Summary
이 문서는 필로카핀 유도 간질 마우스에 있는 기억 손상을 평가하기 위한 실험적인 절차를 제출합니다. 이 프로토콜은 간질에 있는 일반적인 comorbidities의 한개인 간질 관련한 인식 쇠퇴의 병리생리학 기계장치를 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다.
Abstract
인지 장애는 측두엽 간질에서 가장 흔한 동반기능 중 하나입니다. 간질의 동물 모델에서 간질 관련 인지 감소를 재현하기 위해, 우리는 필로카핀 처리 만성 간질 마우스를 생성했다. 우리는 이 간질 마우스를 사용하여 3개의 다른 행동 시험을 위한 프로토콜을 제시합니다: 새로운 객체 위치 (NL), 새로운 객체 인식 (NO), 및 패턴 분리 (PS) 시험은 장소, 객체 및 문맥에 대한 학습 및 기억을 각각 평가하기 위하여. 우리는 동물의 기저 운동 활동을 측정하는 개방 필드 테스트에 따라 행동 장치를 설정하고 NL, NO 및 PS 테스트에 대한 실험 절차를 제공하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 간질 마우스에 있는 기억 기능을 평가하기 위한 그밖 행동 시험에 관하여 NL, NO 및 PS 시험의 기술적인 이점을 기술합니다. 마지막으로, 우리는 성공적인 메모리 테스트를위한 중요한 단계인 친숙한 세션 동안 개체와 30 초의 좋은 접촉을하지 못하는 간질 마우스에 대한 가능한 원인과 해결책을 논의합니다. 따라서, 이 프로토콜은 마우스를 사용하여 간질 관련 기억 손상을 평가하는 방법에 대한 자세한 정보를 제공합니다. NL, NO 및 PS 시험은 간질 마우스에 있는 기억의 다른 종류의 평가에 적합한 간단하고 능률적인 분석입니다.
Introduction
간질은 자발적인 재발성발작을특징으로 하는 만성질환1,2,,3. 반복적 인 발작은 뇌의 구조적 및 기능적 이상을 일으킬 수 있기 때문에1,,2,,3,비정상적인 발작 활동은 가장 흔한 간질 관련 동반 작용 중 하나인 인지 기능 장애에 기여할 수 있습니다4,,5,,6. 일시적이고 일시적인 만성 발작 사건과는 달리, 인지 장애는 간질 환자의 삶 전반에 걸쳐 지속될 수 있으며 삶의 질을 악화시킬 수 있습니다. 따라서 간질과 관련된 인지 기능 저하의 병리 생리학적 메커니즘을 이해하는 것이 중요합니다.
간질의 다양한 실험 동물 모델은 만성 간질7,8,89,10,,9,11,,12와관련된 학습 및 기억 결핍을 입증하는 데 사용되어 왔다. 예를 들어, 모리스 물 미로, 상황별 공포 컨디셔닝, 홀 보드, 새로운 개체 위치 (NL), 및 새로운 개체 인식 (NO) 테스트는 자주 측두엽 간질에서 메모리 기능 장애를 평가하는 데 사용되었습니다 (TLE). 해마는 TLE가 병리학을 보여주는 1 차적인 지구의 한개이기 때문에, 해마 의존적인 기억 기능을 평가할 수 있는 행동 시험은 수시로 우선적으로 선택됩니다. 그러나, 발작이 비정상적인 해마 신경 발생을 유도하고 간질 관련 인지 감소에 기여할 수 있다는 점을 감안할때,신생아 신경 기능 (즉, 공간 패턴 분리, PS)8,,13은 또한 간질에서 기억 장애의 세포 메커니즘에 대한 귀중한 정보를 제공 할 수 있습니다.
이 문서에서는 간질 마우스에 대한 메모리 테스트, NL, NO 및 PS의 배터리를 보여 줍니다. 테스트는 간단하고 쉽게 접근할 수 있으며 정교한 시스템이 필요하지 않습니다.
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Protocol
모든 실험 절차는 가톨릭대학교 윤리위원회의 승인을 받았으며, 국립과학수사연구원의 실험실동물 관리 및 이용안내(NIH 간행물 제80-23호)에 따라 실시되었다.
1. 새로운 개체 위치 테스트 (NL)
- 간질 C57BL/6 또는 필로카핀 주사 후 4-6주 후에 형질전환 마우스를 준비하십시오.
참고: 급성 발작은 복강 내(IP) 필로카핀 주사에 의해 유도되었고, 이전 보고서14에상세히 설명된 프로토콜에 따라. - 행동 시험이 시작되기 하루 전에 사육실에서 행동 방으로 간질 마우스를 옮긴다. 마우스가 하룻밤 동안 적어도 12 시간 동안 습관화할 수 있도록 하십시오.
- 행동실에서 개별 마우스를 단일 하우징을 위한 새장으로 분리합니다. 케이지 카드에 각 동물에 대한 정보를 작성하고 행동 테스트 내내 동물을 동일한 케이지에 보관하십시오. 카트를 사용하여 여러 케이지를 동시에 전송할 수 있습니다.
- 다음날, 이른 아침에 3일간의 습관 세션(H1-H3)을 시작합니다. 동물을 홈 케이지의 저조도에 30분 이상 적응시킴.
- 44 x 44 x 31cm의 외부 치수와 43 x 43 x 30.5cm의 내부 치수로 열린 필드 상자를 준비합니다. 습관 (H1)의 첫 날에, 오픈 필드 상자의 중심에 조명계를 배치하고 60 럭스로 조도를 조정합니다.
- 70% 에탄올로 열린 필드 박스의 바닥과 벽에 스프레이하고 깨끗한 종이 타월로 닦아내면 가능한 후각 신호를 제거합니다. 그런 다음 잔류 알코올이 완전히 건조 될 때까지 적어도 1 분 동안 기다립니다.
- 오픈 필드 테스트를 수행하여 각 마우스의 운동 활동을 평가합니다.
- 각 실험 마우스의 동작을 기록하고 추적하려면 동물 행동 비디오 추적 소프트웨어를 사용합니다(재료 표참조).
- 비디오 추적 소프트웨어가 열리면 열린 필드 상자의 크기를 보정합니다. 그런 다음 추적 영역을 설정합니다. 실험자의 손을 추적하지 않도록 3초의 대기 시간과 15분의 획득 시간을 설정합니다. 각 실험 마우스(그룹, 성별, 나이 등)에 대한 정보를 삽입합니다.
- 그런 다음 실험용 마우스를 벽을 향한 열린 필드 상자에 부드럽게 놓습니다. 케이지 뚜껑에 놓아 취급과 관련된 스트레스와 불안을 최소화하십시오. 그런 다음 친숙한 세션(1.9.3 단계)에서 개체가 있는 위치에서 가장 멀리 떨어진 열린 필드 상자의 벽 근처에서 마우스를 놓습니다.
참고: 마우스가 열린 필드 상자에 있으면 마우스 추적 소프트웨어가 자동으로 마우스를 감지하고 녹화를 시작합니다. 최적의 탐색을 위해 카메라를 열린 필드 상자 바로 위에 배치할 수 있습니다. - 15분 동안 녹음한 후 케이지 뚜껑에 놓아 동물을 홈 케이지로 되돌리시고 집으로 되돌리시고. 70% 에탄올 스프레이로 오픈 필드 박스를 청소하고 시험 사이에 깨끗한 종이 타월로 닦으소. 밝은 빛을 복원하고 제조업체의 지침에 따라 비디오 추적 소프트웨어를 사용하여 이동한 동물의 총 거리를 측정합니다.
- 비디오 추적 소프트웨어 및 비디오 클립을 엽니다. 그런 다음 해석을 클릭하여 열린 필드 상자 크기의 보정을 기반으로 이동된 총 거리를 계산합니다.
- 2일째와 3일째에, 1.3단계부터 1.7단계까지 반복하여 습관성 세션(H2, H3)을 수행한다.
- 4일째에는 익숙해지기 세션(F1)을 수행합니다.
- 희미한 빛에서 각 마우스를 빈 열린 필드에 3 분 동안 놓습니다. 그 짧은 재활 후, 홈 케이지에 동물을 반환합니다.
- 습관동안 70% 에탄올로 물건을 철저히 청소하고 종이 타월로 닦아냅니다. 잔류 알코올이 완전히 건조될 때까지 적어도 1분 동안 기다립니다.
- 인접한 벽에서 5cm 떨어진 열린 필드 경기장에 동일한 두 개의 오브젝트(고무 인형, 오브젝트 A)를 놓습니다. 양면 테이프로 개체를 고정합니다. 실험용 마우스를 열린 필드 상자에 넣고 오브젝트에서 가장 먼 벽을 향합니다.
- 20분 동안 무료 탐색을 허용하고 두 개의 스톱워치를 사용하여 두 객체를 탐색하는 데 소요된 시간을 수동으로 측정합니다. 마우스가 두 개체의 최소 탐색 시간(30초)에 도달하면 F1 세션을 중지하고 동물을 홈 케이지로 옮김합니다. 마우스가 20분 이내에 30초 동안 개체를 탐색하지 못하면 열린 필드 상자에서 마우스를 제거하고 추가 세션에서 제외합니다.
- 동물을 열린 필드 박스에서 제거 한 후 70 % 에탄올 스프레이로 상자의 바닥과 벽을 철저히 청소하고 종이 타월로 닦으십시오.
참고: 마우스가 수염, 주마또는 앞발로 물체에 닿는 시간을 측정합니다. 동물의 주총이 물체에 앉거나, 물체를 지나가거나, 객체를 가리키는 뒷쪽 끝으로 쉬는 것과 같이 개체를 가리키지 않는 동작은 탐색 시간으로 정량화하지 마십시오.
- 5일째에는 NL 테스트 세션을 수행합니다.
- 홈 케이지에서 3분 동안 재활을 위해 열린 필드 영역으로 마우스를 옮김을 옮김. 그런 다음 동물을 홈 케이지로 되돌려 놓습니다.
- 습관동안 70% 에탄올로 물건을 철저히 청소하고 종이 타월로 닦아냅니다. 잔류 알코올이 완전히 건조될 때까지 적어도 1분 동안 기다립니다.
- 인접한 벽에서 5cm 떨어진 대각선 위치로 한 오브젝트(고무 인형, 오브젝트 A)를 이동합니다. 양면 테이프로 개체를 고정합니다. 케이지 뚜껑에 실험용 마우스를 탁 트인 필드 영역으로 옮기고 열린 필드 상자의 벽을 향하게 놓습니다.
참고: 특정 방향에 대한 잠재적인 선천적 기본 설정을 줄이기 위해 이동된 오브젝트의 위치를 균형을 맞습니다. 예를 들어, 실험 동물의 절반에 대한 친숙한 세션에서 선호하는 개체의 위치를 변경하고, 나머지 동물에 대해, 익숙하지 않은 객체를 친숙한 세션에서 이동한다. - 비디오 추적 시스템으로 10분 동안 무료 탐색 및 녹화를 허용합니다. 두 개의 스톱워치를 사용하여 각 객체를 탐색하는 데 소요된 시간을 측정하고 차별 비율을
참고: 마우스가 수염, 주마또는 앞발로 물체에 닿는 시간을 측정합니다. 동물의 주총이 물체에 앉거나, 물체를 지나가거나, 객체를 가리키는 뒷쪽 끝으로 쉬는 것과 같이 개체를 가리키지 않는 동작은 탐색 시간으로 정량화하지 마십시오. - 실험용 마우스의 꼬리를 잡고 케이지 뚜껑에 놓아 홈 케이지로 옮김을 옮니다. 3 일 (6-8 일) 동안 마우스가 음식과 물에 무료로 접근 할 수 있게하십시오.
- 동물이 열린 필드 박스에서 제거되면 70 % 에탄올 스프레이로 상자의 바닥과 벽을 철저히 청소하고 종이 타월로 닦으십시오.
2. 새로운 개체 인식 테스트 (NO)
- 9일째에는 1.2-1.7단계를 반복하여 15분 동안 습관세션을 진행합니다.
- 10일째에는 익숙해지기 세션(F1)을 수행합니다.
- 희미한 조명에서 마우스를 빈 열린 필드에 3분 동안 놓습니다. 열린 필드 영역으로 마우스를 재활 한 후 일시적으로 홈 케이지로 돌아갑니다.
- 습관화 하는 동안, 철저 하 게 70% 에탄올으로 개체를 청소 하 고 종이 타월으로 닦아. 잔류 알코올이 완전히 건조될 때까지 적어도 1분 동안 기다립니다.
- 인접한 벽에서 5cm 떨어진 열린 필드에 동일한 오브젝트 2개(40mL의 물, 물체 B로 채워진 50mL 플라스틱 튜브)를 놓습니다. 양면 테이프로 개체를 고정합니다. 실험마우스를 오브젝트에서 가장 먼 벽을 향한 열린 필드 상자에 소개합니다.
- 동물이 NO 시험에서 2개의 상이한 물체(40 mL의 물로 채워진 50 mL 플라스틱 튜브, 객체 B; 유리 코플린 항아리, 객체 C)에 노출됨에 따라, F1 세션 동안 객체의 균형을 맞추게 된다. 예를 들어, 두 개의 동일한 개체(유리 코플린 항아리, 오브젝트 C)를 그룹의 동물의 절반에 대해 제시한다.
- 20분 동안 무료 탐색을 허용하고 두 개의 스톱워치를 사용하여 두 객체를 탐색하는 데 소요된 시간을 수동으로 측정합니다. 마우스가 두 개체의 최소 탐색 시간(30초)에 도달하면 F1 세션을 중지하고 동물을 홈 케이지로 옮김합니다. 마우스가 20분 이내에 30초 동안 개체를 탐색하지 못하면 열린 필드 상자에서 개체를 제거하고 추가 세션에서 제외합니다.
- 동물을 열린 필드 박스에서 제거 한 후 70 % 에탄올 스프레이로 상자의 바닥과 벽을 철저히 청소하고 종이 타월로 닦으십시오.
참고: 마우스가 수염, 주마또는 앞발로 물체에 닿는 시간을 측정합니다. 동물의 주총이 물체에 앉거나, 물체를 지나가거나, 객체를 가리키는 뒷쪽 끝으로 쉬는 것과 같이 개체를 가리키지 않는 동작은 탐색 시간으로 정량화하지 마십시오.
- 다음 날(11일)에 NO 테스트 세션을 수행합니다.
- 홈 케이지에서 3 분 동안 재활을 위해 열린 필드로 마우스를 옮은 다음 동물을 홈 케이지로 되돌려 놓습니다.
- 습관화 하는 동안, 철저 하 게 70% 에탄올으로 개체를 청소 하 고 종이 타월으로 닦아. 잔류 알코올이 완전히 건조될 때까지 적어도 1분 동안 기다립니다.
- 한 물체(물 40mL, 물체 B로 채워진 50mL 플라스틱 튜브)를 인접한 벽에서 5cm 떨어진 다른 물체(유리 코플린 항아리, 물체 C)로 교체합니다. 양면 테이프로 개체를 고정합니다. 케이지 뚜껑에 실험용 마우스를 탁 트인 필드로 옮기고 벽을 향하도록 놓습니다. NO 테스트 중에 함께 제공되는 개체의 균형을 조정합니다. 예를 들어, 익숙해지는 세션 동안 두 개의 유리 코플린 항아리(object C)에 노출된 마우스에 대해 40 mL의 물(개체 B)으로 채워진 50 mL 플라스틱 튜브로 하나의 유리 코플린 항아리(object C)를 교체한다.
참고: 특정 방향에 대한 잠재적인 선천적 기본 설정을 줄이기 위해 대체된 개체의 위치를 균형을 맞출 수도 있습니다. 예를 들어, 두 개체(개체 B 또는 오브젝트 C)의 세트에 노출된 동물의 각 코호트에 대해, 실험 동물의 절반에 대한 친숙한 세션에서 바람직한 객체를 변경하고, 나머지 동물에 대해, 익숙해진 세션에서 덜 선호되는 객체를 대체한다. - 10분 동안 무료 탐색을 허용하고 비디오 추적 시스템을 사용하여 녹화합니다. 두 개의 스톱워치를 사용하여 각 객체를 탐색하는 데 소요된 시간을 측정하고 판별 비율을 계산합니다.
참고: 마우스가 수염, 주마또는 앞발로 물체에 닿는 시간을 측정합니다. 동물의 주총이 물체에 앉거나, 물체를 지나가거나, 객체를 가리키는 뒷쪽 끝으로 쉬는 것과 같이 개체를 가리키지 않는 동작은 탐색 시간으로 정량화하지 마십시오. - 실험용 마우스의 꼬리를 잡고 케이지 뚜껑에 놓아 홈 케이지로 옮김을 옮니다. 3 일 (일 12-14) 동안, 음식과 물에 무료로 액세스 할 수있는 마우스를 휴식하게하십시오.
- 동물이 열린 필드 상자에서 제거되면, 70 % 에탄올 스프레이로 열린 필드 박스의 바닥과 벽을 철저히 청소하고 종이 타월로 닦아냅니다.
3. 패턴 분리 테스트 (PS)
- 15일째에 PS 시험을 위한 첫 번째 친숙화 세션(F1)을 수행합니다.
- 홈 케이지에서 3분 동안 재활을 위해 열린 필드 영역으로 마우스를 옮은 다음 홈 케이지로 되돌아갑니다.
- 습관동안 70% 에탄올로 물건과 격자바닥판을 철저히 청소하고 종이 타월로 닦아냅니다. 잔류 알코올이 완전히 건조될 때까지 적어도 1분 동안 기다립니다.
- 바닥 판(42.5 x 42.5 x 0.5 cm)을 넓은 격자(5.5 x 5.5 cm)로 열린 필드 상자에 놓고 인접한 벽에서 5cm 떨어진 열린 필드에 동일한 개체 두 개(50mL의 물, 물체 D로 채워진 플라스틱 T-플라스크)를 놓습니다. 양면 테이프로 개체를 고정합니다. 실험마우스를 오브젝트에서 가장 먼 벽을 향한 열린 필드 상자에 소개합니다.
- 동물이 PS 테스트에서 두 개의 상이한 물체(50 mL의 물, 물체 D; 유리 병, 물체 E로 채워진 플라스틱 T-플라스크)에 노출됨에 따라, F1 및 F2 세션 동안 객체의 균형을 맞추게 된다. 예를 들어, 그룹의 동물 절반에 대해 와이드 그리드 바닥에 두 개의 동일한 오브젝트(유리 병, 오브젝트 E)를 제시한다.
- 20분 동안 무료 탐색을 허용하고 두 개의 스톱워치를 사용하여 두 객체를 탐색하는 데 소요된 시간을 수동으로 측정합니다. 마우스가 두 개체의 최소 탐색 시간 합계(30초)에 도달하면 F1 세션을 중지하고 동물을 홈 케이지로 옮김합니다. 마우스가 20분 이내에 30초 동안 개체를 탐색하지 못하면 열린 필드 상자에서 개체를 제거하고 추가 세션에서 제외합니다.
참고: 마우스가 수염, 주마또는 앞발로 물체에 닿는 시간을 측정합니다. 동물의 주총이 물체에 앉거나, 물체를 지나가거나, 객체를 가리키는 뒷쪽 끝으로 쉬는 것과 같이 개체를 가리키지 않는 동작은 탐색 시간으로 정량화하지 마십시오. - 첫 번째 익숙해지기 세션 (F1)을 완료 한 후 70 % 에탄올 스프레이로 물체와 바닥 판을 철저히 청소하고 열린 필드 상자에서 제거하십시오.
- 다음날(16일)에 PS 시험을 위한 두 번째 친숙한 세션(F2)을 수행한다.
- 홈 케이지에서 3 분 동안 재활을 위해 열린 필드 영역으로 마우스를 옮은 다음 동물을 홈 케이지로 되돌려 놓습니다.
- 습관동안 70% 에탄올로 물건과 격자바닥판을 철저히 청소하고 종이 타월로 닦아냅니다. 잔류 알코올이 완전히 건조될 때까지 적어도 1분 동안 기다립니다.
- 바닥 판(42.5 x 42.5 x 0.5 cm)을 좁은 격자(2.75 x 2.75 cm)로 놓고 인접한 벽에서 5cm 떨어진 열린 필드에 두 개의 동일한 물체(유리 병, 개체 E)를 놓습니다. 양면 테이프로 개체를 고정합니다. 실험마우스를 오브젝트에서 가장 먼 벽을 향한 열린 필드 상자에 소개합니다.
- 카운터밸런싱을 위해 좁은 그리드 바닥에 두 개의 동일한 오브젝트(50mL의 물로 채워진 플라스틱 T-플라스크, 오브젝트 D)를 표시합니다.
- 20분 동안 무료 탐색을 허용하고 두 개의 스톱워치를 사용하여 두 객체를 탐색하는 데 소요된 시간을 수동으로 측정합니다. 마우스가 두 개체의 최소 탐색 시간 합계(30초)에 도달하면 F2 세션을 중지하고 동물을 홈 케이지로 옮김합니다. 마우스가 20분 이내에 30초 동안 개체를 탐색하지 못하면 열린 필드 상자에서 개체를 제거하고 추가 세션에서 제외합니다.
참고: 마우스가 수염, 주마또는 앞발로 물체에 닿는 시간을 측정합니다. 동물의 주총이 물체에 앉거나, 물체를 지나가거나, 객체를 가리키는 뒷쪽 끝으로 쉬는 것과 같이 개체를 가리키지 않는 동작은 탐색 시간으로 정량화하지 마십시오. - 두 번째 익숙해지기 세션(F2)을 완료한 후 70% 에탄올 스프레이로 물체와 바닥판을 철저히 청소하고 열린 필드 박스에서 제거합니다.
- 다음 날(17일)에 PS 테스트 세션을 수행합니다.
- 홈 케이지에서 3분 동안 재활을 위해 열린 필드 영역으로 마우스를 옮은 다음 홈 케이지로 되돌아갑니다.
- 습관동안 70% 에탄올로 물건과 격자바닥판을 철저히 청소하고 종이 타월로 닦아냅니다. 잔류 알코올이 완전히 건조될 때까지 적어도 1분 동안 기다립니다.
- 좁은 격자(2.75 x 2.75 cm)를 열린 필드 상자에 놓고 인접한 벽에서 5cm 떨어진 바닥 판에 두 개의 다른 물체(물 50mL, 개체 D; 유리 병, 물체 E)를 놓습니다. 양면 테이프로 개체를 고정합니다. 케이지 뚜껑에 실험용 마우스를 탁 트인 필드 영역으로 옮기고 벽을 향하게 합니다.
- PS 테스트 중에 함께 제공되는 개체의 균형을 조정합니다. 예를 들어 각 오브젝트(오브젝트 D, 오브젝트 E)를 좁은 그리드 바닥에 배치하여 오브젝트 E를 이 컨텍스트에서 새로운 객체로 만듭니다. 객체 D 또는 오브젝트 E(좁은 바닥 패턴의 새로운 객체)의 위치를 균형을 맞추면 특정 방향에 대한 선천적 선호도의 가능성을 줄이기 위해 수행할 수도 있습니다. 예를 들어, 실험 동물의 절반에 대해 제2 친숙한 세션에서 바람직한 객체를 대체하고, 나머지 동물에 대해, 제2 친숙한 세션에서 덜 선호되는 객체를 대체한다.
- 비디오 추적 시스템을 사용하여 10분 동안 무료로 탐색하고 녹화할 수 있습니다. 두 개의 스톱워치를 사용하여 각 객체를 탐색하는 데 소요된 시간을 측정하고 판별 비율을 계산합니다.
참고: 마우스가 수염, 주마또는 앞발로 물체에 닿는 시간을 측정합니다. 동물의 주총이 물체에 앉거나, 물체를 지나가거나, 객체를 가리키는 뒷쪽 끝으로 쉬는 것과 같이 개체를 가리키지 않는 동작은 탐색 시간으로 정량화하지 마십시오. - 실험용 마우스의 꼬리를 잡고 케이지 뚜껑에 놓아 홈 케이지로 옮김을 옮니다.
4. 크레실 바이올렛 염색
- 모든 행동 테스트를 완료 한 후, 케타민 (50 mg / mL)과 자일라진 (23.3 mg / mL)의 칵테일 (4:0.5)을 주입하여 동물을 마취110 mL / kg 체중 (IP; 1 mL 주사기; 26 G 바늘)의 용량으로 식염수에 용해. 발가락 핀치에 대한 반응이 없어 마취의 깊이를 확인하십시오.
- 일단 동물이 깊이 마취되면, 뇌를 해결하기 위해 4 % 파라 포름 알데히드와 트랜스 카피 잉류를 수행15.
- 트랜스카이어퍼우전이 끝나면 가위15로동물을 참수한다. 그런 다음 홍채 가위를 사용하여 두개골을 제거하여 뇌를 노출시하십시오. 뇌가 분리 된 후, 하룻밤 4 % 파라 포름 알데히드에 그것을 후착, 0.01 M 인산완충 식염수에 30 % 자당에 냉동 보호 다음.
- 저온 극저온을 사용하여 스냅 냉동 뇌에서 관상 섹션 (30 μm)을 만듭니다.
- 슬라이드에 뇌 조직을 장착하고 100 % 에탄올에서 수돗물로 수돗물에 일련의 수화 단계를 수행하여 100 %, 95 %, 95 %, 80 %, 70 % 에탄올로 순차적으로 세척하십시오.
- 조직 슬라이드를 0.1% 크레실 바이올렛 용액으로 15 분 동안 배양합니다.
- 95% 에탄올/0.1% 빙하 아세트산에 티슈 슬라이드를 침지하여 과도한 얼룩을 제거한 다음 100% 에탄올, 50% 에탄올/50% 자일렌, 100% 자일렌용액으로 조직을 탈수합니다.
- 시판되는 자일렌 장착 매체를 사용하여 티슈 슬라이드를 덮어.
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Representative Results
인지 기능 평가를 위한 일반적인 실험 일정 및 설정은 그림 1에나와 있습니다. 필로카핀-유도 급성 발작의 도입 6주 후, 마우스는 시험 사이의 3일 휴식 기간에 의해 분리된 순서로 NL, NO 및 PS 시험을 실시하였다(도1A). NL 테스트의 경우 친숙한 세션(F1) 동안 두 개의 동일한 개체가 열린 필드에 배치되었고 다음 날 한 개체가 새 위치로 이동되었습니다. NO 테스트에서 테스트 세션 중에 하나의 개체가 새 개체로 대체되었습니다. PS 테스트의 경우 두 개의 친숙한 세션(F1, F2)은 서로 다른 바닥 그리드 패턴과 개체의 조합을 도입했습니다. 이어서, 시험 당일, 각 친숙한 세션의 하나의 객체를 좁은 격자 바닥 패턴에 배치하고, 좁은 격자 바닥 패턴의 맥락에서 하나의 객체를 새로운 것으로만들었다(도 1B). 개방형 필드 박스는 충전 결합 장치 카메라 바로 아래 책상에 놓고 불필요한 시각적 신호를 피하기 위해 검은 커튼으로 둘러싸여있습니다(그림 2A). 샘플 개체는 마우스보다 약간 큰 크기 또는 약간 큰 재질을 쉽게 세척할 수있었습니다(도 2B). 함께 제시된 두 개체 간에 유의한 기본 설정이 없는지 확인하기 위해 개체 조합을 미리 선별해야했습니다(그림 2C). 상이한 패턴을 가진 바닥판을 PS 시험에서 추가적인 실험 신호를 제공하기 위해 개방 필드 박스에 배치하였다(도2B). 마우스가 열린 필드 박스에 도입되면 비디오 추적 시스템이 궤적을 추적하여 총 운동 거리를 분석했습니다(그림2D). 필로카핀 주사 후 6주 후, 간질 마우스는 NL 시험에서 차별비율의 현저한 감소를 보였으며, 공간 기억 장애를 입증하였다(그림3). 더욱이, 개체 인식 메모리에 대한 시험인 NO 테스트에서 간질 마우스는 sham 대조군과 비교하여 메모리 기능이 손상된 것으로 나타났습니다. 신생아 뉴런 기능을 PS 검사로 평가했을 때, 간질 마우스는 여러 큐를 가진 맥락에서 새로운 개체를 인식하는 데 어려움을 겪었습니다. 제어 실험으로서, 익숙해세션 동안 탐사 기준에 도달하기 위한 운동 활성 및 대기 시간을 평가하였다(도3). 운동 운동 활성의 측정은 간질동물(도 3C)에서유의한 증가를 보였으며, 이전 보고서16,,17에따라, 개체를 탐구하려는 동기는 가짜와 간질 동물 사이에 비교된 반면(그림3D). 친숙한 세션에서 탐사 기준에 실패한 우리의 중퇴율은 NL, NO 및 PS 시험을 각각 17.4%, 18.2%, 0%였으며, 이는 일련의 행동 실험 동안 동물이 실험 환경에 익숙해졌다는 것을 시사합니다. 마지막으로, 우리는 발작 유도 신경 손상을 확인하기 위해 크레실 바이올렛 염색을 사용하여 필로카핀 유도 상태 간질 후 해마 세포 사멸을 평가하였다(그림 4). 필로카핀 처리된 동물은 샴 컨트롤과 달리 해마의 hilus 및 CA3 하부장에서 pyknotic 세포를 입증하였다(그림4).
그림 1: 행동 테스트 배터리의 개략적 프리젠테이션. (a)신규 객체 위치(NL), 신규 객체 인식(NO), 및 패턴 분리(PS) 검정 및 간질 마우스에 대한 행동 스케줄의 개략도도. (B)NL, NO 및 PS 테스트를 위한 객체 및 바닥판 배열의 대표적인 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 인지 기능의 평가를 위한 행동 장치. (A)동작 설정의 일반적인 개요입니다. 불필요한 단서를 피하기 위해 커튼으로 둘러싸인 열린 필드 박스 바로 위에 카메라를 배치했습니다. (B)신규 객체 위치(NL), 신규 객체 인식(NO) 및 패턴 분리(PS) 테스트에 대한 샘플 객체. PS 테스트의 경우, 다른 패턴을 가진 바닥 판, 즉 넓고 좁은 그리드를 추가 단서를 제공하기 위해 열린 필드 박스에 삽입되었습니다. (C)각각 NO 및 PS 테스트 세션(n=7) 동안 함께 제시된 각 객체를 탐색하는 시간을 보여주는 그래프. Mann-Whitney U 테스트(NO 테스트)에서 평가한 두 개체와 학생의 페어링되지 않은 t 검(PS 테스트)의 기본 설정에는 큰 차이가 없습니다. (D)비디오 추적 시스템이 오픈 필드 박스에서 실험 마우스를 감지한 것을 보여주는 이미지. 빨간색 사각형은 마우스의 궤적을 추적하기 위한 미리 설정된 영역을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 간질 마우스에서 공간 기억 및 패턴 분리 장애. (a)신규 객체 위치(NL), 신규 객체 인식(NO), 패턴 분리(PS) 테스트의 개략적 표현. 참신한 객체는 빨간색 원으로 표시됩니다. (B)SHAM(n=8)과 간질 마우스(n=10) 사이의 NL, NO 및 PS 시험에서의 판별비를 나타내는 그래프. 간질 마우스는 장소, 객체 및 문맥에 대한 메모리 기능을 각각 테스트하는 NL, NO 및 PS 테스트에서 상당한 손상을 입증했습니다. * p < 0.05 NL 테스트에 대한 만 휘트니 U 테스트. * p < 0.05 학생의 NO 시험에 대한 페어링되지 않은 t-시험에 의해. * p < 0.05 PS 시험에 대한 웰치의 보정과 학생의 짝이없는 T 테스트에 의해. (C)sham(n=8) 및 간질 마우스(n=10)의 운동 활성을 나타내는 그래프. 간질 마우스는 이전 보고와 일치하는 증가된 운동을 보여주었습니다. * p < 0.05 학생의 짝이없는 T-시험에 의해. (D)NL, NO 및 PS 테스트의 친숙한 세션에서 30s 기준에 대한 대기 시간을 보여주는 그래프. sham (n = 8)과 간질 마우스 (n = 10) 사이의 개체를 탐색하는 동기 부여에는 차이가 없었습니다. 데이터는 평균 ± 표준 오차(SEM)로 제시된다. SE = 상태 간질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 필로카핀 유도 상태 간질(SE) 후 해마에서의 신경사멸. 대표적인 이미지(A)sham 및(B)간질 기에서 58일 후 필로카핀 주사 후. 확대된 이미지는 낮은 배율을 가진 이미지에서 흰색 사각형으로 표시되는 해마의 hilus(a, d),CA1서브필드(b, e)및 CA3 서브필드(c,f)를나타낸다. 해마의 hilus 및 CA3 하위 필드에 있는 pyknotic 세포를 주의하십시오. 맨 왼쪽 이미지 = 200 μm의 배율 표시줄은 하단 이미지에도 유효합니다. 축척 막대는 " b, c = 40 μm, d, e, f,각각 유효합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 작품은 만성 간질을 가진 마우스에 있는 인식 기능을 평가하기 위한 실험적인 절차를 기술합니다. 많은 다른 행동 시험 패러다임은 마우스18에있는 학습 그리고 기억 기능을 평가하기 위하여 이용됩니다. 모리스 물 미로, 방사형 팔 미로, Y-미로, 상황 공포 컨디셔닝 및 개체 기반 테스트는 가장 자주 사용되는 행동 테스트이며 신뢰할 수있는 결과를 제공합니다. 그 중에서도 NL, NO 및 PS 시험은 간질 마우스8,,10에서학습 및 기억을 평가하기 위한 효율적이고 간단한 방법이다. 간질 마우스는 행동 세션 도중 예기치 않은 자발적인 포착이 있을 수 있기 때문에, 공포 컨디셔닝, 온화한 기아, 또는 재발하는 발작을 유발할 수 있는,10의해상에 머무르기 위하여 강제적인 동기 부여된 업무에 이용된19것과 같은 그밖 긍정적또는 부정적인 강화를 추가하지 않고 다른 긍정적 또는 부정적인 강화를 추가하지 않고 참신을 탐구하기 위한 동물의 자연적인 성향에 근거를 둔 행동 시험을 사용하는 것이 좋습니다. 또한, 다른 행동 테스트와 비교하여, 광범위한 훈련 세션이 필요하지 않기 때문에 신규성 기반 테스트는 동물에 대한 스트레스가 적습니다. 또한, 신규성 기반 행동 테스트는 단순히 객체 위치를 변경하거나, 새로운 물체를 제시하거나, 추가 자극을 결합하여 다양한 유형의 메모리(즉, 공간 기억, 인식 메모리 또는 에피소드 메모리)를 평가하기 위해 쉽게 수정될 수 있다. 종합하면, NL, NO 및 PS 테스트와 같은 참신한 기반 테스트는 간질 마우스의 인지 기능을 평가하기 위한 다목적 이점이 있습니다.
비록 NL, NO, 그리고 PS 테스트는 간 질 마우스에서 학습 및 메모리 기능을 조사 하기 위한 신속 하 고 유용한 실험 모델, 그들을 사용 하는 경우 몇 가지 요소를 고려해 야 합니다. 만성 간질 마우스가 필로카핀 주사7에서고조 된 불안을 보여, 친숙한 세션 동안 개체 탐사에 현저한 감소로 이어지는 것이 잘 알려져있다. 이러한 탐색 부족은 테스트 결과를 잘못 해석할 수 있습니다. 따라서, 익숙해지기 세션 전에 마우스가 환경에 익숙해지기 위해 개방 필드에 충분한 습관을 포함하는 것이 중요하다. 균주에 따라, 마우스는 여전히 습관의 3 세션 후에도, 친숙한 세션의 20 분 안에 30 s를 위한 객체를 탐구하는 것을 실패할 수 있습니다. 이 경우 열린 필드 상자에 개체의 추가 쌍으로 다른 습관 세션을 추가하면 개체를 향한 마우스의 불안을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. 오픈 필드 박스를 둘러싼 커튼은 외부 방 신호를 최소화할 수 있으므로 실험 마우스가 열린 필드의 개체에 초점을 맞출 수 있습니다. 또한 탐색 기준은 동물의 주전자가 물체에 앉거나, 물체를 지나가거나, 객체를 가리키는 뒷쪽 끝으로 쉬는 것과 같이 물체를 가리키지 않는 동작을 제외할 만큼 엄격해야 합니다. 마지막으로, 그것은 매우 드문 수 있지만, 발작 이벤트는 행동 작업 중에 발생할 수 있습니다. 이 경우 메모리 기능 평가를 위한 혼란스러운 편견의 가능한 원인이 될 수 있으므로 추가 평가에서 동물을 제거하는 것이 좋습니다.
NL, NO, 및 PS 시험은 새로운 자극에 대한 동물의 자연적인 호기심에 의존하는 매우 민감한 실험이기 때문에, 미묘한 변화는 마우스의 탐색적 행동에 영향을 미칠 수 있으며, 그 결과 결정적인 차별 비율21,,22. 예를 들어, 마우스의 가혹한 취급, 행동 작업 바로 전에 침구 변경, 테스트의 일관성없는 타이밍, 테스트 룸에 대한 불충분 한 적응은 모두 동물의 스트레스 수준을 상승시킬 수 있으며, 명백한 테스트 결과를 초래할 수 있습니다. 또한 각 세션에서 비대칭 객체의 일관성없는 프리젠 테이션, 실험 경기장 근처의 홈 케이지 배치 또는 실험자의 후각 서명을 전환하는 것과 같은 변경 된 테스트 환경은 추가 요인을 피하기 위해 신중하게 고려해야합니다. 데이터 분석 단계에서 여러 실험자의 평가는 설치류 탐색 동작 또는 스톱워치 사용의 다른 기준으로 인해 행동 결과의 변동성 증가에 기여할 수 있습니다. 전체적으로 이러한 측면은 NL, NO 및 PS 테스트의 성공적인 구현을 염두에 두어야 합니다.
해마 및 해마 부위는 메모리 처리23,,24에서독특한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 공간 기억은 크게 해마의 기능에 달려 있다는 것이 널리 받아들여지며, 이는 NL 시험23,,24에의해 쉽게 평가될 수 있다. 한편, 개체 인식 기억은 해마25,,,,,,,26,,27,,28,,29,,30,31,,32,,33, 34,,3435,36,37,38외에 경피피질, 인내 피질 및 전두엽 피질을 포함한 여러 뇌 영역을 수반하는 것으로 보인다. 필로카핀 처리 된 간질 마우스는 광범위하게 해마 신경손상39,,40,,,41,,42,반면 개체 인식 기억 테스트는 해마 뇌 영역에서 가변 신경 변성10,41,,,42,,44와함께 공간 메모리 테스트에서 행동 장애를 일관되게 입증했다.44 이 데이터는 객체 인식이 해마가 중앙 역할을 할 수 있는 공간 기억과는 달리, 다중 두뇌 지구 사이 정교한 네트워크 연결을 요구할 수 있다는 것을 암시합니다. 특정 해마 하위 필드를 면밀히 평가하면 CA1 및 CA3/덴테이트 자이러스 영역이 다른 정보를 처리하는 것으로 나타났습니다. 구체적으로, CA1 뉴런은 유사한 항목에 노출에 의해 활성화되는 것으로 생각되는 반면, CA3 및 치과 자이러스는 유사한 개체를 차별하는 데 관여하는,반면,45. 그 가설과 일치, 새로운 증거는 신생아 뉴런을 덴테이트 패턴 분리 성능에 기여할 수 있음을 시사45,,46,,47. 비정상적인 해마 신경 발생은 간질 발생 시 유도 될 수 있다는 것을 감안할 때10,간질 마우스는 만성 간질에서 신생아 뉴런의 중단 된 통합으로 인해 유사한 경험을 차별하는 데 손상된 성능을 입증 할 수 있습니다.
결론적으로, 우리는 간질 마우스에 있는 기억 손상을 평가하는 방법을 기술합니다. 특히, 우리는 장소, 개체 및 컨텍스트에 대한 메모리를 각각 테스트하는 세 가지 행동 테스트( NL, NO 및 PS 테스트)에 대한 실험 프로토콜을 제공합니다. 마우스에 사용할 수 있는 많은 인지 테스트 패러다임 중, NL, NO, 및 PS 테스트는 매우 간단, 최소한의 스트레스 동물, 재발 발작을 유발 하지 않고 간 질 동물에서 메모리 기능을 평가 하기 위한 최적의 만드는 짧은 분석.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
기술지원에 감사드린다. 이 작품은 한국 정부의 후원을 받은 국립연구재단(NRF)의 지원(NRF-2019R1A2C1003958, NRF-2019K2A9A2A08000167)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | Sung-shim | Use with the 26 or 30 gauge needle | |
| 70% Ethanol | Duksan | UN1170 | Spray to clean the box and objects |
| black curtain | For avoiding unnecessary visual cues | ||
| Cresyl violet | Sigma | C5042 | For Cresyl violet staining |
| cryotome | Leica | E21040041 | For tissue sectioning |
| double-sided sticky tape | For the firm placement of the objects | ||
| DPX mounting medium | Sigma | 06522 | |
| ethanol series | Duksan | UN1170 | Make 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol solutions |
| floor plate with narrow grid patterns | Leehyo-bio | Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 2.75 x 2.75 cm | |
| floor plate with wide grid patterns | Leehyo-bio | Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 5.5 x 5.5 cm | |
| illuminometer | TES Electrical Electronic Corp. | 1334A | For the measurement of the room lighting (60 Lux) |
| Intensive care unit | Thermocare | #W-1 | |
| ketamine hydrochloride | Yuhan | 7003 | Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion |
| LED lamp | Lungo | P13A-0422-WW-04 | Lighting for the behavioral test room |
| objects | Rubber doll, 50 ml plastic tube, glass Coplin jar, plastic T-flask, glass bottle | ||
| open field box | Leehyo-bio | Behavioral experiment equipment, size: 44 x 44 x 31 cm | |
| paper towel | Yuhan-Kimberly | 47201 | Use to dry open field box and objects |
| paraformaldehyde | Merck Millipore | 104005 | Make 4% solution |
| pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| ruler | Use to locate the objects in the open field box | ||
| scopolamine methyl nitrate | Sigma | S2250 | Make 10X stock |
| Smart system 3.0 | Panlab | Video tracking system | |
| stopwatch | Junso | JS-307 | For the measurement of explorative activities of mice |
| sucrose | Sigma | S9378 | For cryoprotection of tissue sections |
| terbutaline hemisulfate salt | Sigma | T2528 | Make 10X stock |
| video camera (CCD camera) | Vision | VCE56HQ-12 | Place the camera directly overhead of the open field box |
| xylazine (Rompun) | Bayer korea | KR10381 | Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion |
| xylene | Duksan | UN1307 | For Cresyl violet staining |
References
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