Summary
מיפוי מעגל בסיוע (CRACM) הוא טכניקה מדויקת עבור מיפוי פונקציונלי של הקרנות נוירואליות ארוכת טווח בין קבוצות מבחינה אנטומית ו/או גנטית מזוהה של נוירונים. כאן, אנו מתארים כיצד להשתמש CRACM כדי למפות את הקשרים שמיעתי גזע המוח, כולל השימוש של opsin העביר אדום, ChrimsonR.
Abstract
כאשר חוקרים את המעגלים העצביים, מגבלה סטנדרטית של הגישה מלחציים מחוץ למבחנה היא כי אקסונים ממקורות מרובים הם לעתים קרובות מעורבים, מה שמקשה על בידוד תשומות ממקורות בודדים עם גירוי חשמלי. עם זאת, על ידי שימוש במתקשרים מיפוי מעגלים (CRACM), מגבלה זו ניתן כעת להתגבר. כאן, אנו מדווחים על שיטה להשתמש ב-CRACM כדי למפות תשומות עולה מתוך גרעיני גזע שמיעתי נמוך המוח ואת תשומות מערכת למעמד מזוהה של נוירונים בתוך הקולקולוס הנחותים (IC), הגרעין המוח המימדי של מערכת השמיעה. ב-IC, מקומי, מבוקר, בסדר עולה, ויורד האקסון הם שזורים היטב ולכן ההבחנה עם גירוי חשמלי. על-ידי הזרקת מבנה ויראלי לביטוי כונן של מתקשר בגרעין טרום-סינפטית, ואחריו הקלטה של מהדק המדבקות כדי לאפיין את הנוכחות והפיזיולוגיה של מתקשרים-הבעת כניסות סינפטיות, תחזיות ממקור מסוים לאוכלוסייה מסוימת של הנוירונים IC ניתן למפות עם דיוק ספציפי לסוג תא. אנו מראים כי גישה זו פועלת עם כרונוס הן, מתקשר כחול המופעל באור, ו ChrimsonR, מתקשר אדום הוזז. בניגוד לדיווחים הקודמים מן המוח הקדמי, אנו מוצאים כי ChrimsonR הוא הנסחרות במורד האקסונים של נוירונים שבלול הראשי גרעין העיקרי, המציין כי ChrimsonR עשוי להיות כלי שימושי עבור ניסויים CRACM בגזע המוח. הפרוטוקול המוצג כאן כולל תיאורים מפורטים של ניתוח הזרקת וירוס בתוך המוח, כולל קואורדינטות סטריאוטקאית עבור זריקות המיקוד על הגרעין שבלול הראש ו IC של עכברים, וכיצד לשלב את כל ההקלטה התא השלם מהדק הקלטה עם הפעלת המתקשר כדי לחקור תחזיות לטווח ארוך כדי נוירונים IC. למרות פרוטוקול זה מותאם לאפיון תשומות שמיעתי ל-IC, זה יכול להיות מותאם בקלות כדי לחקור תחזיות לטווח ארוך אחרים בגזע השמיעה ומעבר.
Introduction
חיבורים סינפטית הם קריטיים לתפקוד המעגל העצבי, אבל הטופולוגיה המדויקת והפיזיולוגיה של הסינפסות בתוך מעגלים עצביים קשים לעתים קרובות לחקור ניסויים. הסיבה לכך היא גירוי חשמלי, הכלי המסורתי של האלקטרופיזיולוגיה התאית, הפעלת אקטונים ללא אבחנה ליד האתר גירוי, וברוב אזורי המוח, אקסונים ממקורות שונים (מקומי, עולה, ו/או יורד) משתלבים. עם זאת, על ידי שימוש במתקשרים החוצה מיפוי מעגלים (CRACM)1,2, מגבלה זו יכולה כעת להתגבר על3. מתקשר (ChR2) הוא ערוץ יון סלקטיבי המופעל באור, שנמצא במקור ב-אצה Chlamydomonas ריינהרטהירוק. ChR2 יכול להיות מופעל על ידי אור כחול של אורך הגל סביב 450-490 ננומטר, להשבית את התא באמצעות הקטיון. ChR2 תוארה לראשונה והתבטא ב קסנפוס אוציטים על ידי nagel ועמיתיו4. זמן קצר לאחר מכן, Boyden ועמיתיו5 הביע ChR2 בנוירונים מיונקים והראו כי הם יכולים להשתמש פולסים אור כדי שליטה מהימנה העולה על ציר הזמן אלפית שניה, גרימת פוטנציאל הפעולה ~ 10 ms לאחר ההפעלה של ChR2 עם אור כחול. ערוצי אלקטרואופטיקה עם קינטיקה מהירה אף יותר נמצאו לאחרונה (למשל, כרונו6).
הגישה הבסיסית לניסוי CRACM היא העברה של אוכלוסיה של נוירונים פרסינפטיים מראש עם רקומביננטי adeno הקשורים וירוס (rAAV) הנושאת את המידע הגנטי עבור המתקשר. העברה של נוירונים עם rAAV מובילה לביטוי של המתקשר המקודד. בדרך כלל, המתקשר הוא מתויג עם חלבון פלורסנט כמו GFP (חלבון פלורסנט ירוק) או tdTomato (חלבון פלורסנט אדום), כך העברה של נוירונים באזור היעד יכול בקלות להיות מאושר עם הדמיה פלואורסצנטית. מכיוון raavs הם שאינם פתוגניים, יש פוטנציאל דלקתי נמוך לאורך זמן ביטוי גנים7,8, הם הפכו טכניקה סטנדרטית כדי לספק מתקשרים לנוירונים. אם, לאחר העברת האוכלוסייה הפרסינפטיות של הנוירונים, הפעלה של מתקשר דרך גלי האור מעורר את הפוטנציאל הפוסט-סינפטיות או הזרמים בנוירונים היעד, זוהי ראיה של חיבור האקסון מן הגרעין מזוהמים אל התא המוקלט. בגלל אקסונים קטוע ניסויים במוח יכול להיות מונע כדי לשחרר נוירוטרנסמיטור באמצעות הפעלת מתקשר, גרעיני כי לשקר מחוץ לפרוסה חריפה אבל לשלוח אקסונים לתוך אזור המוח פוסטסינפטית ניתן לזהות עם CRACM. העוצמה של טכניקה זו היא כי קישוריות ופיזיולוגיה של זיהה תשומות סינפטית לטווח ארוך ניתן לחקור ישירות.
בנוסף למתקשרים שאינם מתלהבים מאור כחול, החוקרים זיהו לאחרונה מספר מתקשרים אדום-הזזה9,10, כולל Chrimson ו כchrimsonr אנלוגי מהיר שלה, שניהם נרגשים עם אור אדום של ~ 660 ננומטר6. המצב האדום-השתנה מעניין בגלל שהאור האדום חודר לרקמה יותר טוב מאור כחול, ולאור האדום אולי יש רעילות נמוכה יותר מאשר אור כחול10,11,12. מתקשר אדום הוזז גם לפתוח את האפשרות של CRACM צבע כפול ניסויים, שבו התכנסות של אקסונים מגרעינים שונים על אותו עצב ניתן לבחון בניסוי אחד6,13,14. עם זאת, הנוכחי באדום העביר opsins לעתים קרובות לא רצויות הפעלה צולבת עם אור כחול15,16,17, ביצוע שני ניסויים בצבע קשה. בנוסף, דיווחים מסוימים ציינו כי chrimsonr עובר סחר סיבי מוגבל, אשר יכול להפוך אותו מאתגר להשתמש chrimsonr עבור CRACM ניסויים16,17.
כמעט כל התחזיות העולה מן גרעיני גזע שמיעתי נמוך להתכנס בתוך הקולקולוס הנחותים (IC), רכזת המוח באמצע של מסלול השמיעה המרכזי. זה כולל התחזיות של גרעין שבלול (CN)18,19, רוב הקומפלקס olivary מעולה (SOC)20, ואת הגרעין (dnll) ו (vnll) הגרעינים של עדשת המים הצדדיים21. בנוסף, הקרנה יורדת בירידה גדולה מקליפת השמיעה מסתיימת ב-18,19,20,21,22, ו-ic הנוירונים עצמם באופן כללי בתוך האונות המקומי והפנימי של23ic. התמזגות של אקסונים ממקורות רבים הפכה את זה קשה לחקור מעגלים IC באמצעות גירוי חשמלי24. כתוצאה מכך, אף על פי שנוירונים בחישובי הביצוע הIC חשובים ללוקליזציה וזיהוי של דיבור ותקשורת אחרים נשמע25,26, הארגון של מעגלים עצביים ב IC הוא ברובו לא ידוע. לאחרונה זיהינו נוירונים VIP כמו שיעור העצב הראשון המאפשר לזיהוי הראשונה ב-IC27. הנוירונים VIP הם glutamatergic stellate נוירונים כי הפרויקט למספר מטרות ארוכות טווח, כולל תלמוס השמיעה ואת הקולקולוס מעולה. כעת אנו מסוגלים לקבוע את המקורות והתפקוד של תשומות מקומיים וארוכי טווח לנוירונים VIP ולקבוע כיצד חיבורי מעגלים אלה תורמים לעיבוד קול.
הפרוטוקול המוצג כאן הוא מותאם לחקירת תשומות סינפטית אל הנוירונים VIP ב IC של עכברים, במיוחד מ IC הצלעות ו DCN (איור 1). ניתן להתאים בקלות את הפרוטוקול למקורות שונים של קלט, סוג תא שונה או אזור מוח שונה לחלוטין. אנו גם מראים כי ChrimsonR הוא מתקשר יעיל אדום העביר המתקשרים עבור מיפוי מעגלים ארוכי טווח בגזע המוח השמיעה. עם זאת, אנו מדגימים כי ChrimsonR מופעל בחוזקה על ידי אור כחול, אפילו בעוצמות נמוכות, ולכן, כדי לשלב ChrimsonR עם כרונו בשני צבעים CRACM ניסויים, פקדים זהירים חייב לשמש כדי למנוע הפעלה צולבת של ChrimsonR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
קבל אישור מתוך הוועדה המקומית לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשתמש (IACUC) ולדבוק הנחיות NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. כל ההליכים בפרוטוקול זה אושרו על ידי אוניברסיטת מישיגן IACUC והיו בהתאם הנחיות NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
1. ההכנות כירורגיה
- לבצע ניתוחים בתנאים אספטי. אוטוקלב/לחטא את כל כלי ניתוח וחומרים לפני הניתוח. ללבוש שמלת כירורגיה ומסכה לניתוח.
- באזור הניתוח (רסס ונגב עם 70% אתנול), והניחו וילונות מגבת סטרילית כדי לכסות את אזור הניתוח.
- . הכן את כלוב ההחלמה להסיר מצעים בכלוב כדי להגביל את הסיכון של חנק. . שים משטח חימום מתחת לכלוב . תספק מקור למזון ולמים
- משוך את נימי הזכוכית בשביל. מזרק הננו על פולר בצנרת חום עז של חוט החימום במהלך תהליך המשיכת יעקר את נימי הזכוכית. גזור או לשבור את הקצה כדי לקבל פתיחה כ 5 יקרומטר קוטר.
- משופע את העצה נימי לזווית כ 30 ° כדי לשפר את חדירת הרקמה ולהפחית את הסתימה. ממלאים את הקפילר בשמן מינרלי ומכניסים לתוך מזרק נאנאוליטר.
- להשיג סדרת מחלקים של המתקשר הרצוי הקידוד raav ו לדלל את סיכוייו הרצוי באמצעות הPBS סטרילי.
הערה: מצאנו כי הסרוטיפ 1 rAAVs לעבוד היטב עבור הזיהום של גרעיני גזע שמיעתי המוח. . באופן ספציפי, rAAV1. צין. כרונו-GFP. bGH (המתקשר אור כחול המופעל) ו rAAV1. Syn. כריסטאר-טדואק. WPRE. bGH (אדום-העברה משתנה), הזמינים ממאגרי וקטורים הנגישים באמצעות לונברית וליבות וקטוריות, בעקביות להניב רמות ביטויים גבוהים וסחר האקסון לטווח ארוך טוב של המתקשרים הדרושים לניסויים CRACM. - עקוב אחר הוראות מזרק הקדמי מילוי נימי עם 1-3 μL של rAAV ב-PBS סטרילי.
2. כירורגיה
- לשים את החיה לתוך חדר אינדוקציה ולגרום הרדמה עם 3% isof, מועבר חמצן באמצעות מכשיר מתאדה מכויל. להתבונן בעכבר עד הנשימה הופך עמוק ואיטי הרפלקס צביטה הבוהן נעדר, כ 3-5 דקות.
- העבירו את בעל החיים. למסגרת סטריאוטקאית אבטחו את ראשו של בעל החיים על ידי הצבת הפה על מסכת חיך עם מסיכת הרדמה לגז ומיקום פסי אוזניים בשתי התעלות.
- הכנס בדיקה לטמפרטורה רקטלית ועבור לבקר הטמפרטורה הומסטטי.
- החל משחה אופטלמולוגית כדי למנוע מהעיניים להתייבש.
- ניהול כאבים מונעת (למשל, הזרקה תת עורית של 5 מ"ג/ק"ג carprofen).
- בהתאם לעומק המצב הורדם. הצג טמפרטורה, נשימה וצבע של קרום רירי לפחות כל 15 דקות במהלך ההליך.
- . לגלח את הקרקפת עם קוצץ חשמלי הכנת הקרקפת עם שלושה שפים לסירוגין של povidone-יוד ו 70% אתנול.
- בצע חתך בקרקפת לאורך קו האמצע החל בין האוזניים והמשך rostral לעיניים, חשיפת התפרים למדא וברז. לדחוף את העור לצד ולהסיר קרום העצם מהעצם חשוף במידת הצורך.
- מארק למדא תפר עם סמן כירורגי סטרילי, למקם את קצה הננו מזרק כך שהוא רק נגע למדא, ולאפס את קואורדינטות מיקרומניפולציה. השתמש בעצת הננו-מזרק ובמיקרומניפולציה כדי למדוד את ההפרש בהעלאת הגובה בין למדא לבין התפרים בברגמה. התאם את גובה פס החיך כדי להביא את למדא ואת ברסגמה בתוך ± 100 יקרומטר הפרש גובה.
- מפה את אתר ההזרקה באמצעות טיפ ננו מזרק מערכת קואורדינטות מיקרומניפולציה ולסמן את האתר עם סמן כירורגי סטרילי. כדי להזריק את IC או DCN של עכברים P21-P30, להשתמש קואורדינטות ביחס ללמדה תפר, כפי שמוצג בטבלה 1. שימו לב כי עומק Z בקואורדינטות שלנו נמדד מפני השטח של הגולגולת ב למדא.
- השתמש בתרגיל micromotor עם מקדחה סטרילי 0.5 מ"מ בר לבצע פתיחת הגולגולת מעל אתר ההזרקה.
- כדי להבטיח שינוי נרחב של נוירונים בגרעין היעד, לעשות זריקות בעומקים שונים לתוך הרקמה (שולחן 1, קואורדינטות Z), ו, במקרה של אזורים המוח גדול יותר כמו IC, לבצע זריקות על מסלול של שני חדירות או יותר בקואורדינטות X ו-Y שונים (שולחן 1, זכות החדירה Ic 1 ו-ימין החדירה
- לבצע זריקות. עבור זריקות IC, הפקדה 20 nL של וירוס במרווחים של 250 יקרומטר לאורך ציר Z (עומק ההזרקה) בין 2,250 יקרומטר ו 1750 יקרומטר עומק. עבור זריקות dcn, הפקדה 20 nL של וירוס בעומק של 4,750 יקרומטר ו 4,550 יקרומטר, בהתאמה.
- לאחר ההזרקה בכל קואורדינטת Z, המתן 2-3 דקות לפני הזזת מזרק לקואורדינטת Z הבאה. זה יאפשר זמן וירוס מפוזר הרחק מהאתר ההזרקה, הפחתת ההסתברות כי וירוס יהיה למצוץ את מערכת ההזרקה כאשר מזרק ננו ממקם מרחוק.
- לאחר ההזרקה האחרונה חדירה, לחכות 3-5 דקות לפני לנסוג ננו מזרק מהמוח.
- כאשר הננו-מזרק מוסר מן המוח בין חדירות ובין בעלי חיים, להוציא נפח קטן של וירוס מהקצה כדי לבדוק שהקצה לא היה סתום.
- לאחר זריקות, השתמש PBS סטרילי להרטיב את הקצוות לחתוך של הקרקפת ולאחר מכן בעדינות להעביר את העור חזרה לכיוון האמצע. סגור את הפצע עם תפרים מקוטע פשוטה באמצעות 6-0 (0.7 מטרי) תפרים ניילון.
- החל 0.5-1 מ ל של 2% ג'ל לידוקאין על הפצע.
- להסיר את פסי האוזן ולבדוק את הטמפרטורה, לכבות את isofלאנה, להסיר את העכבר מבר החיך ולהעביר אותו לכלוב ההתאוששות.
- . שחזור הפיקוח הדוק ברגע שהחיה ערה לגמרי, נעה מסביב, ולא מראה סימנים של כאב או מצוקה, העבירו אותו בחזרה לכלוב שלו והחזר את הכלוב לתוך הvivarium.
- אם הניתוחים יבוצעו על בעלי חיים מרובים ביום אחד, השתמש בעיקור חרוזים חם כדי להפעיל כלים לניתוח ולקדוח בבור לפני הניתוח הבא.
3. המשך טיפול כירורגי
- בדוק בעלי חיים מדי יום לסגירת פצע, זיהום, או סימנים של כאב או מצוקה במהלך 10 הימים הבאים, הקפדה על ההנחיות לטיפול בבעלי חיים.
- המתן 3-4 שבועות לפני השימוש בבעלי חיים בניסויים כדי לאפשר ביטוי אופטימלי של המתקשרים.
4. הכנת המוח ואישור הזרקת מטרה
- עבור CRACM, השתמש בפרוסות מוחית מוכנות ביותר מבעלי חיים מזוהמים בתקן בניסויים אלקטרופיזיולוגיה של מבחנה, המתוארים כאן רק בקצרה (ראה גוייר ואח ' 2019 לתיאור מפורט יותר27).
- הכנת נוזל מלאכותי שדרתי (ACSF) המכיל (ב mM): 125 הנאקל, 12.5 D-גלוקוז, 25 נחקו3, 3 kcl, 1.25 נה2PO4, 1.5 Cacl2, 1 mgso4. בועה ACSF pH של 7.4 עם 5% CO2 ב 95% O2.
- בצע את כל השלבים הבאים, כולל בפיזיולוגיה של החוץ, בחושך או באור אדום כדי להגביל את הפעלת המתקשרים.
- . וערוף את ראשו במהירות מנתח את המוח במהירות ~ 34 ° צ'.
- לגזור פרוסות ילתית (200-250 μm) המכיל את IC ב-~ 34 ° צ' צלזיוס עם מיקרוטומה רוטט ו דגירה את הפרוסות ב 34 ° צ' עבור 30 דקות בתא מחזיק מלא acsf בוקבלד עם 5% CO2 ב 95% O2. לאחר הדגירה, לאחסן פרוסות בטמפרטורת החדר עד לשימוש הקלטות.
- אם מטרת ההזרקה לא היה IC, לחתוך פרוסות מקוראליות נוספות של אזור המוח הוזרק ולבדוק את החיתוך של גרעין היעד תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית. אם אין שינוי בגרעין היעד או בשיטת החצייה הנוספת באזורי מוח שונים, אל תמשיך בניסוי.
5. הקלטת וניסוי CRACM
הערה: כדי לספק גירוי אופטי של כרונו ו ChrimsonR, אנו משתמשים בנוריות בשילוב לנמל האפיסוננטית של המיקרוסקופ. עם זאת, לייזרים ניתן להשתמש במקום נוריות. אם באמצעות לייזרים, לקבל אישור מראש מפקידי בטיחות מוסדיים ולעקוב אחר ההנחיות המתאימות לשימוש לייזר בטוח.
- משוך אלקטרודות מזכוכית בורוסיליקט להתנגדות של 3.5-4.5 MΩ. הפתרון הפנימי של האלקטרודה צריך להכיל (ב-mM): 115 K-גלוקונאט, 7.73 KCl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 10 Na2 פוספולוקראטין, 4 MgATP, 0.3 nagtp, שיושלם עם 0.1% biocytin (w/v), pH מותאם ל7.3 עם קו ו-osmolality ל290 mosm/ק"ג עם סוכרוז.
- כדי ליצור הקלטות, השתמש בשיטות הצבת תיקון סטנדרטיות. מניחים את הפרוסה בתא הקלטה תחת מיקרוסקופ בשלב קבוע זקוף באופן רציף עם ACSF ב ~ 2 mL/min. הקלטת הקלטות ליד הטמפרטורה הפיזיולוגית (~ 34-36 ° c).
- תיקון נוירונים תחת בקרה חזותית באמצעות מגבר מתאים מהדק תיקון. נכון לעמידות בסדרה, קיבוליות. ופוטנציאל הצומת הנוזלי
- במהלך הקלטות התאים השלם, הפעל כרונו על ידי אספקת פולסים קצרים (1-5 ms) של 470 ננומטר אור או ChrimsonR על ידי הפולסים קצר של 580 ננומטר אור דרך נוריות זמין מסחרית. קבע את הסף של ההפעלה אופסין והשתמש בפרוטוקול גירוי מינימלי כדי לעורר פוטנציאל פוסט-סינפטית. באופן כללי, להשתמש במשך הגירוי הקצר ביותר כי מעורר PSP, ולהגדיר את הכוח האופטי ל 120% מכוח הסף הנדרש כדי להפיק PSPs.
- כדי לאשר כי השינויים המוקלט בפוטנציאל הממברנה הם אכן כניסות סינפטית לעצב המוח, האנטוניסטים סטנדרטיים לקולטנים מתוך הפרסינפטיות/מעכבות ניתן לשטוף במהלך הניסוי. כדי לחקור תרומות שונות קולטן ל PSP (למשל קולטני NMDA vs האמפא), האנטוניסטים קולטן מתאים ניתן לשטוף. עבור כל יריב הקולטן, תופעות התרופה צריך להפוך לאחר כשלון.
- השתמש ההשהיה, להתעצבן, ומהימנות של PSPs לאשר כי אור המופעל כניסות סינפטית מקורם ישירה, הפעלה אופטית של הסינפסות על העצב המוקלט, בניגוד להפעלת המתקשרים המביעים-סינפסות ביטוי בהתערבות עצב הסינפסות. על תא העצב המוקלט באופן כללי, השהיה נמוכה (< 2 אלפיות הראשונה), להתעצבן נמוך (< 1 ms סטיית תקן בהשהיה), ואמינות גבוהה (> 50%) מצביעים על חיבור סינפטית ישיר של המתקשר המבטא תא העצב הפרסינפטית לעצב הבית המוקלט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
חצינו את העכברים VIP-IRES-היצורים (viptm1 (היצורים) Zjh/J) ו Ai14-העיתונאי עכברים (B6. Cg-Gt (רוזה) 26SorTM14 (קאג-tdTomato) hze/j) כדי ליצור צאצאים F1 שבו הנוירונים VIP לבטא את החלבון פלורסנט tdtomato. הצאצאים F1 של שני המין שימשו, בגילאי יום הלידה (P) 21 אל P70. בסך הכל 22 בעלי חיים שימשו במחקר זה.
הזרקת סטריאוטקאית של AAV1. צין. כרונו-GFP. WPRE. bGH לתוך הימנית השמאלית של VIP-IRES-יצורים x Ai14 עכברים באמצעות קואורדינטות המוצגות בטבלה 1 הביאו לביטוי חזק כרונו-EGFP ב IC הימני (איור 2א). בדיקה חזותית של הזריחה כרונו-EGFP הראו כי רוב somata המסומן בימין IC היו ממוקמים בגרעין המרכזי של IC (ICc), אך התווית somata היו לפעמים גם בקליפת המוח של IC (ICd) ולעיתים בקליפת המוח הרוחבי של IC (Icd). יש לבדוק את המיקוד והיקף ההעברה של כל בעל חיים המשמש בניסוי, כביטוי למתקשרים באזורים שאינם ממוקדים, עלול להוביל לתוצאות חיוביות שגויות. כדי להשיג ביטוי רחב יותר או מוגבל יותר של כרונו, את כמות הווירוס הופקד, כמו גם את הקואורדינטות סטריאוטקאית ניתן לכוונן בקלות כדי להשיג את התוצאה הרצויה.
הזרקת סטריאוטקאית של AAV1. צין. כרונו-GFP. WPRE לתוך DCN (ראה קואורדינטות בטבלה 1) של ה-VIP-IRES-Ai14 x עכברים הביא לזיהום חזק של הנוירונים dcn (איור 2ב). כדי לאשר העברה סלקטיבית של DCN, גזע המוח של כל בעל חיים צריך להיות פרוס כדי לוודא כי ביטוי EGFP היה נוכח ומוגבל DCN. אם אין העברה או אם יש ביטוי ניכר של EGFP בעצב השמיעה או VCN, הקלטות לא צריך להתבצע. באמצעות נקודות הציון המוצגות בטבלה 1 עם נפח הזרקה כולל של 40 nL, ביטוי כרונו-egfp יוגבל ל-dcn ברוב המקרים. אקסונים בעלי תוויות התווית היו נוכח שמאל (שולי צלעות) ICc 3 שבועות לאחר ההזרקה עבור אתרי הזרקה IC ו dcn (איור 2ימין, 2b ימין).
כדי לבדוק את הסחר. בטווח הארוך של כריסטאר, AAV1 . לא, לא, לא... WPRE. bGH הוזרק לתוך DCN הימני של VIP-IRES-Ai14 x עכברים, באמצעות נקודות ציון כמו עם זריקות כרונו. הזרקת ChrimsonR הובילה ביטוי חזק ב-DCN, עם זריחה tdTomato לעין בתאים וסיבים (איור 3א). ב ICc הצלעות, סיבים מסומן בחוזקה עם tdTomato נראו בבירור לאחר 3 שבועות, הוכחת את יכולת הסחר ארוכת טווח של כריסטמאר-Tdsonr לבנות כאשר מוזרק לתוך המוח שמיעתי גרעיני גזע (איור 3B). הפעלה אופטית של chrimsonr מעורר epsps ב-IC VIP נוירונים (איור 3ג), המציין כי chrimsonr הוא כלי שימושי עבור ניסויים בטווח ארוך CRACM כאשר הפרמטרים הניסיוניים לדרוש את השימוש באור אדום במקום אור כחול. עם זאת, מצאנו כי ChrimsonR הופעל בקלות עם אור כחול, מראה את הסף זהה להפעלת אור כחול כמו כרונו (איור 4). הרגישות של ChrimsonR לאור כחול פירושה כי טיפול מיוחד יש לנקוט כדי להבחין בין תשומות מזוהמים עם ChrimsonR או כרונו באותה חיה13.
כאשר מיקוד הקלטות לנוירונים VIP בחדר המתאים (שמאל) ICc לאחר זריקות לתוך IC הימנית, אור כחול מהבהב מעורר הפוטנציאל הסינסינפטיות הסינפטית (EPSPs) או מעכבות הפוטנציאל הפוסט-סינפטית (IPSPs). זה מאשר התחזיות המזנון כדי נוירונים VIP. כדי לנתח את ה-EPSPs ואת IPSPs בנפרד, השתמשנו היריבים קולטן לחסום IPSPs במהלך הקלטות EPSPS, ולהיפך. מייצגים הנציג והאיsps שנרשמו במהלך ניסויים CRACM מוצגים באיור 5. ה-IPSPs נצפו 6 מתוך 12 נוירונים ICc VIP. IPSPs היו קטנים (1.53 mV ± 0.96 mV) ו היו קינטיקה מתונה. 10-90% שעות העלייה של IPSPs היו 7.8 ms ± 2.1 ms, חצי רוחב היו 15.1 ms ± 6.8 ms, וקבועים זמן ריקבון היו 32.4 ms ± 17.0 ms (איור 5A, שמאל). ה-IPSPsהיו בתיווך על ידי נגבה קולטנים, כפי שהם נחסמו על ידי 5 μm GABAZINE, נגבההיריב קולטן (איור 5A, נכון; n = 6). EPSPs נצפו 11 מתוך 27 נוירונים ICc VIP נבדק. EPSPs היו גם קטנים (1.52 mV ± 1.08 mV) ו היו קינטיקה מתונה. 10-90% שעות העלייה של EPSPs היו 8.3 ms ± 4.3 ms, חצי רוחב היו 19.6 ms ± 7.6 ms, וקבועים זמן ריקבון היו 43.5 ms ± 16.8 ms (איור 5B "בקרה"). . מNMDA יישום של 50 μM D-AP5, היריב קולטן NMDA, מופחת EPSP חצי רוחב (14.3 ms ± 4.7 ms, p = 0.006) ו trended לקראת הפחתת זמן העלייה (6.3 ms ± 1.6 ms, p = 0.09), ניוון זמן קבוע (30.6 ms ± 7.3 ms, p = 0.06), ו EPSP משרעת (1.38 ± 0.33 mV, p = 0.105; ANOVA עבור מדידות חוזרות עם מבחן Tukey לאחר-הוק). יישום של 10 μM NBQX, היריב הקולטן אמפא, חסם את שאר EPSP (איור 5B "+ AP5 & nbqx").
הקלטות של נוירונים VIP ב-ICc שמאל לאחר זריקות DCN חשף EPSPs מעורר על ידי הבזקי אור כחול, מאשרת תשומות סינפטיות מ-DCN כדי נוירונים VIP ב IC. ניסויים DCN CRACM נערכו עם חוסמי GABAergic וגליסירגיות באמבטיה כדי לחסום IPSPs ספונטנית. מצאנו כי 2-5 ms פולסים של אור כחול מעורר EPSPs ב 19 של 25 נוירונים נבדק. אור-מעורר בעלי מראה המוני הגברה (2.85 mV ± 2.98 mV) וזמני עלייה איטיים יחסית (4.2 ms ± 1.3 ms), חצאי רוחב (20.6 ms ± 14.4 ms) וקבועי זמן דעיכה (22.0 ms ± 6.7 ms) (n = 6 תאים, נתונים לא מוצגים).
כל PSPs שעורר על ידי כרונו או ChrimsonR ההפעלה היו הוכחו בצורה של כל או-ללא משנה לא בקנה מידה שלהם עם הגדלת כוח אופטי (נתונים לא מוצגים). עם זאת, תוצאה זו תלויה המספר והפיזיולוגיה של הסינפסות המשולב המספקים קלט לעצב מסוים, ולכן סביר להניח שהוא משתנה בהתאם לשילוב המסוים של ההקרנה סיבי וסוג תא העצב הנחקר.
איור 1: rAAV אתרי הזרקה ומלכודת ניסויית. (א) הזרקת אתר והתקנה ניסויית כדי לחקור תחזיות מערכת. משמאל: מבנה rAAV (למשל, rAAV1. Syn. כרונו-GFP. bGH) הוא מוזרק לתוך ההקלטות הימנית הנכונה וממוקדות מבוצעים בתוך הקונאלצלעות. מימין: במהלך ההקלטות של מהדק המדבקות, סיבים כרומיים-מזוהמים מתרגשים מאור כחול כדי לעורר פוטנציאל פוסט-סינפטיות. (ב) הזרקת אתר והתקנה ניסיונית כדי לחקור תחזיות לטווח ארוך מ-dcn ל-IC. משמאל: המבנה ChrimsonR מוזרק לתוך DCN הימנית והקלטות ממוקדות מתבצעות ב-IC הקונאלתית. מימין: במהלך הקלטות קלאמפ, הסיבים המזוהמים מתרגשים באור אדום כדי להקליט את הפוטנציאל הפוסט-טראומטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ביטוי כרונו-EGFP לאחר זריקות לתוך IC ו-DCN. (א) משמאל: תמונה של פרוסה הקורילית IC המציגה נוירונים VIP מתויג tdTomato ברחבי IC (מגנטה) ו כרונו-egfp ביטוי ב somata מקומי לאתרי הזרקה בזכות IC (ירוק). מימין: תמונת הגדלה גבוהה יותר המציגה את תא העצב המוקלט של VIP (לבן-ירוק) בתוך הצלעות הIC לאתר ההזרקה. דקדטה ירוק הם כרונו-EGFP ביטוי התחזיות מתוך IC צלעות. (ב) דמות של פרוסת המוח המונלית מראה ביטוי כרונו-egfp ב-dcn לאחר הזרקת raav כרונו-egfp. משמאל: תמונה של DCN, המציגה סיבי DCN ו-EGFP-חיוביים הנכנסים לתוך הניסטריה האקוסטית. אמצעית: תמונה בהגדלה גבוהה יותר המציגה את גופי התא של כרונו בתוך DCN. מימין: ביטוי כרונו-EGFP בסיבים ובמסופים ב-IC הנכנס מטווח ארוך DCN-IC תחזיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ChrimsonR-tdTomato ביטוי בתחזיות dcn ו dcn ל IC. (A) תמונה של פרוסת גזע המוח הקורילי מעכבר שבו dcn הימני הוזרק עם RAAV1. Syn. כריסטאר-טדליפ. ווראש. משמאל: תמונה של הביטוי ChrimsonR ב-DCN הימני. מימין: תמונת ההגדלה הגבוהה של DCN הימנית מראה העברה חזקה של נוירונים עם ChrimsonR. (ב) תמונה בעלת ההגדלה הגבוהה של כריסטוק-מזונים בהאקסונים ב-IC. (ג) אלקטרואופטיקה מעורר את ההקלטה מתוך תא העצב של VIP ב-IC הצלעות המוזרקים לכיוון Raav-ChrimsonR מוזרק dcn. העקבות המקוריים מוצגים בצבע אפור בהיר וממוצע EPSP הוא באדום. התיבה הכתומה מציינת את העיתוי של הדופק 590 ננומטר. קנה מידה של סרגלים = 20 ms/0.5 mV. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הפעלה של ChrimsonR על ידי רמות נמוכות של אור כחול. (א) הפעלת כרונו בתחזיות מערכת על ידי פולסים של 470 ננומטר אור כחול. למעלה: עקבות מקוריים (אפור בהיר) וממוצע (ציאן) של IPSPs מונחה כרונו, העלה בכוח אופטי מעט מעל הסף עבור הפעלה של כרונו (סרגלי קנה מידה מראה 20 ms/0.5 mV). בתחתית: היחסים בין כוח אופטי ב 470 ננומטר וההסתברות של התבוננות כרונו-העורר PSP. (ב) הפעלה של ChrimsonR עם אור כחול 470 ננומטר. למעלה: עקבות מקוריים (אפור בהיר) וממוצע (אדום) של מונחה כריסטומ-r, מעורר עם 470 ננומטר אור כחול באותו כוח אופטי בשימוש ב, בראש (סרגלי קנה מידהלהראות 20 ms/0.5 mV). בתחתית: הקשר בין כוח אופטי ב 470 ננומטר וההסתברות של התבוננות מונחה ChrimsonR PSP. שימו לב כי הסף להפעלת אור כחול של ChrimsonR PSPs היה זהה לסף עבור הבאת כרונו PSPs. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: אפיון האור מעורר PSPs מתוך הסינפסות המזנון על נוירונים VIP. ה-IC הימני הוזרק עם rAAV1. Syn. כרונו-GFP. bGH והקלטות נעשו מ-VIP נוירונים בתוך הארגון ICc. (A) אלקטרואופטיקה-מעורר הAP5 היו מעורר על ידי 2-5 ms הבזקי אור כחול (משמאל) בעוד epsps נחסמו על ידי 10 ΜM NBQX ו 50 Μm D-. הפרוטוקול בוטל על-ידי גאזין (מימין). (ב) אלקטרואופטיקה-מעורר ה2-5 היו מעורר על ידי הבזקי אור בצבע כחול (משמאל) בעוד ipsps נחסמו עם הסטריכנין 1 μm ו 5 μm gabazine. השטיפה של 50 μM D-AP5 הקטינה באופן משמעותי את חצי הרוחב ואת הזמן הדעיכה הקבועים של אור-מעורר (באמצע). כביסה של 10 μM NBQX ביטלה את הנותרים EPSP (מימין). הסימנים המקוריים ב-A ו- B מוצגים באפור בהיר, והממוצע של עד 50 מוצגים בשחור. . מגוייר ואח ', 2019 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| X (לרוחב) | Y (caudal) | Z (עומק) | |
| מימין חדירה IC 1 | 1,000 יקרומטר | -900 יקרומטר | 2250-1500 יקרומטר (250 יקרומטר בהפרשים קבועים) |
| החדירה הימנית IC 2 | 1,250 יקרומטר | -900 יקרומטר | 2250-1750 יקרומטר (250 יקרומטר בהפרשים קבועים) |
| מימין DCN | 2,155 יקרומטר | -1325 יקרומטר | 4,750 יקרומטר, 4,550 יקרומטר |
טבלה 1: נקודות ציון סטריאוטקאיות עבור זריקות rAAV ל IC ו-DCN. כל נקודות הציון הן יחסית ללאמבדה ב-μm. הקואורדינטות של Z נמדדות ממשטח הגולגולת של למדא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מצאנו כי CRACM היא טכניקה רבת עוצמה לזיהוי ואפיון תשומות סינפטית טווח ארוך לנוירונים בעכבר IC. בעקבות הפרוטוקול המפורט כאן, השגנו העברה חזקה של נוירונים ב-DCN ו-IC, כמו גם סחר האקאליות אמין של כרונו ו ChrimsonR למסופים סינפטית ב-IC. בנוסף, הדגמנו כי טכניקה זו מאפשרת מדידה וניתוח של אירועים פוסט סינפטיות, כולל משרעת PSP, חצי רוחב, ריקבון זמן, ו לקולטן לפרמקולוגיה. הניסיון שלנו מציע כי גישה זו יכולה להיות מותאם בקלות לבצע ניסויים פונקציונלי מיפוי מעגל במהלך המוח השמיעה ומעבר.
בסך הכל, הספציפיות של מיפוי מעגל אלקטרואופטיקה מספק יתרון ברור על ידי גירוי חשמלי של אקסונים. העברה נגיפית מספקת את היכולת לצמצם ולהגביל את הביטוי של המתקשרים אל אוכלוסיית מטרה של נוירונים פרסינפטיים. לעומת זאת, גירוי חשמלי אינו יכול להבדיל בין אקטונים המקורם בגרעין טרום-סינפטיות שונה כאשר האקטונים האלה מעורבבים, כמו המקרה ברוב אזורי המוח. גירוי חשמלי יכול גם ליזום שני קוצים אורתודרומית ואנטידרומית, עוד מסבך את העניינים כאשר אתר גירוי מרחוק מכיל אקסונים שמקורם נוירונים הממוקם ליד אתר ההקלטה.
כדי להבטיח ביטוי יציב וסחר האקסון טוב של המתקשר, בחירת וקטור וירוס הנכון מסוג הסרוטיפ הוא העליונה. מצאנו כי ביטוי יציב של כרונו ב-IC נוירונים הושגה עם סוג הסרופ 1 rAAV כולל כרונו או ChrimsonR מבנה בשילוב עם הפטיטיס הדלקת הכבד של הגוף (WPRE) והורמון גדילה של שור (BGH) . אות מפולאדלציה מסוג rAAV מעין 5 נכשל לייצר opsins פונקציונליים ב IC, אבל היה פונקציונלי DCN (הנתונים לא הראו). האימות הקפדני של קואורדינטות הזרקה לכל ניסוי ולהבטיח כי ביטוי אופסין מוגבל לאזור המוח המיועד הוא חשוב בדומה. זיהוי משמעותי של תשומות אפשרי רק אם ביטוי של אופסין נבדק בקפידה ומתועד בכל ניסוי.
המבנה rAAV1. ChrimsonR בשימוש בפרוטוקול הנ ל הניב ביטוי יציב וסחר האקאליות טובה של החלבון, אפילו בטווח ארוך התחזיות של DCN ל IC (איור 3). זה הופך את chrimsonr מתאים אופסין עבור (טווח ארוך) מיפוי מעגלים. אדום הזזה אופסין כמו chrimsonr יכול להיות שימושי אם הפרמטרים הניסיוניים דורשים חדירה קלה עמוק לתוך הרקמה, אבל ניסיוני צריך להיות מודע כי כל הזמינים כרגע אדום העביר אופסין להראות כמה הפעלה עם אור כחול. למרות שמחקרים מסוימים טענו כי chrimsonr ו כרונו ניתן להפעיל בנפרד6,14,16, הנתונים שלנו מראים כי הטיפול הגדול חייב להילקח עם גישה זו. דוח שנערך לאחרונה מפרט שיטות נוספות שיש להשתמש בהן אם בניסיון להפריד בין החטאים שהוזזו באדום לבין כרונו13. לכן, בעת שימוש chrimsonr ו כרונו בשני CRACM בצבע ניסויים, מתוכנן בקפידה ניסויים שליטה צריך להיות מבוצע כדי להבטיח הפרדה ברורה של כחול ואדום הזזה אופסין הפעלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו היתה נתמכת על ידי מלגת מחקר של הדויטשה הגרמני (GO 3060/1-1, פרויקט מספר 401540516, ל-DG) ומכונים לאומיים של מענק בריאות R56 DC016880 (MTR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH | Addgene | 59171-AAV1 | |
| AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Addgene | 59170-AAV1 | |
| Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson Laboratory | stock #007914 | |
| Amber (590nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-A8 | |
| Blue (470nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-B4 | |
| Carproject (carprofen) | Henry Schein Animal Health | 59149 | |
| Drummond glas capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | |
| Drummond Nanoject 3 | Drummond Scientific Company | 3-300-207 | |
| Electrode beveler | Sutter Instrument | FG-BV10-D | |
| Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures | Ethicon | local pharmacy | |
| Fixed stage microscope | any | n/a | |
| Gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 933-B | |
| General surgery tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Golden A5 pet clipper | Oster | 078005-010-003 | |
| Heating pad | Custom build | N/A | |
| Hooded induction chamber w/ vacuum system | Patterson Scientific | 78917760 | |
| Hot bead sterilizer Steri 250 | Inotech | IS-250 | |
| Iodine solution 10% | MedChoice | local pharmacy | |
| Isoflurane vaporizer | Patterson Scientific | 07-8703592 | |
| Lidocain topical jelly 2% | Akorn | local pharmacy | |
| Micro motor drill 1050 | Henry Schein Animal Health | 7094351 | |
| Micro motor drill bits 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285/R | |
| Ophthalmic ointment Artificial Tears | Akorn | local pharmacy | |
| P-1000 electrode puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Patch clamp amplifier incl data acquisition software | any | n/a | |
| Portable anethesia machine | Patterson Scientific | 07-8914724 | |
| Small animal steroetaxic frame | David Kopf Instruments | 930-B | |
| Standard chemicals | local vendors | N/A | |
| standard imaging solutions | |||
| Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
| Surgical marker | Fine Science Tools | 18000-30 | |
| Temperature controller | Custom build | N/A | |
| Vibratome | any | n/a | |
| VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) | Jackson Laboratory | stock #010908 | |
| Water bath | any | n/a |
References
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping. Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11, 338-346 (2014).
- Flotte, T. R. Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).
- Aponte-Ubillus, J. J., et al. Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production. Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).
- Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13, 325-328 (2016).
- Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation. Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).
- Mager, T., et al. High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics. Nature Communications. 9, (2018).
- Oda, K., et al. Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson. Nature Communications. 9, (2018).
- Hooks, B. M. Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations. Current Protocols in Neuroscience. 85, e52 (2018).
- Schild, L. C., Glauser, D. A. Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 1029-1034 (2015).
- Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience. Neuron. 96, 572-603 (2017).
- Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation. Nature Biomedical Engineering. 2, 485 (2018).
- Asrican, B., et al. Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Oliver, D. L. Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study. Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).
- Oliver, D. L. Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction. Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).
- Glendenning, K. K., Masterton, R. B. Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive. Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).
- Adams, J. C. Ascending projections to the inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).
- Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).
- Saldaña, E., Merchań, M. A. Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).
- Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Felix, R. A., Gourévitch, B., Portfors, C. V. Subcortical pathways: Towards a better understanding of auditory disorders. Hearing Research. 362, 48-60 (2018).
- Winer, J. A., Schreiner, C., et al. The inferior colliculus: with 168 illustrations. Winer, J. A., Schreiner, C. , Springer. New York, NY. (2005).
- Goyer, D., et al. A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice. eLife. 8, e43770 (2019).
