddH2O, quindi con il 70% EtOH e lasciarli asciugare. Utilizzare un bicchiere per ogni pozzetto di una piastra di 24 pozzetti.
- Aggiungere 200 L di 0,1% poli-L-lisina (w/v) (Tabella dei materiali) direttamente sul vetro per formare una goccia. Prestare attenzione come la goccia deve rimanere sulla superficie del vetro senza toccare il pozzo per 2/5 min. Lasciare fuori la goccia con attenzione, e lasciare asciugare il vetro per 30 min.
- Eseguire il passaggio 2.1.3 altre due volte.
- Mettere 200 - L di celle di sospensione (2 x 106/ mL, sospensione PBS dei linfociti A T primari osisti ex vivo) direttamente sul vetro, consentire alle cellule di seme a temperatura ambiente (RT) per 30 min.
- Rimuovere rapidamente la goccia. Aggiungere il 4% di PFA appena fatto (preparato in PBS/0.1% TWEEN 20, pH 7.0, filtrato) per 10 min e fissare le celle di semi a RT.
- Lavare tre volte per 5 min ciascuno con 0,05% Triton X-100/PBS (TPBS) a RT. Permeabilize con 0.5% TPBS per 10 min a RT.
- Eseguire il trattamento RNase aggiungendo 2,5 - L di cocktail RNase (Tabella dei materiali) in 250 - L di PBS/pozzo in una piastra di 24 pozze per 1 h a 37 gradi centigradi.
- Risciacquare in PBS, aggiungere il 20% glicerol/PBS e incubare durante la notte (ON) a 4 gradi centigradi.
NOTA: questo passaggio può variare da 1 h a ON. I vetrini possono essere conservati in 20% glicerol/PBS a 4 gradi centigradi fino a 7 giorni. - Congelare sul ghiaccio secco (15-30 s), scongelare gradualmente a RT, e immergere nel 20% glicerolo/PBS. Ripetere il passaggio 2.1.9 altre tre volte.
- Lavare in 0,5% TPBS per 5 min a RT. Lavaggio in 0,05% TPBS, due volte per 5 min a RT. Incubate in 0,1 N HCl per 12 min a RT. Rinse in 2x SSC.
- Incubare nel 50% formamide pH 7.0/2x SSC ON a RT.
NOTA: il tempo di incubazione può essere ottimizzato e alla fine ridotto. I vetrini possono essere conservati in formamide 50% /2x SSC per diversi giorni.
- Fissazione cellulare, pretrattamento e permeabilizzazione per i mioblasti primari umani
NOTA: Questo protocollo è adatto per le cellule di grandi dimensioni, con un'elevata quantità di citoplasma.- Coltivare mioblasti primari umani direttamente sui bicchieri coverslip in piastre 24 pozzetti nel mezzo di crescita (Mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM), 20% siero bovino fetale (FBS), 25 ng/mL fattore di crescita fibroblasta (FGF), 10 ng/mLdermica fattore di crescita epidermica (EGF), 10 g/mL di insulina umana, 1x glutammina, 1x penicillina/streptomicina) per almeno 24 h (raggiungendo il 50-70% della confluenza).
NOTA: Per facilitare l'adesione, la gelatina o il collagene o la poli-lisina può essere utilizzata per rivestire il coperchio prima della semazione. - Risciacquare le cellule in 2-3 cambi di PBS. Aggiungere il 4% di PFA appena fatto e fissare le celle per 10 min a RT.
- Lavare tre volte per 3 min ciascuno nello 0,01% TPBS a RT. Permeabilize in 0.5% TPBS per 10 min a RT.
- Eseguire il trattamento RNase aggiungendo 2,5 - L di cocktail RNase (Tabella dei materiali) in 250 - L di PBS/pozzo in una piastra di 24 pozze per 1 h a 37 gradi centigradi.
- Risciacquare in PBS, aggiungere il 20% glicerol/PBS e incubare ON a RT.
NOTA: questo passaggio può variare da 1 h a ON. I vetrini possono essere conservati in 20% glicerol/PBS a 4 gradi centigradi fino a 7 giorni. - Congelare sul ghiaccio secco (15-30 s), scongelare gradualmente a RT, e immergere nel 20% glicerolo/PBS. Ripetere questo passaggio tre volte.
- Lavare tre volte per 10 min ciascuno in PBS. Incubare in 0.1 N HCl per 5 min a RT. Risciacquare in 2x SSC.
- Incubare nel 50% formamide pH 7.0/2x SSC ON a RT.
NOTA: il tempo di incubazione può essere ottimizzato e alla fine ridotto. I vetrini possono essere conservati in formamide 50% /2x SSC per diversi giorni. - Vetrine Equilibrate (conservate al 50% formamide/2x SSC) in 2x SSC per 2 min. Quindi, equilibrate in PBS per 3 min.
- Trattare con 0.01 N HCl/ 0.0025% pepsina da pochi secondi fino a 5 min, a seconda del tipo di cella. Durante questa fase, osservare le cellule al microscopio ottico e interrompere la reazione (passaggio 2.2.11) non appena i nuclei sono liberi dal citoplasma, mantenendo intatta la loro struttura (ad esempio, i nucleoli sono ancora visibili e intatti).
- Inattivare la pepsina lavando due volte per 5 min ciascuno in 50 mM MgCl2/PBS.
- Post-fix in 1% PFA/PBS per 1 min. Lavaggio per 5 min in PBS. Lavare due volte per 5 min ciascuno in 2x SSC, quindi aggiungere 50% formamide/2x SSC per almeno 30 min.
- Coltivare mioblasti primari umani direttamente sui bicchieri coverslip in piastre 24 pozzetti nel mezzo di crescita (Mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM), 20% siero bovino fetale (FBS), 25 ng/mL fattore di crescita fibroblasta (FGF), 10 ng/mLdermica fattore di crescita epidermica (EGF), 10 g/mL di insulina umana, 1x glutammina, 1x penicillina/streptomicina) per almeno 24 h (raggiungendo il 50-70% della confluenza).
3. Ibridazione DNA FISH multicolore 3D
- Denaturare le sonde a 80 gradi centigradi per 5 min, quindi mettere rapidamente sul ghiaccio.
- Caricare le sonde di ibridazione su un vetrino al microscopio pulito. Ruotare il coperchio con le celle a testa in giù sulla goccia di sonde di ibridazione.
- Sigillare il coperchio con cemento di gomma. Lasciare asciugare completamente il cemento di gomma. Quindi posizionare i vetrini su un blocco di riscaldamento e denaturare a 75 gradi centigradi per 4 min.
NOTA: I tempi di denaturazione e la temperatura di denaturazione possono essere aumentati, fino a 80 gradi centigradi. - Ibridare a 37 gradi centigradi in una scatola metallica galleggiante in un bagno d'acqua.
NOTA: Per migliorare il rapporto segnale/rumore, la temperatura di ibridazione può salire fino a 42 gradi centigradi. - Sbucciare il cemento di gomma, immergere i vetrini in 2x SCC, togliere la coverslip di vetro e trasferirlo a 2x SSC in 6 pozzetti.
- Lavare in 2x SSC tre volte per 5 min ciascuno a 37 gradi centigradi, agitando a 90 giri al rinfuso in uno shaker incubatore. Lavare in 0,1 x SSC tre volte per 5 min ciascuno a 60 gradi centigradi, agitando a 90 giri in uno shaker incubatore. Risciacquare brevemente in 4x SSC/0.2% TWEEN 20.
4. Rilevamento DNA FISH multicolore 3D
NOTA: per le sonde etichettate direttamente, saltare i passaggi 4.1 e 4.2.
- Blocco in 4x SSC/0,2% TWEEN 20/4% di albumina di siero bovino (BSA) per 20 min a 37 gradi centigradi in un piatto di 24 pozzetti, tremando a 20 giri in uno shaker incubatore.
- Incubare con l'adeguata concentrazione di anti-digoxygenina (1:150) e/o streptavidin (1:1.000) (Tabella dei materiali) diluiti in 4x SSC/0,2% TWEEN 20/4% BSA per 35 min in una camera buia e umida a 37 gradi centigradi.
- Lavare in 4x SSC/0,2% TWEEN 20 tre volte per 5 min ciascuno a 37 gradi centigradi, agitando a 90 giri in una piastra 6-well in uno shaker di incubatrice.
- Equilibrio in PBS e post-fisso in 2% formaldeide/PBS per 2 min a RT in una piastra di 24 pozze.
NOTA: le sonde etichettate direttamente non necessitano di post-fissazione. - Lavare brevemente 5 volte in PBS. Macchie con 1 ng/mL DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)/PBS per 5 min a RT.
- Lavare brevemente 5 volte in PBS. Monta con soluzione anti-dissolvenza (Tabella dei materiali).
5. Microscopia e analisi 3D multicolore DNA FISH
- Acquisire immagini 3D con un sistema al microscopio.
NOTA: In questo caso, viene utilizzato un microscopio a più ampio campo con una distanza assiale di 0,2 m 0,25 m tra sezioni consecutive (Figura 1B). - Analizza gli stack di immagini 3D utilizzando diversi software e strumenti (qui, NuCL- d o Nuclear Contacts Locator in 3D).
NOTA: L'utensile NuCL- D è stato sviluppato al fine di analizzare automaticamente 3D multicolore DNA FISH in immagine cella di fluorescenza immagine z-stack. NuCL- ricostruisce i nuclei dagli stack di immagini delle cellule in 3D, nonché rileva e localizza i punti 3D fluorescenti. Misura il posizionamento relativo dei punti nel nucleo (ad esempio, la distanza dal centroide dei nuclei e/o della periferia dei nuclei) e il raggio massimo per ogni nucleo e le distanze tra macchie. Lo strumento e l'algoritmo utilizzato sono descritti completamente in Cortesi et al.16. - Analizzare i dati (ad es. distanze 3D tra i loci genomici specificati e il centroide nucleare e le frequenze di contatto) recuperati da NuCL.
NOTA: per le distanze 3D tra i loci genomici specificati e il centroide nucleare, normalizzare le distanze sul raggio massimo per ogni nucleo e rappresentare questi dati come distribuzioni di frequenza delle distanze normalizzate dal centroide nucleare. Per gli studi sulle interazioni a lungo raggio, le frequenze di contatto dovrebbero essere nell'intervallo del 10-20%21 con una soglia inter-distanza che può variare e può essere messa intorno a 2 m35.- Per eseguire analisi statistiche, analizzare circa 100 nuclei per replica biologica. Rappresentano le distanze 3D tra i loci genomici specificati come distribuzioni cumulative di frequenza delle distanze che si trovano al di sotto della soglia inter-distanza selezionata e utilizzano un test tper valutare l'importanza delle differenze nelle distribuzioni. Inoltre, calcola la percentuale di nuclei positivi per le interazioni che sono al di sotto della soglia inter-distanza selezionata e usa il test esatto di Fisher per valutare il significato delle differenze nelle percentuali.
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Representative Results
Il metodo del DNA FISH multicolore 3D descritto in questo articolo consente la visualizzazione contemporanea di diversi loci genomici all'interno dei nuclei 3D conservati (Figura 1B). Questo protocollo consente la misurazione delle distanze tra gli alleli e dei diversi loci genomici per valutarne la vicinanza spaziale e per valutarne la posizione all'interno dello spazio nucleare (ad esempio, la distanza loci dal centroide o dalla periferia dei nuclei)16. Tuttavia, ci sono molti passaggi cruciali che devono essere impostati in modo accurato e specifico per ogni tipo di cella utilizzato; si raccomanda vivamente di prestare particolare attenzione ai seguenti passaggi per il successo del DNA FISH multicolore 3D.
Per la preparazione del probe DNA, verificare che le dimensioni della sonda sia di <200 bp (Figura 1A). Questa dimensione garantisce una procedura di successo di 3D multicolore DNA FISH (Figura 1B). Le sonde non ottimali di DNA FISH prodotte dalla traduzione nick possono essere parzialmente digerite (Figura 2A) o sovradigerite (Figura 2B). Con sonde parzialmente digerite, la procedura non avrà alcun segnale nelle cellule, a causa dell'incapacità della sonda di entrare nei nuclei e di ibridarsi correttamente ai loci genomici complementari. Le sonde digerite eccessivamente si tradurrà in un segnale non specifico, a causa di una perdita di specificità nell'ibridazione e di un conseguente aumento dello sfondo. Un esempio rappresentativo di probe sovra digerito è illustrato nella Figura 3A rispetto a un probe digerito ottimale in Figura 3B.
Per la deproteinizzazione e la pepsinizzazione, seguire questi passaggi in base al tipo di cellula. In particolare, prendere in considerazione le dimensioni nucleari e l'abbondanza di citoplasma. Per i linfociti e le cellule T isolate ex vivo umane con nuclei piccoli e altamente compattati e ctotoplasma a basso abbondante abbondante, la deproteinizzazione dell'HCl è fondamentale. Il trattamento con 0,1 N HCl per 5 min non è sufficiente per la visualizzazione di DNA FISH. Si raccomanda il trattamento n H HCl per 12 min per promuovere l'accessibilità dei nuclei alle sonde del DNA e preservare l'integrità nucleare(Figura 4A). La digestione della pepsina del citoplasma non è necessaria per ottenere un buon segnale di DNA FISH (Figura 4B).
Per i mioblasti e le cellule primarie umane che hanno grandi nuclei e citoplasma abbondante, la fase di pepsinizzazione è fondamentale. Una pepsinizzazione breve e non ottimale del citoscheletro ostacolerà l'ingresso della sonda nei nuclei (Figura 4C), terminando in assenza di un segnale DNA FISH. Tuttavia, se le cellule sono sovrapepizzate, i nuclei non rimarranno intatti (Figura 4D), perdendo la loro struttura 3D. Un esempio di successo 3D multicolore DNA FISH è fornito in Figura 4E.
Durante l'ibridazione, sigillare accuratamente lo scivolone; in caso contrario, la sonda si disperderà e si asciugherà. Le fasi di denaturazione e ibridazione devono essere eseguite rapidamente in modo che la sonda e il DNA genomico non siano reanneali. La durata della denaturazione può essere aumentata.
Figura 1: Sonde di DNA rappresentative e DNA FISH multicolore 3D. (A) Nick ha tradotto sonde di DNA di dimensioni ottimali eseguite su un gel di agarose del 2,2% (corsia 1, 2), marcatore 50 bp (M). (( B) Rappresentante 3D multicolore DNA FISH nucleus utilizzando sonde mappaturo a 3q11.2 regione (verde), 10q26.3 regione (rosso) e 8q24.13 regione (magenta) in mioblasti primari umani. I nuclei sono controordinati con DAPI (blu). Ingrandimento 63x. Barra di scala - 5 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Esempi di sonde DNA FISH non digerite in modo ottimale. (A) Le sonde di DNA tradotte in nick non digerite (corsia 1, 2) o parzialmente digerite (corsia 3) vengono eseguite su un gel di agarose del 2,2%, marcatore 2log (M). (B) Le sonde di DNA tradotte in nick tradotte sovradigerite vengono eseguite su un gel di agarose del 2,2%, marcatore 2log (M). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Confronto di DNA FISH multicolore 3D utilizzando sonde DNA FISH non ottimali o ottimali. (A) Rappresentante 3D multicolore DNA FISH nuclei utilizzando la mappatura della sonda over digest ed 8q24.13 regione (magenta) in mioblasti primari umani. I nuclei sono controordinati con DAPI (blu). Ingrandimento 63x. Barra della scala (B) Rappresentante 3D multicolore DNA FISH nuclei utilizzando la mappatura della sonda digerito in modo ottimale a 8q24.13 regione (magenta) in mioblasti primari umani. I nuclei sono controordinati con DAPI (blu). Ingrandimento 63x. Barra di scala : 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Possibili esiti delle misure di deproteinizzazione e pepsinizzazione non ottimali sui risultati 3D multicolore DNA FISH. (A) Rappresentante 3D DNA multicolore FISH nuclei di linfociti T primari umani trattati per 5 min (sinistra) o 12 min (destra) con 0.1 N HCl, utilizzando la mappatura sonda a 8q24.13 regione (verde). I nuclei sono controordinati con DAPI (blu). 100 volte l'ingrandimento. Barra di scala (B) Rappresentante 3D DNA multicolore DNA FISH nuclei di linfociti T primari umani trattati per 12 min con 0,1 N HCl (sinistra) o accoppiati con 0.01 N HCl/0.0025% pepsina per 2 min (a destra), utilizzando la mappatura sonda a 8q24.13 regione (verde). I nuclei sono controordinati con DAPI (blu). 100 volte l'ingrandimento. Barra di scala - 10 m. (C) Rappresentante 3D DNA multicolore CAMPI di mioni primari umani trattati con breve e non ottimale pepsinizzazione, utilizzando la mappatura della sonda a 8q24.13 regione (magenta). I nuclei sono controordinati con DAPI (blu). Ingrandimento 63x. Barra di scala - 10 m. (D) Rappresentante 3D multicolore DNA FISH nuclei di mioni primari umani trattati con fase di pepsinizzazione prolungata, utilizzando la mappatura della sonda a 8q24.13 regione (magenta). I nuclei sono controordinati con DAPI (blu). Ingrandimento 63x. Barra di scala - 5 m. (E) Rappresentante 3D DNA multicolore FISH nuclei di mioblasti primari umani trattati con condizioni ottimali HCl/ pepsina utilizzando la mappatura della sonda a 8q24.13 regione (magenta). I nuclei sono controordinati con DAPI (blu). Ingrandimento 63x. Barra di scala : 25 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Reagenti di traduzione Nick | Concentrazione iniziale | Concentrazione finale |
| dNTP (C-G-A) | 0,5 mM | 0,05 mM |
| dTTP (in stato di inademazione) | 0,1 mM | 0,01 mM |
| Biotina/Dig/Cy3 dUTP | 1 mM | 0,02 mM |
| Tris HCl pH 7.8 | 1 M | 50mm |
| MgCl2 | 100 mM | 5 mM |
| -mercaptoetanolo | 100 mM | 10 mM |
| Bsa | 100 ng/L | 10 ng/L |
| DNA Pol I | 10 U/L | 0,1 U/L |
| DNase I | 1 U/L | 0,002 U/L |
| DNA 2 g | X | X |
| ddH2O | Fino a 50 l |
Tabella 1: Traduzione Nick. Tabella che descrive tutti i reagenti, la loro concentrazione e i tempi suggeriti per la reazione alla traduzione nick.
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Discussion
Il metodo attuale descrive un protocollo passo dopo passo per eseguire DNA FISH multicolore 3D su una vasta gamma di cellule primarie umane. Anche se DNA FISH è una tecnologia di ampio uso, 3D multicolore DNA FISH su nuclei interfase 3D conservati è ancora difficile da eseguire in molti laboratori, principalmente a causa delle caratteristiche dei campioni utilizzati23,24.
La traduzione di nick probe è un passo fondamentale per il successo 3D multicolore DNA FISH; molti substrati diversi (BAC, fosmid, plasmide, prodotti PCR) possono essere utilizzati per questa reazione, e la tempistica della reazione e della concentrazione di enzimi può essere regolata di conseguenza rispetto alla lunghezza del substrato. Una corretta digestione del probe è fondamentale (Figura 1), poiché le sonde non ottimali (Figura 2) non genereranno alcun segnale o un segnale non specifico (Figura 3A). La permeabilizzazione, la deproteinizzazione e i passi di pepsinizzazione sono passaggi cruciali che dipendono fortemente dal tipo di cellula utilizzata. Le cellule con piccoli nuclei e bassa abbondanza di citoscheletro, come i linfociti T ex vivo, richiedono deproteinizzazione con un trattamento prolungato di 0,1 N H HCl. Inoltre, i fusi in PBS con percentuali più elevate di Triton X-100 possono aiutare l'ingresso della sonda nei nuclei di queste cellule. Al contrario, i mioblasti primari umani coltivati in vitro che presentano nuclei più grandi, con un alto contenuto di citoscheletro, hanno bisogno di digestione delle strutture citosoliche con pepsina. Questi ruoli generali possono essere applicati a un'ampia gamma di celle, combinando infine i diversi passaggi a seconda delle caratteristiche cellulari specifiche.
Si suggerisce fortemente l'uso di materiale biologico appena preparato, di soluzioni fresche (in particolare di soluzioni con detergenti) e di reagenti fluorescenti: PFA filtrato al pH 7.0; autoclaved e filtrato 20x SSC a pH 7.0; formamide filtrata a pH 7.0; acqua priva di nuclea; e aliquote usa e getta dell'UTP modificato. L'incubazione prolungata con 20% glicerol/PBS, o 50% formamide/2x SSC può facilitare l'ibridazione. Il trattamento con HCl e/o pepsina può essere ulteriormente aumentato. La tempistica dell'ibridazione, la quantità di sonde, la concentrazione e la tempistica di incubazione dell'anti-digossigenina e dello streptavidina possono essere ulteriormente regolate per migliorare il rapporto segnale-rumore.
IL DNA FISH multicolore 3D rappresenta uno strumento complementare alle tecnologie C, il metodo standard per convalidare i risultati basati su C. Se combinato con la microscopia e l'analisi 3D, 3D multicolore DNA FISH può monitorare la vicinanza tra i loci genomici e la loro distribuzione topologica all'interno dello spazio nucleare a livello di singola cellula. Il DNA FISH multicolore 3D può essere ulteriormente integrato con altre metodologie come RNA FISH e immunofluorescenza per una panoramica completa delle dinamiche e delle interazioni tra loci genomici, RNA (RNA messaggero o RNA non codificante regolatore) e un'ampia gamma proteine, fornendo un'opportunità unica per visualizzare la struttura nucleare e studiare i meccanismi epigenetici che subtendono l'identità cellulare.
Nonostante l'enorme miglioramento delle tecnologie FISH con super risoluzione25,26, live cell imaging27,28,36, rilevamento di singole molecole37, e la visualizzazione contemporanea di più obiettivi con array oligonucleotidi come Oligopaint37,38 con 3D approcci ad alto rendimento39, una limitazione della tecnologia rimane il numero discreto di loci genomico predeterminato che può essere visualizzati. Ciò impedisce un'ampia analisi dell'architettura nucleare. Diversi studi hanno recentemente descritto metodi sequenziali di ibridazione per affrontare l'organizzazione del genoma in singole cellule come il codice a barre DNA FISH40,41,42,43. Saranno necessari ulteriori sforzi per accoppiare la natura a singola cellula di DNA FISH multicolore 3D a ampie caratteristiche del genoma per visualizzare ampiamente l'eterogeneità dell'architettura nucleare con le tecnologie di imaging, poiché il numero di loci che possono essere testati in un momento aumenterà.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono l'assistenza tecnica dello strumento di imaging INGM (Istituto Nazionale di Genetica", "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM), Milano, Italia), in particolare C. Cordiglieri, per assistenza nell'arte 3D multicolore DNA FISH Acquisizione. Questo lavoro è stato sostenuto dalle seguenti sovvenzioni a B.B.: programma di punta italiano EPIGEN, Associazione Francese contre les Myopathies (AFM-Telethon, grant nr 18754) e GiovaniI, Ministero della Sanità Italiano (GR-2011-02349383). Questo lavoro è stato sostenuto dalla seguente sovvenzione a F.M.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, grant nr 2018-0321).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Anti-Digoxigenin 488 | DBA | DI7488 | |
| b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bFGF | PeproTech | 100-18B | |
| Biotin 11 d-UTP | Thermo Fisher Scientific | R0081 | |
| BSA (bovine serum albumine) | Sigma | A7030 | |
| Coverlsips | Marienfeld | 117500 | |
| CY3 d-UTP | GE Healthcare | PA53022 | |
| DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D21490 | |
| Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes | Sigma | D7656 | |
| Dextran sulfate (powder) | Santa Cruz | sc-203917A | |
| Digoxigenin 11 d-UTP | Roche | 11093088910 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 21969-035 500mL | |
| DNA polymerase I | Thermo Fisher Scientific | 18010-017 | |
| DNase I | Sigma | AMPD1 | |
| dNTPs (C-G-A-T) | Euroclone | BL0423A/C/G | |
| EGF | Sigma | E9644.2MG | |
| Ethanol | Sigma | 02860-1L | |
| FBS Hyclone | Thermo Fisher Scientific | SH30109 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-25mL | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Glutammine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516-100mL | |
| Glycogen | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | |
| HCl | Sigma | 30721 | |
| Human Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279-001 | |
| Insulin Human | Sigma | I9278-5 mL | |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) | Sigma | S2889 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-25G | |
| PBS (phosphate-buffered saline) | Sigma | P4417 | |
| Pennycillin/Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 100mL | |
| Pepsin | Biorad | P6887 | |
| PhasePrep BAC DNA Kit | Sigma | NA0100-1KT | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | |
| PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific | K220001 | |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | |
| RNAse cocktail | Thermo Fisher Scientific | AM2288 | |
| Rubbercement | Bostik | ||
| Slides | VWR | 631-0114 | |
| Streptavidina Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | S21374 | |
| Tri-Sodium Citrate | Sigma | 1110379026 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500g | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250mL | |
| TWEEN 20 | Sigma | P9416-100mL |
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