Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Lange afstand Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping van inferieure Colliculus Neuronen met blauwe en rood-verschoven Channelrhodopsinen

Published: February 7, 2020 doi: 10.3791/60760
Automatic Translation
1, 1
1Kresge Hearing Research Institute, Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Michigan

Summary

Channelrhodopsin-assisted circuit mapping (CRACM) is een precisietechniek voor het functioneel in kaart brengen van lange afstandneuronale projecties tussen anatomische en/of genetisch geïdentificeerde groepen neuronen. Hier beschrijven we hoe we CRACM kunnen gebruiken om auditieve hersenstamverbindingen in kaart te brengen, inclusief het gebruik van een roodverschoven opsin, ChrimsonR.

Abstract

Bij het onderzoeken van neurale circuits, een standaard beperking van de in vitro patch klem aanpak is dat axonen uit meerdere bronnen zijn vaak gemengd, waardoor het moeilijk is om ingangen te isoleren van individuele bronnen met elektrische stimulatie. Echter, met behulp van channelrhodopsin assisted circuit mapping (CRACM), kan deze beperking nu worden overwonnen. Hier rapporteren we een methode om CRACM te gebruiken om opgaande ingangen van lagere auditieve hersenstamkernen en commissurale ingangen in kaart te brengen naar een geïdentificeerde klasse neuronen in de inferieure colliculus (IC), de midbrainkern van het auditieve systeem. In de IC zijn lokale, commissurale, opgaande en dalende axonen sterk met elkaar verweven en daardoor niet te onderscheiden met elektrische stimulatie. Door het injecteren van een virale constructie om expressie van een channelrhodopsine in een presynaptische kern te stimuleren, gevolgd door patch klem opname om de aanwezigheid en fysiologie van channelrhodopsin-uitdrukkende synaptische ingangen te karakteriseren, projecties van een specifieke bron aan een specifieke populatie ic-neuronen kan worden toegewezen met celtype-specifieke nauwkeurigheid. We laten zien dat deze aanpak werkt met zowel Chronos, een blauw licht geactiveerde kanaalrhodopsine, als ChrimsonR, een rood verschoven kanaalrhodopsine. In tegenstelling tot eerdere rapporten van het voorbrein, vinden we dat ChrimsonR robuust wordt verhandeld door de axonen van dorsale cochleair nucleus principal neuronen, wat aangeeft dat ChrimsonR een nuttig hulpmiddel kan zijn voor CRACM-experimenten in de hersenstam. Het hier gepresenteerde protocol bevat gedetailleerde beschrijvingen van de intracraniële virusinjectiechirurgie, inclusief stereotaxiccoördinaten voor het richten van injecties op de rugslakkenkern en IC van muizen, en hoe hele celpatchklemregistratie te combineren met channelrhodopsine activering om lange-afstandsprojecties aan IC neuronen te onderzoeken. Hoewel dit protocol is afgestemd op het karakteriseren van auditieve ingangen aan de IC, kan het gemakkelijk worden aangepast om andere lange-afstandsprojecties in de auditieve hersenstam en daarbuiten te onderzoeken.

Introduction

Synaptische verbindingen zijn van cruciaal belang voor neurale circuitfunctie, maar de precieze topologie en fysiologie van synapsen binnen neurale circuits zijn vaak moeilijk experimenteel te onderzoeken. Dit komt omdat elektrische stimulatie, het traditionele instrument van cellulaire elektrofysiologie, lukraak axonen activeert in de buurt van de stimulatiesite, en in de meeste hersengebieden verstrengelen axonen uit verschillende bronnen (lokaal, oplopend en/of dalend). Echter, met behulp van channelrhodopsin assisted circuit mapping (CRACM)1,2, kan deze beperking nu worden overwonnen3. Channelrhodopsine (ChR2) is een licht geactiveerd, kation-selectieve ionenkanaal oorspronkelijk gevonden in de groene alg Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 kan worden geactiveerd door blauw licht van een golflengte rond 450-490 nm, depolariseren van de cel door middel van kation instroom. ChR2 werd voor het eerst beschreven en uitgedrukt in Xenopus eicellen door Nagel en collega's4. Kort daarna, Boyden en collega's5 uitgedrukt ChR2 in zoogdierneuronen en toonde aan dat ze lichtpulsen konden gebruiken om betrouwbaar controle spiking op een milliseconde tijdschaal, inducerende actie potentials ~ 10 ms na activering van ChR2 met blauw licht. Optogenetische kanalen met nog snellere kinetiek zijn onlangs gevonden (bijvoorbeeld Chronos6).

De basisbenadering van een CRACM-experiment is om een populatie van vermeende presynaptische neuronen te transfectmet een recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) dat de genetische informatie voor een channelrhodopsine draagt. Transfection van neuronen met rAAV leidt tot de expressie van de gecodeerde channelrhodopsine. Typisch, de channelrhodopsine is gelabeld met een fluorescerend eiwit zoals GFP (Green Fluorescent Protein) of tdTomato (een rood fluorescerend eiwit), zodat transfection van neuronen in het doelgebied gemakkelijk kan worden bevestigd met fluorescentie beeldvorming. Omdat rAAVs niet-pathogene zijn, een laag ontstekingspotentieel hebben en langdurige genexpressie7,8, zijn ze een standaardtechniek geworden om channelrhodopsinen aan neuronen te leveren. Als, na transfection van een vermeende presynaptische populatie van neuronen, activering van een channelrhodopsine door middel van lichtflitsen lokt postsynaptische potentialen of stromingen in de doelneuronen, dit is het bewijs van een axonale verbinding van de transfected kern naar de geregistreerde cel. Omdat afgehakte axonen in hersenslice experimenten kunnen worden gedreven om neurotransmitter release door middel van channelrhodopsine activering, kernen die buiten de acute slice liggen, maar stuur axonen in de postsynaptische hersengebied kan worden geïdentificeerd met CRACM. De kracht van deze techniek is dat de connectiviteit en fysiologie van geïdentificeerde synaptische ingangen over lange afstand direct kunnen worden onderzocht.

In aanvulling op channelrhodopsins die prikkelbaar zijn door blauw licht, onderzoekers hebben onlangs geïdentificeerd verschillende rood-verschoven channelrhodopsins9,10, met inbegrip van Chrimson en zijn snellere analoge ChrimsonR, die beide zijn enthousiast met rood licht van ~ 660 nm6. Roodverschoven opsinen zijn van belang omdat rood licht weefsel beter doordringt dan blauw licht, en rood licht kan een lagere cytotoxiciteit hebben dan blauw licht10,11,12. Rood verschoven channelrhodopsinen openen ook de mogelijkheid van dual color CRACM experimenten, waarbij de convergentie van axonen uit verschillende kernen op hetzelfde neuron kan worden getest in een experiment6,13,14. Echter, de huidige rood-verschoven opsins vertonen vaak ongewenste kruisactivering met blauw licht15,16,17, waardoor twee kleur experimenten moeilijk. Bovendien hebben sommige rapporten aangegeven dat ChrimsonR beperkte axonale handel ondergaat, wat het moeilijk kan maken om ChrimsonR te gebruiken voor CRACM-experimenten16,17.

Bijna alle opgaande projecties van de lagere auditieve hersenstamkernen komen samen in de inferieure colliculus (IC), de midbrain hub van de centrale auditieve route. Dit omvat projecties van de cochleaire kern (CN)18,19, het grootste deel van het superieure olivariecomplex (SOC)20, en de dorsale (DNLL) en ventrale (VNLL) kernen van de laterale lemniscus21. Bovendien eindigt een grote dalende projectie van de auditieve cortex in de IC18,19,20,21,22, en IC-neuronen zelf synaps breed binnen de lokale en contralaterale kwabben van de IC23. Het vermengen van axonen uit vele bronnen heeft het moeilijk gemaakt om IC-circuits te sondemeten met behulp van elektrische stimulatie24. Als gevolg daarvan, hoewel neuronen in de IC berekeningen uit te voeren belangrijk voor geluidslokalisatie en de identificatie van spraak en andere communicatie geluiden25,26, de organisatie van neurale circuits in de IC is grotendeels onbekend. We hebben onlangs geïdentificeerd VIP neuronen als de eerste moleculair identificeerbare neuron klasse in de IC27. VIP-neuronen zijn glutamatergic stellate neuronen die projecteren op verschillende lange-afstandsdoelen, waaronder de auditieve thalamus en superieure colliculus. We zijn nu in staat om de bronnen en functie van lokale en lange-afstandsingangen voor VIP-neuronen te bepalen en te bepalen hoe deze circuitverbindingen bijdragen aan geluidsverwerking.

Het hier gepresenteerde protocol is afgestemd op het onderzoeken van synaptische ingangen van VIP-neuronen in de IC van muizen, met name van de contralaterale IC en de DCN (Figuur 1). Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan verschillende bronnen van input, een ander neuron type of een ander hersengebied helemaal. We laten ook zien dat ChrimsonR een effectieve roodverschoven kanaalrhodopsine is voor lange afstand circuit mapping in de auditieve hersenstam. We tonen echter aan dat ChrimsonR sterk wordt geactiveerd door blauw licht, zelfs bij lage intensiteiten, en dus, om ChrimsonR te combineren met Chronos in tweekleurige CRACM-experimenten, moeten zorgvuldige controles worden gebruikt om kruisactivering van ChrimsonR te voorkomen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Krijg goedkeuring van het lokale Comité voor institutionele dierenverzorging en -gebruik (IACUC) en houd zich aan de NIH-richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Alle procedures in dit protocol werden goedgekeurd door de Universiteit van Michigan IACUC en waren in overeenstemming met NIH richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.

1. Chirurgie Voorbereidingen

  1. Voer operaties uit in aseptische omstandigheden. Autoclave/steriliseren alle chirurgie hulpmiddelen en materialen vóór chirurgie. Draag een operatie jurk en masker voor de operatie.
  2. Sanitize de operatie gebied (spray en veeg met 70% ethanol), en plaats steriele handdoek gordijnen om de operatie gebied te dekken.
  3. Bereid de herstelkooi voor. Verwijder kooibeddengoed om het risico op verstikking te beperken. Leg een verwarmingskussen onder de kooi. Zorg voor een voedsel- en waterbron.
  4. Trek een glazen capillaire voor de nanoinjector op een pipet trekker. De intense warmte van de verwarmingsgloeidraad tijdens het trekproces zal de glascapillaire steriliseren. Snijd of breek de punt af om een opening met een diameter van ongeveer 5 μm te verkrijgen.
  5. Schuin de capillaire punt tot een hoek van ongeveer 30° om de weefselpenetratie te verbeteren en verstopping te verminderen. Vul de capillaire met minerale olie en voeg in een nanoliter injector.
  6. Verkrijg een aliquot van de gewenste channelrhodopsin-encoding rAAV en verdun tot de gewenste titer met behulp van steriele PBS.
    OPMERKING: We hebben vastgesteld dat serotype 1 rAAVs goed werken voor transfection van auditieve hersenstam kernen. Met name rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH (blauw licht geactiveerde kanaalrhodopsine) en rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH (roodverschoven kanaalrhodopsine), die beschikbaar zijn in openbaar toegankelijke repositories en vectorkernen, consequent opleveren de hoge expressie niveaus en een goede lange afstand axonale handel in channelrhodopsins die nodig zijn voor CRACM experimenten.
  7. Volg injectorinstructies om voorin te vullen capillair met 1-3 μL rAAV in steriele PBS.

2. Chirurgie

  1. Zet het dier in een inductiekamer en induceer anesthesie met 3% isoflurane in zuurstof geleverd via een gekalibreerde isoflurane vaporizer. Observeer de muis tot de ademhaling wordt diep en langzaam en een teen knijpen reflex is afwezig, ongeveer 3-5 min.
  2. Breng het dier naar een stereotaxic frame. Zet het hoofd van het dier vast door zijn mond op een mondbar te zetten met een gasanesthesiemasker en door niet-perforerende oorstaven in beide oorkanalen te plaatsen.
  3. Plaats een rectale temperatuursonde en schakel de homeostatische temperatuurregelaar in.
  4. Breng oogheelkundige zalf aan om te voorkomen dat de ogen uitdrogen.
  5. Preëmptief pijnstillend (bijv. onderhuidse injectie van 5 mg/kg carprofen).
  6. Pas isoflurane aan 1-2,5%, afhankelijk van de diepte van de verdoofde toestand. Controleer de temperatuur, ademhaling en kleur van slijmvliezen ten minste om de 15 minuten tijdens de procedure.
  7. Scheer hoofdhuid met elektrische tondeuses. Aseptisch bereiden hoofdhuid met drie afwisselende wattenstaafjes van povidone-jodium en 70% ethanol.
  8. Maak een incisie in de hoofdhuid langs de middellijn beginnen tussen de oren en de voortzetting van rostral aan de ogen, bloot de lambda en bregma hechtingen. Duw de huid naar de zijkant en verwijder periosteum van blootgesteld bot indien nodig.
  9. Markeer de lambda hechting met een steriele chirurgische marker, plaats het puntje van de nanoinjector, zodat het gewoon lambda aanraakt, en nul de micromanipulator coördinaten. Gebruik de nanoinjectortip en micromanipulator om het hoogteverschil tussen de lambda- en bregma-hechtingen te meten. Pas de smaakbalkhoogte aan om lambda en bregma binnen ± 100 μm hoogteverschil te brengen.
  10. Breng de injectieplaats in kaart met behulp van de nanoinjectortip en het micromanipulatorcoördinatiesysteem en markeer de site met een steriele chirurgische marker. Als u de IC of DCN van P21-P30-muizen wilt injecteren, gebruikt u coördinaten ten opzichte van de lambdahechting, zoals aangegeven in tabel 1. Merk op dat de Z diepte in onze coördinaten wordt gemeten vanaf het oppervlak van de schedel bij lambda.
  11. Gebruik een micromotorische boor met een steriele boorbraam van 0,5 mm om een craniotomie uit te voeren boven de injectieplaats.
  12. Om te zorgen voor een brede transfection van neuronen in de doelkern, injecties te maken op verschillende diepten in het weefsel(Tabel 1, Z coördinaten), en, in het geval van grotere hersengebieden zoals de IC, injecties te maken in de loop van twee of meer penetraties op verschillende X en Y coördinaten(Tabel 1, Juiste IC penetratie 1 en Rechts IC penetratie 2).
  13. Voer injecties uit. Voor IC-injecties deponeert u 20 nL virus met intervallen van 250 μm langs de Z-as (injectiediepte) tussen 2.250 μm en 1750 μm diepte. Voor DCN-injecties deponeert u 20 nL virus op een diepte van respectievelijk 4.750 μm en 4.550 μm.
  14. Wacht na injectie bij elke Z-coördinaat 2-3 minuten voordat u de injector naar de volgende Z-coördinaat verplaatst. Dit zal tijd voor het virus om zich te verspreiden uit de buurt van de injectie plaats, het verminderen van de kans dat het virus zal worden opgezogen de injectie kanaal wanneer de nanoinjector wordt verplaatst.
  15. Wacht na de laatste injectie in een penetratie 3-5 minuten voordat u nanoinjector uit de hersenen terugtrekt.
  16. Wanneer de nanoinjector uit de hersenen wordt verwijderd tussen penetraties en tussen dieren, gooi je een klein volume virus uit de punt om te controleren of de tip niet verstopt is.
  17. Gebruik na injecties steriele PBS om de snijkanten van de hoofdhuid nat te maken en beweeg de huid vervolgens voorzichtig terug naar de middellijn. Sluit de wond met eenvoudige onderbroken hechtingen met behulp van 6-0 (0,7 metrische) nylon hechtingen.
  18. Breng 0,5-1 mL van 2% lidocainegel aan op de wond.
  19. Verwijder oorstaven en temperatuursonde, schakel isoflurane uit, verwijder de muis uit de gehemeltebalk en breng deze over naar de herstelkooi.
  20. Controleer het herstel op de voet. Zodra het dier volledig wakker is, bewegen, en het tonen van geen tekenen van pijn of nood, breng het terug in zijn kooi en keer de kooi terug naar het vivarium.
  21. Als operaties zullen worden uitgevoerd op meerdere dieren in een dag, gebruik maken van een hete kraal sterilisator te ontsmetten chirurgie tools en boor braam voor de volgende operatie.

3. Chirurgische follow-up

  1. Controleer dieren dagelijks op wondsluiting, infectie of tekenen van pijn of nood in de komende 10 dagen, en zich aan de richtlijnen voor dierenverzorging van de instelling.
  2. Wacht 3-4 weken voordat u dieren in experimenten gebruikt om de kanaalropsinen optimaal te laten worden expressie.

4. Brain Slice Voorbereiding en bevestiging van injectie doel

  1. Gebruik voor CRACM scherp bereide hersenschijfjes van getransfecteerde dieren in standaard in vitro elektrofysiologie-experimenten, die hier slechts kort worden beschreven (zie Goyer et al. 2019 voor een meer gedetailleerde beschrijving27).
  2. Bereid kunstmatige hersenvocht (ACSF) voor die (in mM): 125 NaCl, 12,5 D-glucose, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1,5 CaCl2, 1 MgSO4. Bubble ACSF naar een pH van 7,4 met 5% CO2 in 95% O2.
  3. Voer alle volgende stappen uit, inclusief in vitro elektrofysiologie, in bijna-duisternis of rood licht om de activering van channelrhodopsinen te beperken.
  4. Diep verdoven muis met isoflurane en onthoofden het snel. Ontleed de hersenen snel in ~34 °C ACSF.
  5. Snijd coronale plakjes (200-250 μm) met de IC in ~34 °C ACSF met een trillend microtoom en uitbroed de plakjes bij 34 °C gedurende 30 min in een met ACSF gevulde holdingkamer met 5% CO2 in 95% O2. Na incubatie, op te slaan plakjes op kamertemperatuur tot gebruikt voor opnames.
  6. Als het injectiedoel niet de IC was, snijd dan extra coronale plakjes van het geïnjecteerde hersengebied en controleer de transfection van de doelkern onder een fluorescentiemicroscoop. Als er geen transfection in de doelkern of extra transfection in verschillende hersenengebieden is, ga niet met experiment verder.

5. In Vitro Recording en CRACM Experiment

OPMERKING: Om optische stimulatie van Chronos en ChrimsonR te bieden, gebruiken we LED's gekoppeld aan de epifluorescentiepoort van de microscoop. Lasers kunnen echter worden gebruikt in plaats van LED's. Bij het gebruik van lasers, het verkrijgen van voorafgaande goedkeuring van institutionele veiligheidsfunctionarissen en volg passende richtlijnen voor veilig lasergebruik.

  1. Trek elektroden uit borosilicaatglas naar een weerstand van 3,5-4,5 MΩ. De interne elektrodeoplossing moet (in mM): 115 K-gluconaat, 7,73 KCl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 10 Na2 phosphocreatine, 4 MgATP, 0,3 NaGTP, aangevuld met 0,1% biocytine (w/v), pH aangepast tot 7,3 met KOHmol en osmaliteit tot 290 mOsm/kg met sacharose.
  2. Gebruik standaard patchklemmethoden om opnames te maken. Plaats het segment in een opnamekamer onder een vaste trap rechtop microscoop en continu doorbezielen met ACSF op ~ 2 mL/min. Voer opnames in de buurt van fysiologische temperatuur (~ 34-36 °C).
  3. Patch neuronen onder visuele controle met behulp van een geschikte patch klem versterker. Corrigeer voor serieweerstand, pipetcapaciteit en vloeibaar verbindingspotentieel.
  4. Activeer tijdens hele celopnames Chronos door korte pulsen (1-5 ms) van 470 nm licht of ChrimsonR te leveren door korte pulsen van 580 nm licht door commercieel verkrijgbare LED's. Bepaal de drempel van opsin activering en gebruik een minimale stimulatie protocol om berichtenynaptische mogelijkheden uit te lokken. Gebruik in het algemeen de kortste stimulusduur die een PSP uitlokt en stel de optische kracht in op 120% van het drempelvermogen dat nodig is om PSPs uit te lokken.
  5. Om te bevestigen dat de geregistreerde veranderingen in membraanpotentieel inderdaad synaptische ingangen zijn voor het neuron, kunnen standaard antagonisten voor excitatory/inhibitory postsynaptische receptoren tijdens het experiment worden gewassen. Om verschillende receptorbijdragen aan een PSP te onderzoeken (bijvoorbeeld NMDA vs AMPA-receptoren), kunnen geschikte receptorantagonisten worden gewassen. Voor elke receptor antagonist, drug effecten moeten omkeren na washout.
  6. Gebruik de latentie, jitter en betrouwbaarheid van PSPs om te bevestigen dat lichtgeactiveerde synaptische ingangen afkomstig zijn van directe, optische activering van synapsen op het opgenomen neuron, in tegenstelling tot activering van channelrhodopsin-uitdrukkende synapsen op een tussenliggende neuron dat synapsen op het geregistreerde neuron. Over het algemeen lage latentie (<2 ms), lage jitter (<1 ms standaarddeviatie in latentie) en hoge betrouwbaarheid (>50%) geven een directe synaptische verbinding van de channelrhodopsine uitdrukken presynaptic neuron naar de opgenomen neuron.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We staken VIP-IRES-Cre muizen (Viptm1 (cre)Zjh/J) en Ai14 Cre-reporter muizen (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) om F1-nakomelingen te genereren waarin VIP-neuronen het fluorescerende eiwit tdTomato uitdrukken. F1 nakomelingen van beide geslachten werden gebruikt, leeftijd postnatale dag (P) 21 tot P70. In totaal werden 22 dieren gebruikt in deze studie.

Stereotaxic injectie van AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH in de juiste IC van VIP-IRES-Cre x Ai14 muizen met behulp van coördinaten weergegeven in tabel 1 resulteerde in een sterke Chronos-EGFP expressie in de juiste IC (Figuur 2A). Visuele inspectie van Chronos-EGFP fluorescentie aangegeven dat de meeste van de somata gelabeld in de juiste IC waren gelegen in de centrale kern van de IC (ICc), maar gelabeld somata waren soms ook aanwezig in de rugschors van de IC (ICd) en af en toe in de laterale cortex van de IC (IClc). De doelgerichtheid en de omvang van de transfection moeten worden gecontroleerd op elk dier dat in een experiment wordt gebruikt, aangezien expressie van channelrhodopsinen in niet-gerichte regio's kan leiden tot valse positieven. Om een bredere of meer beperkte expressie van Chronos te bereiken, kunnen de hoeveelheid gedeponeerd virus en de stereotaxic coördinaten eenvoudig worden aangepast om het gewenste resultaat te bereiken.

Stereotaxic injectie van AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH in de DCN (zie coördinaten in tabel 1) van VIP-IRES-Cre x Ai14 muizen resulteerdein een sterke transfection van DCN neuronen(figuur 2B). Om selectieve transfection van het DCN te bevestigen, moet de hersenstam van elk dier worden gesneden om na te gaan of egfp-expressie aanwezig was en beperkt tot het DCN. Als er geen transfection is of als er een aanzienlijke expressie van EGFP in de gehoorzenuw of VCN is, mogen er geen opnames worden uitgevoerd. Met behulp van de coördinaten in tabel 1 met een totaal injectievolume van 40 nL, zal de Chronos-EGFP-expressie in de meeste gevallen beperkt blijven tot het DCN. EGFP-gelabelde axonen waren aanwezig in de linker (contralaterale) ICc 3 weken na injectie voor zowel IC- als DCN-injectieplaatsen(figuur 2A rechts, 2B rechts).

Om de langeafstandshandel van ChrimsonR, AAV1, te testen. Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH werd geïnjecteerd in de juiste DCN van VIP-IRES-Cre x Ai14 muizen, met dezelfde coördinaten als bij Chronos injecties. ChrimsonR injectie leidde tot sterke expressie in de DCN, met tdTomato fluorescentie zichtbaar in cellen en vezels (Figuur 3A). In de contralaterale ICc, vezels sterk gelabeld met tdTomato waren duidelijk zichtbaar na 3 weken, waaruit blijkt dat de lange afstand handel vermogen van de ChrimsonR-tdTomato constructie wanneer geïnjecteerd in auditieve hersenstam kernen (Figuur 3B). Optische activering van ChrimsonR ontlokte EPSPs in IC VIP neuronen(Figuur 3C),wat aangeeft dat ChrimsonR is een nuttig hulpmiddel voor lange afstand CRACM experimenten wanneer de experimentele parameters vereisen het gebruik van rood licht in plaats van blauw licht. We ontdekten echter dat ChrimsonR gemakkelijk werd geactiveerd met blauw licht, met dezelfde drempel voor blauw licht activering als Chronos (Figuur 4). De gevoeligheid van ChrimsonR voor blauw licht betekent dat bijzondere zorg moet worden genomen om onderscheid te maken tussen inputs die zijn transfecteerd met ChrimsonR of Chronos in hetzelfde dier13.

Bij het richten van opnames op VIP-neuronen in de contralaterale (links) ICc na injecties in de juiste IC, blauw licht flitsen ontlokte excitatory postsynaptic potentials (EPSPs) of remmende postsynaptic potentials (IPSPs). Dit bevestigt commissurale projecties aan VIP-neuronen. Om commissurale EPSP's en IPSPs afzonderlijk te analyseren, gebruikten we receptorantagonisten om IPSPs te blokkeren tijdens EPSP-opnames, en vice versa. Representatieve EPSP's en IPSP's die tijdens CRACM-experimenten zijn opgenomen, zijn weergegeven in figuur 5. IPSPs werden waargenomen in 6 van de 12 geteste ICc VIP neuronen. IPSPs waren klein (1,53 mV ± 0,96 mV) en hadden matige kinetiek. De 10 - 90% stijgingstijden ipsps waren 7,8 ms ± 2,1 ms, halve breedtes waren 15,1 ms ± 6,8 ms, en vervaltijd constanten waren 32,4 ms ± 17,0 ms (Figuur 5A, links). IPSPs werden bemiddeld door GABAA receptoren, omdat ze werden geblokkeerd door 5 μM gabazine, een GABAA receptor antagonist (Figuur 5A, rechts; n = 6). EPSPs werden waargenomen in 11 van de 27 ICc VIP neuronen getest. Epsps waren ook klein (1.52 mV ± 1.08 mV) en hadden gematigde kinetiek. De 10 - 90% stijgingstijden van EPSP's waren 8,3 ms ± 4,3 ms, halve breedtes waren 19,6 ms ± 7,6 ms, en vervaltijdconstanten waren 43,5 ms ± 16,8 ms (Figuur 5B "Controle"). Epsps werden bemiddeld door AMPA en NMDA receptoren. Toepassing van 50 μM D-AP5, een NMDA-receptorantagonist, verminderde EPSP-halve breedte (14,3 ms ± 4,7 ms, p = 0,006) en trended naar vermindering van de stijgingstijd (6,3 ms ± 1,6 ms, p = 0,09), vervaltijdconstant (30,6 ms ± 7,3 ms, p = 0,06) en EPSP-amplitude (1,38 ± 0,33 mV, p = 0,105; ANOVA voor herhaalde metingen met Tukey post-hoc test). Toepassing van 10 μM NBQX, een AMPA-receptorantagonist, blokkeerde de rest van de EPSP (figuur 5B "+ AP5 & NBQX").

Opnames van VIP-neuronen in de linker ICc na DCN injecties bleek EPSPs opgeroepen door blauw licht knippert, bevestiging van synaptische ingangen van de DCN naar VIP-neuronen in de IC. DCN CRACM experimenten werden uitgevoerd met GABAergic en glycinergic blockers in het bad om spontane IPSPs te blokkeren. We vonden dat 2-5 ms pulsen van blauw licht epsps ontlokte in 19 van de 25 geteste neuronen. Licht opgeroepen EPSP's hadden matige amplitudes (2,85 mV ± 2,98 mV) en relatief trage stijgingstijden (4,2 ms ± 1,3 ms), halve breedtes (20,6 ms ± 14,4 ms) en vervaltijdconstanten (22,0 ms ± 6,7 ms) (n = 6 cellen, gegevens niet weergegeven).

Alle PSPs opgeroepen door Chronos of ChrimsonR activering werden ontlokt in een all-or-none mode en niet schalen hun amplitude met toenemende optische kracht (gegevens niet getoond). Dit resultaat hangt echter af van het aantal en de fysiologie van de transfected synapsen die input leveren aan een bepaald neuron en zal daarom waarschijnlijk variëren afhankelijk van de bijzondere combinatie van axonale projectie en neuron type wordt onderzocht.

Figure 1
Figuur 1: rAAV-injectieplaatsen en experimentele installatie. (A) Injectieplaats en experimentele opstelling om commissurale projecties te onderzoeken. Links: Een rAAV constructie (bijvoorbeeld rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH) wordt geïnjecteerd in de juiste IC en gerichte opnames worden uitgevoerd in de contralaterale IC. Rechts: Tijdens patch klem opnames, Chronos-transfected vezels zijn opgewonden met blauw licht om berichtenynaptische mogelijkheden uit te lokken. (B) Injectieplaats en experimentele opstelling om lange-afstandsprojecties van DCN naar IC te onderzoeken. Links: De ChrimsonR constructie wordt geïnjecteerd in de rechter DCN en gerichte opnames worden uitgevoerd in de contralaterale IC. Rechts: Tijdens patch klem opnames, ChrimsonR-transfected vezels zijn opgewonden met rood licht op te nemen ChrimsonR opgeroepen postsynaptic potentials. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Chronos-EGFP expressie na injecties in IC en DCN. (A) Links: Afbeelding van coronale IC slice met tdTomato-gelabelde VIP-neuronen in de IC (magenta) en Chronos-EGFP expressie in somata gelokaliseerd op de injectieplaatsen in de juiste IC (groen). Rechts: Afbeelding met een hogere vergroting die een opgenomen VIP-neuron (wit-groen) laat zien in de IC contralaterale naar de injectieplaats. Groene puncta zijn Chronos-EGFP uitdrukken projecties van de contralaterale IC. (B) Afbeelding van coronale hersenstam slice met Chronos-EGFP expressie in de DCN na rAAV-Chronos-EGFP injectie. Links: Afbeelding van de DCN, met getransfected DCN en EGFP-positieve vezels die de dorsale akoestische stria binnendringen. Midden: Afbeelding met een hogere vergroting met Chronos-transfected cellichamen in het DCN. Rechts: Chronos-EGFP expressie in vezels en terminals in de contralaterale IC van lange afstand DCN-IC projecties. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: ChrimsonR-tdTomato expressie in de DCN en DCN projecties aan de IC. (A) Afbeelding van een coronale hersenstam slice van een muis waarin de juiste DCN werd geïnjecteerd met rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH. Links: Afbeelding van ChrimsonR-expressie in de rechter DCN. Rechts: Hogere vergroting beeld van rechts DCN met sterke transfection van neuronen met ChrimsonR. (B) Hoge vergroting beeld van ChrimsonR-transfected DCN axonen in de IC. (C) Optogenetisch opgeroepen EPSPs opgenomen uit een VIP-neuron in de IC contralaterale aan de rAAV-ChrimsonR geïnjecteerd DCN. Originele sporen worden weergegeven in lichtgrijs en de gemiddelde EPSP is in het rood. Oranje doos geeft de timing van 590 nm lichtpuls. Schaalbalken = 20 ms/0,5 mV. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Activering van ChrimsonR door lage niveaus van blauw licht. (A) Activering van Chrono's in commissurale projecties door pulsen van 470 nm blauw licht. Top: Originele sporen (lichtgrijs) en gemiddelde (cyaan) van Chronos-aangedreven IPSPs, opgeroepen met een optisch vermogen iets boven de drempel voor Chronos activering (schaalbalken tonen 20 ms/0,5 mV). Onderkant: Relatie tussen optische kracht op 470 nm en de kans op het observeren van een Chronos-opgeroepen PSP. (B) Activering van ChrimsonR met 470 nm blauw licht. Top: Originele sporen (lichtgrijs) en gemiddelde (rood) van ChrimsonR-aangedreven EPSPs, opgeroepen met 470 nm blauw licht op hetzelfde optische vermogen gebruikt in A, top (schaal balken tonen 20 ms/0.5 mV). Onderkant: Relatie tussen optische kracht op 470 nm en de kans op het observeren van een ChrimsonR-aangedreven PSP. Merk op dat de drempel voor blauw licht activering van ChrimsonR PSPs was identiek aan de drempel voor het uitlokken van Chronos PSPs. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Karakterisering van licht opgeroepen PSPs van commissurale synapsen op VIP-neuronen. De juiste IC werd geïnjecteerd met rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH en opnames werden gemaakt van VIP neuronen in de contralaterale ICc. (A) Optogenetisch opgeroepen IPSPs werden opgeroepen door 2-5 ms blauw licht knippert (links), terwijl EPSPs werden geblokkeerd door 10 μM NBQX en 50 μM D-AP5. IPSPs werden afgeschaft door gabazine (rechts). (B) Optogenetisch opgeroepen EPSP's werden opgeroepen door 2-5 ms blauw licht knippert (links), terwijl IPSPs werden geblokkeerd met 1 μM strychnine en 5 μM gabazine. Wash-in van 50 μM D-AP5 aanzienlijk verminderd de halve breedte en verval tijd constante van licht opgeroepen EPSPs (midden). Wash-in van 10 μM NBQX schafte de resterende EPSP (rechts) af. Originele sporen in A en B worden weergegeven in lichtgrijs, en gemiddelden van maximaal 50 individuele sporen worden weergegeven in het zwart. Van Goyer et al., 2019. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

X (lateral) Y (caudal) Z (diepte)
Juiste IC penetratie 1 1.000 μm -900 μm 2.250-1500 μm
(stappen van 250 μm)
Juiste IC penetratie 2 1.250 μm -900 μm 2.250-1750 μm
(stappen van 250 μm)
Rechts DCN 2.155 μm -1325 μm 4.750 μm, 4.550 μm

Tabel 1: Stereotaxic coördinaten voor rAAV-injecties in IC en DCN. Alle coördinaten zijn verwant aan lambda in μm. Z-coördinaten worden gemeten vanaf het rugoppervlak van de schedel bij lambda.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We hebben ontdekt dat CRACM is een krachtige techniek voor het identificeren en karakteriseren van lange afstand synaptische ingangen aan neuronen in de muis IC. Naar aanleiding van het protocol dat hier is beschreven, bereikten we robuuste transfection van neuronen in de DCN en IC, evenals betrouwbare axonale handel van Chronos en ChrimsonR naar synaptische terminals in de IC. Daarnaast hebben we aangetoond dat deze techniek het mogelijk maakt om berichtenynaptische gebeurtenissen te meten en te analyseren, waaronder PSP-amplitude, halve breedte, vervaltijd en receptorfarmacologie. Onze ervaring suggereert dat deze aanpak gemakkelijk kan worden aangepast om functionele circuit mapping experimenten uit te voeren in de auditieve hersenstam en daarbuiten.

Over het algemeen biedt de specificiteit van optogenetische circuitmapping een duidelijk voordeel ten opzichte van elektrische stimulatie van axonen. Virale transfections bieden de mogelijkheid om de expressie van channelrhodopsinen ruimtelijk en moleculair te beperken tot een gerichte populatie presynaptische neuronen. Elektrische stimulatie daarentegen kan geen onderscheid maken tussen axonen afkomstig van verschillende presynaptische kernen wanneer deze axonen worden vermengd, zoals in de meeste hersengebieden het geval is. Elektrische stimulatie kan ook initiëren zowel orthodrmic en antidrische pieken, verdere complicerende zaken wanneer een distale stimulatie site bevat axonen afkomstig van neuronen in de buurt van de opnameplaats.

Om te zorgen voor een stabiele expressie en goede axonale handel in een channelrhodopsine, het kiezen van de juiste virale vector en serotype is van het grootste belang. We vonden dat stabiele expressie van Chronos in IC neuronen werd bereikt met een serotype 1 rAAV met inbegrip van een Chronos of ChrimsonR constructie in combinatie met een woodchuck hepatitis posttranscriptional regulatory element (WPRE) en rundergroeihormoon (BGH) polyadenylation signaal. rAAV serotype 5 kon geen functionele opsins produceren in de IC, maar was functioneel in de DCN (gegevens niet getoond). De strenge validatie van injectiecoördinaten voor elk experiment en ervoor zorgen dat opsinexpressie beperkt is tot het beoogde hersengebied is eveneens belangrijk. Een zinvolle identificatie van ingangen is alleen mogelijk als de expressie van de opsin zorgvuldig wordt gecontroleerd en gedocumenteerd voor elk experiment.

De rAAV1.ChrimsonR constructie die in het bovenstaande protocol werd gebruikt, leverde stabiele expressie en goede axonale handel in het eiwit op, zelfs in lange-afstandsprojecties van de DCN naar de IC (figuur 3). Dit maakt ChrimsonR een geschikte opsin voor (lange afstand) circuit mapping. Een rood verschoven opsin eer zoals ChrimsonR kan nuttig zijn als de experimentele parameters lichtpenetratie diep in het weefsel vereisen, maar de experimentator moet zich ervan bewust zijn dat alle momenteel beschikbare roodverschoven opsins enige kruisactivering met blauw licht vertonen. Hoewel sommige studies hebben betoogd dat ChrimsonR en Chronos afzonderlijk kunnen worden geactiveerd6,14,16, onze gegevens suggereren dat grote zorg moet worden genomen met deze aanpak. Een recent rapport beschrijft aanvullende methoden die moeten worden gebruikt bij een poging om rood verschoven opsins te scheiden van Chronos13. Daarom moeten bij het gebruik van ChrimsonR en Chronos in twee kleuren CRACM-experimenten zorgvuldig ontworpen controle-experimenten worden uitgevoerd om een duidelijke scheiding van blauwe en roodverschoven opsinactivering te garanderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door een Deutsche Forschungsgemeinschaft Research Fellowship (GO 3060/1-1, projectnummer 401540516, aan DG) en National Institutes of Health grant R56 DC016880 (MTR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH Addgene 59171-AAV1
AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH Addgene 59170-AAV1
Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) Jackson Laboratory stock #007914
Amber (590nm) LUXEON Rebel LED Luxeon Star LEDs SP-01-A8
Blue (470nm) LUXEON Rebel LED Luxeon Star LEDs SP-01-B4
Carproject (carprofen) Henry Schein Animal Health 59149
Drummond glas capillaries Drummond Scientific Company 3-000-203-G/X
Drummond Nanoject 3 Drummond Scientific Company 3-300-207
Electrode beveler Sutter Instrument FG-BV10-D
Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures Ethicon local pharmacy
Fixed stage microscope any n/a
Gas anesthesia head holder David Kopf Instruments 933-B
General surgery tools Fine Science Tools N/A
Golden A5 pet clipper Oster 078005-010-003
Heating pad Custom build N/A
Hooded induction chamber w/ vacuum system Patterson Scientific 78917760
Hot bead sterilizer Steri 250 Inotech IS-250
Iodine solution 10% MedChoice local pharmacy
Isoflurane vaporizer Patterson Scientific 07-8703592
Lidocain topical jelly 2% Akorn local pharmacy
Micro motor drill 1050 Henry Schein Animal Health 7094351
Micro motor drill bits 0.5 mm Fine Science Tools 19007-05
Motorized Micromanipulator Sutter Instrument MP-285/R
Ophthalmic ointment Artificial Tears Akorn local pharmacy
P-1000 electrode puller Sutter Instrument P-1000
Patch clamp amplifier incl data acquisition software any n/a
Portable anethesia machine Patterson Scientific 07-8914724
Small animal steroetaxic frame David Kopf Instruments 930-B
Standard chemicals local vendors N/A
standard imaging solutions
Sterile towel drapes Dynarex 4410
Surgical marker Fine Science Tools 18000-30
Temperature controller Custom build N/A
Vibratome any n/a
VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) Jackson Laboratory stock #010908
Water bath any n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).
  2. Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping. Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).
  3. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
  4. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).
  5. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  6. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11, 338-346 (2014).
  7. Flotte, T. R. Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).
  8. Aponte-Ubillus, J. J., et al. Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production. Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).
  9. Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13, 325-328 (2016).
  10. Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation. Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).
  11. Mager, T., et al. High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics. Nature Communications. 9, (2018).
  12. Oda, K., et al. Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson. Nature Communications. 9, (2018).
  13. Hooks, B. M. Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations. Current Protocols in Neuroscience. 85, e52 (2018).
  14. Schild, L. C., Glauser, D. A. Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 1029-1034 (2015).
  15. Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience. Neuron. 96, 572-603 (2017).
  16. Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation. Nature Biomedical Engineering. 2, 485 (2018).
  17. Asrican, B., et al. Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  18. Oliver, D. L. Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study. Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).
  19. Oliver, D. L. Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction. Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).
  20. Glendenning, K. K., Masterton, R. B. Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive. Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).
  21. Adams, J. C. Ascending projections to the inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).
  22. Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).
  23. Saldaña, E., Merchań, M. A. Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).
  24. Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  25. Felix, R. A., Gourévitch, B., Portfors, C. V. Subcortical pathways: Towards a better understanding of auditory disorders. Hearing Research. 362, 48-60 (2018).
  26. Winer, J. A., Schreiner, C., et al. The inferior colliculus: with 168 illustrations. Winer, J. A., Schreiner, C. , Springer. New York, NY. (2005).
  27. Goyer, D., et al. A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice. eLife. 8, e43770 (2019).

Tags

Neurowetenschappen Kwestie 156 Channelrhodopsin-assisted circuit mapping optogenetica Chronos ChrimsonR inferieure colliculus auditieve hersenstam
Lange afstand Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping van inferieure Colliculus Neuronen met blauwe en rood-verschoven Channelrhodopsinen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goyer, D., Roberts, M. T. Long-range … More

Goyer, D., Roberts, M. T. Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins. J. Vis. Exp. (156), e60760, doi:10.3791/60760 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter