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Neuroscience

Mappatura del circuito a lungo raggio assistita da Channelrhodopsin dei neuroni Colliculus inferiori con Channelrhodopsins blu e rosso

Published: February 7, 2020 doi: 10.3791/60760
Automatic Translation
1, 1
1Kresge Hearing Research Institute, Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Michigan

Summary

La mappatura dei circuiti assistiti da channelrhodopsin (CRACM) è una tecnica di precisione per la mappatura funzionale delle proiezioni neuronali a lungo raggio tra gruppi di neuroni anatomicamente e/o geneticamente identificati. Qui, descriviamo come utilizzare CRACM per mappare le connessioni uditive del tronco, incluso l'uso di un opsin in rosso, ChrimsonR.

Abstract

Quando si studiano i circuiti neurali, una limitazione standard dell'approccio di morsetto patch in vitro è che gli assoni provenienti da più fonti sono spesso intermixed, rendendo difficile isolare gli input da singole fonti con stimolazione elettrica. Tuttavia, utilizzando channelrhodopsin assistited circuit mapping (CRACM), questa limitazione può ora essere superata. Qui, riportiamo un metodo per utilizzare CRACM per mappare gli input ascendenti da nuclei del tronco encefalico meno bassi uditivi e input commissurali a una classe identificata di neuroni nel collicolo inferiore (IC), il nucleo midbrain del sistema uditivo. Nell'IC, gli assoni locali, commissri, ascendenti e discendenti sono fortemente intrecciati e quindi indistinguibili dalla stimolazione elettrica. Iniettando un costrutto virale per guidare l'espressione di una channelrhodopsin in un nucleo presintatico, seguita dalla registrazione dei blocchi di patch per caratterizzare la presenza e la fisiologia degli ingressi sinaptici che esprimono channelrhodopsin, proiezioni da una fonte specifica a una popolazione specifica di neuroni IC possono essere mappati con precisione specifica del tipo di cellula. Dimostriamo che questo approccio funziona sia con Chronos, una channelrhodopsin ad attivazione della luce blu, sia con ChrimsonR, una channelrhodopsin con cambio rosso. In contrasto con i precedenti rapporti dal prosencefalo, troviamo che ChrimsonR è robustamente trafficato lungo gli assi dei neuroni principali del nucleo cocleare dorsale, indicando che ChrimsonR può essere uno strumento utile per gli esperimenti CRACM nel tronco encefalico. Il protocollo qui presentato include descrizioni dettagliate della chirurgia di iniezione di virus intracranico, incluse le coordinate stereotassiche per indirizzare le iniezioni al nucleo cocleare dorsale e all'IC dei topi, e come combinare la registrazione dei morsetti a tutta cella con attivazione della channelrhodopsin per studiare le proiezioni a lungo raggio ai neuroni IC. Anche se questo protocollo è adattato per caratterizzare gli input uditivi all'IC, può essere facilmente adattato per studiare altre proiezioni a lungo raggio nel tronco encefalico uditivo e oltre.

Introduction

Le connessioni sinaptiche sono fondamentali per la funzione del circuito neurale, ma la topologia precisa e la fisiologia delle sinapsi all'interno dei circuiti neurali sono spesso difficili da sondare sperimentalmente. Questo perché la stimolazione elettrica, lo strumento tradizionale dell'elettrofisiologia cellulare, attiva indiscriminatamente gli assoni vicino al sito di stimolazione, e nella maggior parte delle regioni cerebrali, gli assoni provenienti da fonti diverse (locali, ascendenti e/o discendenti) si intrecciano. Tuttavia, utilizzando channelrhodopsin assisted circuit mapping (CRACM)1,2, questa limitazione può ora essere superata3. La channelrhodopsin (ChR2) è un canale ionico selettivo di luce originariamente presente nell'alga verde Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 può essere attivato dalla luce blu di una lunghezza d'onda intorno a 450-490 nm, depolarizzando la cellula attraverso l'afflusso di cation. ChR2 è stato descritto ed espresso per la prima volta in Xenopus oocytes da Nagel e colleghi4. Poco dopo, Boyden e colleghi5 hanno espresso ChR2 nei neuroni mammiferi e hanno dimostrato che potrebbero utilizzare impulsi di luce per controllare in modo affidabile l'abbagliamento su una scala temporale di millisecondi, inducendo potenziali di azione 10 ms dopo l'attivazione di ChR2 con luce blu. I canali optogenetici con cinetica ancora più veloce sono stati trovati di recente (ad esempio, Chronos6).

L'approccio di base a un esperimento CRACM è quello di transfetare una popolazione di neuroni pressinaptici putativi con un virus ricombinante adeno-associato (rAAV) che trasporta le informazioni genetiche per una channelrhodopsin. La trasfezione dei neuroni con rAAV porta all'espressione della channelrhodopsin codificata. Tipicamente, la channelrhodopsin è etichettata con una proteina fluorescente come GFP (Green Fluorescent Protein) o tdTomato (una proteina fluorescente rossa), in modo che la trasfezione dei neuroni nella regione bersaglio possa essere facilmente confermata con l'imaging di fluorescenza. Poiché i RAAV sono non patogeni, hanno un basso potenziale infiammatorio e un'espressione genica di lunga durata7,8, sono diventati una tecnica standard per fornire channelrhodopsins ai neuroni. Se, dopo la trasfezione di una popolazione pressiratica putativa di neuroni, l'attivazione di una channelrhodopsin attraverso lampi di luce suscita potenziali post-sinaptici o correnti nei neuroni bersaglio, questa è la prova di una connessione assonale dal nucleo trascurato alla cellula registrata. Poiché gli assoni recisi negli esperimenti sulle fette cerebrali possono essere spinti a rilasciare il neurotrasmettitore attraverso l'attivazione della channelrhodopsin, i nuclei che si trovano al di fuori della fetta acuta ma inviano assoni nella regione post-sinaptica del cervello possono essere identificati con CRACM. La potenza di questa tecnica è che la connettività e la fisiologia degli input sinaptici a lungo raggio identificati possono essere studiate direttamente.

Oltre alle channelrhodopsins che sono eccitabili dalla luce blu, gli investigatori hanno recentemente identificato diverse channelrhodopsins rosso-shifted9,10, tra cui Chrimson e la sua più veloce analogico ChrimsonR, entrambi i quali sono eccitati con la luce rossa di 660 nm6. Opsins rosso-spostato sono di interesse perché la luce rossa penetra tessuto meglio della luce blu, e la luce rossa può avere una citotossicità inferiore rispetto alla luce blu10,11,12. Le channelrhodopsins spostate in rosso aprono anche la possibilità di esperimenti CRACM a doppio colore, dove la convergenza di assoni da nuclei diversi sullo stesso neurone può essere testata in un esperimento6,13,14. Tuttavia, gli attuali opsin rossi spesso presentano un'attivazione incrociata indesiderata con luce blu15,16,17, rendendo difficili due esperimenti di colore. Inoltre, alcuni rapporti hanno indicato che ChrimsonR subisce un traffico assonale limitato, il che può rendere difficile l'utilizzo di ChrimsonR per esperimenti CRACM16,17.

Quasi tutte le proiezioni ascendenti dai nuclei del tronco encefalico meno basso convergono nel collicolo inferiore (IC), il centro cerebrale del percorso uditivo centrale. Questo include proiezioni dal nucleo cocleare (CN)18,19, la maggior parte del complesso di oliva superiore (SOC)20, e i nuclei dorsali (DNLL) e ventrale (VNLL) del lemniscus laterale21. Inoltre, una grande proiezione discendente dalla corteccia uditiva termina nei neuroni IC18,19,20,21,22e IC stessi si napsi ampiamente all'interno dei lobi locali e contralaterali dell'IC23. L'intreccio di assoni provenienti da molte fonti ha reso difficile sondare circuiti IC utilizzando la stimolazione elettrica24. Di conseguenza, anche se i neuroni nell'IC eseguono calcoli importanti per la localizzazione del suono e l'identificazione del discorso e di altri suoni di comunicazione25,26, l'organizzazione dei circuiti neurali nell'IC è in gran parte sconosciuta. Recentemente abbiamo identificato i neuroni VIP come la prima classe di neuroni identificabili molecolarmente nell'IC27. I neuroni VIP sono neuroni stellati glutamatergici che proiettano su diversi obiettivi a lungo raggio, tra cui il talamo uditivo e il collicolo superiore. Ora siamo in grado di determinare le fonti e la funzione degli input locali e a lungo raggio ai neuroni VIP e di determinare come queste connessioni di circuito contribuiscono all'elaborazione del suono.

Il protocollo qui presentato è basato su misura per studiare gli input sinaptici ai neuroni VIP nell'IC dei topi, in particolare dall'IC contralaterale e dal DCN (Figura 1). Il protocollo può essere facilmente adattato a diverse fonti di input, un diverso tipo di neurone o una regione del cervello diversa del tutto. Dimostriamo anche che ChrimsonR è un'efficace channelrhodopsin con spostamento rosso per la mappatura dei circuiti a lungo raggio nel tronco encefalico uditivo. Tuttavia, dimostriamo che ChrimsonR è fortemente attivato dalla luce blu, anche a bassa intensità, e quindi, per combinare ChrimsonR con Chronos in esperimenti CRACM a due colori, è necessario utilizzare controlli accurati per prevenire l'attivazione incrociata di ChrimsonR.

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Protocol

Ottenere l'approvazione del Comitato istituzionale locale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) e attenersi alle linee guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Tutte le procedure di questo protocollo sono state approvate dall'Università del Michigan IACUC ed erano conformi alle linee guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. Preparazione Chirurgia

  1. Eseguire interventi chirurgici in condizioni asettiche. Autoclave/sterilizzare tutti gli strumenti di chirurgia e materiali prima della chirurgia. Indossare abito chirurgico e maschera per l'intervento chirurgico.
  2. Sanificare l'area di chirurgia (spruzzare e pulire con 70% etanolo), e posizionare tende sterili asciugamano per coprire l'area chirurgica.
  3. Preparare la gabbia di recupero. Rimuovere la biancheria da letto gabbia per limitare il rischio di asfissia. Mettere un pad di riscaldamento sotto la gabbia. Fornire una fonte di cibo e acqua.
  4. Tirare un capillare di vetro per il nanoiniere su un tiratore di pipette. Il calore intenso del filamento riscaldante durante il processo di trazione sterilizzerà il vetro capillare. Tagliare o rompere la punta per ottenere un'apertura di circa 5 m di diametro.
  5. Scava la punta capillare con un angolo di circa 30 gradi per migliorare la penetrazione dei tessuti e ridurre l'intasamento. Riempire il capillare con olio minerale e inserirlo in un iniettore di nanolitro.
  6. Ottenere un rAAV di codifica channelrhodopsin desiderato e diluire al titer desiderato utilizzando PBS sterile.
    NOTA: Abbiamo scoperto che il sierotipo 1 rAOV funziona bene per la trasfezione dei nuclei del tronco encefalico uditivo. In particolare, rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH (channelrhodopsin attivato dalla luce blu) e rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH (channelrhodopsin, in rosso), disponibili da repository accessibili pubblicamente e da nuclei vettoriali, producendo costantemente gli alti livelli di espressione e un buon traffico assonale a lungo raggio di channelrhodopsins necessari per gli esperimenti CRACM.
  7. Seguire le istruzioni per riempire in prima linea il riempimento capillare con 1-3 - L di rAAV in PBS sterile.

2. Chirurgia

  1. Mettere l'animale in una camera di induzione e indurre l'anestesia con 3% isoflurane in ossigeno consegnato tramite un vaporizzatore isoflurano calibrato. Osservare il mouse fino a quando la respirazione diventa profonda e lenta e un riflesso pizzico del dito è assente, circa 3-5 min.
  2. Trasferire l'animale su un telaio stereotassico. Fissare la testa dell'animale mettendo la bocca su una barra del palato con una maschera di anestesia a gas e posizionando le barre dell'orecchio non perforanti in entrambi i canale uditivi.
  3. Inserire una sonda di temperatura rettale e attivare il regolatore di temperatura omeostatico.
  4. Applicare unguento oftalmico per evitare che gli occhi si asciughino.
  5. Somministrare analgesico preventivo (ad esempio, iniezione sottocutanea di 5 mg/kg di carprofene).
  6. Regolare isoflurane a 1-2,5%, in base alla profondità dello stato anestesizzato. Monitorare la temperatura, la respirazione e il colore delle membrane mucose almeno ogni 15 minuti durante la procedura.
  7. Rasa cuoio capelluto con clipper elettrici. Preparare apposta il cuoio capelluto con tre tamponi alternati di povidone-iodio e 70% di etanolo.
  8. Fare un'incisione nel cuoio capelluto lungo la linea mediana a partire tra le orecchie e continuando rostrale agli occhi, esponendo le suture lambda e bregma. Spingere la pelle di lato e rimuovere il periosteo dall'osso esposto, se necessario.
  9. Contrassegnare la sutura lambda con un marcatore chirurgico sterile, posizionare la punta del nanoiniere in modo che tocchi solo l'espressione lambda e azzerare le coordinate del micromanipolatore. Utilizzare la punta del nanoiniere e il micromanipolatore per misurare la differenza di elevazione tra la lambda e le suture di bregma. Regolare l'altezza della barra del palato per portare lambda e bregma entro la differenza di altezza di 100 m.
  10. Mappare il sito di iniezione utilizzando la punta del nanoiniere e il sistema di coordinate del micromanipolatore e contrassegnare il sito con un marcatore chirurgico sterile. Per iniettare l'IC o il DCN dei mouse P21-P30, utilizzare le coordinate relative alla sutura lambda, come illustrato nella Tabella 1. Si noti che la profondità di z nelle nostre coordinate viene misurata dalla superficie del cranio in lambda.
  11. Utilizzare un trapano micromotore con una bava sterile da 0,5 mm per eseguire una craniotomia sul sito di iniezione.
  12. Per garantire un'ampia trasfezione dei neuroni nel nucleo bersaglio, fare iniezioni a varie profondità nel tessuto (Tabella 1, coordinate di z) e, nel caso di regioni cerebrali più grandi come l'IC, fare iniezioni nel corso di due o più penetrazioni in diverse coordinate X e Y (Tabella 1, Destra IC penetrazione 1 e Destra IC penetrazione 2).
  13. Eseguire iniezioni. Per le iniezioni di IC, depositare 20 nL di virus in intervalli di 250 m lungo l'asse (profondità di iniezione) compreso tra 2.250 e 1750 m di profondità. Per le iniezioni di DCN, depositare 20 nL di virus ad una profondità di 4.750 e 4.550 m, rispettivamente.
  14. Dopo l'iniezione ad ogni coordinata z, attendere 2-3 min prima di spostare l'iniettore alla coordinata successiva. Ciò consentirà al virus di diffondersi lontano dal sito di iniezione, riducendo la probabilità che il virus venga aspirato al tratto di iniezione quando il nanoiniere viene riposizionato.
  15. Dopo l'ultima iniezione in una penetrazione, attendere 3-5 min prima di ritrarre nanoiniere dal cervello.
  16. Quando il nanoiniere viene rimosso dal cervello tra penetrazioni e tra animali, espellere un piccolo volume di virus dalla punta per verificare che la punta non sia intasata.
  17. Dopo le iniezioni, utilizzare PBS sterile per umidare i bordi tagliati del cuoio capelluto e quindi spostare delicatamente la pelle indietro verso la linea mediana. Chiudere la ferita con semplici suture interrotte utilizzando suture di nylon 6-0 (0,7 metriche).
  18. Applicare 0,5-1 mL di gel lidocaina 2% alla ferita.
  19. Rimuovere le barre dell'orecchio e la sonda di temperatura, spegnere l'isoflurane, rimuovere il mouse dalla barra del palato e trasferirlo nella gabbia di recupero.
  20. Monitorare attentamente il ripristino. Una volta che l'animale è completamente sveglio, si muove, e non mostrando segni di dolore o angoscia, trasferirlo di nuovo nella sua gabbia e restituire la gabbia al vivarium.
  21. Se gli interventi chirurgici saranno eseguiti su più animali in un giorno, utilizzare uno sterilizzatore di perline caldo per sanificare gli strumenti di chirurgia e trapano burr prima del prossimo intervento chirurgico.

3. Follow-up chirurgico

  1. Controlla quotidianamente gli animali per la chiusura delle ferite, l'infezione o i segni di dolore o angoscia nei prossimi 10 giorni, aderendo alle linee guida per la cura degli animali dell'istituzione.
  2. Attendere 3-4 settimane prima di utilizzare gli animali negli esperimenti per consentire l'espressione ottimale delle channelrhodopsins.

4. Preparazione della fetta cerebrale e conferma dell'obiettivo di iniezione

  1. Per CRACM, utilizzare fette cerebrali preparate acutamente da animali trafitti in esperimenti di elettrofisiologia in vitro standard, descritti qui solo brevemente (vedi Goyer et al. 2019 per una descrizione più dettagliata27).
  2. Preparare il liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) contenente (in mM): 125 NaCl, 12.5 D-glucose, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1.5 CaCl2, 1 MgSO4. Bolla ACSF a un pH di 7,4 con 5% CO2 nel 95% O2.
  3. Eseguire tutti i passaggi seguenti, compresa l'elettrofisiologia in vitro, in prossimità dell'oscurità o nella luce rossa per limitare l'attivazione delle channelrhodopsins.
  4. Anatema profondamente il topo con l'isoflurane e decapitarlo rapidamente. Dissezionare il cervello rapidamente in ACSF 34 dollari centigradi.
  5. Tagliare le fette coronali (200-250 m) contenenti l'IC in ACSF da 34 gradi con un microtoma vibrante e incubare le fette a 34 gradi centigradi per 30 min in una camera di contenimento riempita con ACSF bollata con 5% CO2 nel 95% O2. Dopo l'incubazione, conservare le fette a temperatura ambiente fino a quando non vengono utilizzate per le registrazioni.
  6. Se l'obiettivo di iniezione non era l'IC, tagliare ulteriori fette coronali della regione del cervello iniettata e controllare la trasfezione del nucleo bersaglio al microscopio a fluorescenza. Se non c'è trasfezione nel nucleo bersaglio o trasfezione aggiuntiva in diverse regioni del cervello, non continuare con l'esperimento.

5. Registrazione in vitro ed esperimento CRACM

NOTA: Per fornire la stimolazione ottica di Chronos e ChrimsonR, utilizziamo i LED accoppiati al porto di epiorescenza del microscopio. Tuttavia, i laser possono essere utilizzati al posto dei LED. Se si utilizzano laser, ottenere l'approvazione preventiva da funzionari della sicurezza istituzionale e seguire le linee guida appropriate per l'uso sicuro del laser.

  1. Tirare gli elettrodi dal vetro borosilicate a una resistenza di 3,5-4,5 M. La soluzione interna dell'elettrodo deve contenere (in mM): 115 K-gluconato, 7.73 KCl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 10 Na2 fosforocreatine, 4 MgATP, 0,3 NaGTP, integrati con 0,1% biocytin (w/v), pH regolato a 7,3 con KOH e osmolalità a 290 mOsm/kg con saccarosio.
  2. Per effettuare registrazioni, utilizzare i metodi standard di blocco patch. Posizionare la fetta in una camera di registrazione al microscopio verticale a stadio fisso e perfuso continuamente con ACSF a 2 mL/min. Condurre registrazioni in prossimità di temperatura fisiologica ( 34-36 gradi centigradi).
  3. I neuroni patch sotto controllo visivo utilizzando un amplificatore di morsetto adatto. Corretto per la resistenza alla serie, la capacità pipetta e il potenziale di giunzione liquida.
  4. Durante le registrazioni di intere cellule, attivare Chronos fornendo brevi impulsi (1-5 ms) di 470 nm luce o ChrimsonR da brevi impulsi di 580 nm luce attraverso LED disponibili in commercio. Determinare la soglia di attivazione dell'opsina e utilizzare un protocollo di stimolazione minimo per suscitare potenziali post-sinaptici. In generale, utilizzare la durata dello stimolo più breve che suscita un PsSP e impostare la potenza ottica al 120% della potenza soglia necessaria per suscitare PSP.
  5. Per confermare che i cambiamenti registrati nel potenziale della membrana sono infatti input sinaptici al neurone, gli antagonisti standard per i recettori post-naptici eccitatori/inibitori possono essere lavati durante l'esperimento. Per studiare diversi contributi del recettore a un PSP (ad esempio recettori NMDA vs AMPA), gli antagonisti recettori adatti possono essere lavati. Per ogni antagonista recettore, effetti farmacologici dovrebbero invertire dopo il washout.
  6. Utilizzare la latenza, il jitter e l'affidabilità dei PSP per verificare che gli input sinaptici attivati dalla luce provengano dall'attivazione diretta e ottica delle sinapsi sul neurone registrato, in contrapposizione all'attivazione di sinapsi che esprimono la channelrhodopsin su un'operazione che interviene neurone che si sinapsi sul neurone registrato. In generale, bassa latenza (<2 ms), basso jitter (<1 ms deviazione standard nella latenza) e alta affidabilità (>50%) indicano una connessione sinaptica diretta dalla channelrhodopsin che esprime il neurone pressinaptico al neurone registrato.

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Representative Results

Abbiamo attraversato topi VIP-IRES-Cre(Viptm1 (cre) -Jh/J) e topi Cre-reporter Ai14 (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) per generare la prole F1 in cui i neuroni VIP esprimono la proteina fluorescente tdTomato. È stata usata la prole F1 di entrambi i sessi, il giorno postnatale (P) da 21 a P70. In questo studio sono stati utilizzati in totale 22 animali.

Iniezione stereotassica di AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH nell'IC destro dei topi VIP-IRES-Cre x Ai14 utilizzando le coordinate mostrate nella Tabella 1 ha generato una forte espressione Chronos-EGFP nell'IC di destra (Figura 2A). L'ispezione visiva della fluorescenza Chronos-EGFP ha indicato che la maggior parte delle somata etichettate nell'IC destro si trovavano nel nucleo centrale dell'IC (ICc), ma le somata etichettate erano talvolta presenti anche nella corteccia dorsale dell'IC (ICd) e occasionalmente nella corteccia laterale dell'IC (Cortelc laterale). Il targeting e l'entità della trasfezione dovrebbero essere controllati per ogni animale utilizzato in un esperimento, poiché l'espressione delle channelrhodopsins in regioni non mirate può portare a falsi positivi. Per ottenere un'espressione più ampia o più limitata di Chronos, la quantità di virus depositato e le coordinate stereotassiche possono essere facilmente regolate per ottenere il risultato desiderato.

Iniezione stereotassica di AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH nel DCN (vedere le coordinate nella tabella 1) dei topi VIP-IRES-Cre x Ai14 ha provocato una forte trasfezione dei neuroni DCN (Figura 2B). Per confermare la trasfezione selettiva della DCN, il tronco encefalico di ogni animale dovrebbe essere tagliato per verificare che l'espressione EGFP fosse presente e limitata alla DCN. Se non c'è trasfezione o se c'è una notevole espressione di EGFP nel nervo uditivo o VCN, le registrazioni non devono essere eseguite. Utilizzando le coordinate mostrate nella Tabella 1 con un volume di iniezione totale di 40 nL, l'espressione Chronos-EGFP sarà limitata al DCN nella maggior parte dei casi. Gli assoni etichettati EGFP erano presenti nella sinistra (contralaterale) ICc 3 settimane dopo l'iniezione per i siti di iniezione IC e DCN(Figura 2A destra, 2B destra).

Per testare il traffico a lungo raggio di ChrimsonR, AAV1. Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH è stato iniettato nel DCN destro dei topi VIP-IRES-Cre x Ai14, utilizzando le stesse coordinate delle iniezioni di Chronos. L'iniezione di ChrimsonR ha portato a una forte espressione nella DCN, con la fluorescenza tdTomato visibile nelle cellule e nelle fibre (Figura 3A). Nell'ICc contralaterale, le fibre fortemente etichettate con tdTomato erano chiaramente visibili dopo 3 settimane, dimostrando la capacità di traffico a lungo raggio del costrutto ChrimsonR-tdTomato quando iniettate in nuclei uditivi del troncocerebrale( Figura 3B). L'attivazione ottica degli EPSP suscitati da ChrimsonR nei neuroni VIP IC (Figura 3C), indica che ChrimsonR è uno strumento utile per gli esperimenti CRACM a lungo raggio quando i parametri sperimentali richiedono l'uso della luce rossa invece della luce blu. Tuttavia, abbiamo scoperto che ChrimsonR è stato prontamente attivato con luce blu, mostrando la stessa soglia per l'attivazione della luce blu come Chronos (Figura 4). La sensibilità di ChrimsonR alla luce blu significa che occorre prestare particolare attenzione a distinguere tra input trafettati con ChrimsonR o Chronos nello stesso animale13.

Quando si indirizzano le registrazioni ai neuroni VIP nell'ICc contralaterale (a sinistra) dopo le iniezioni nell'IC destro, i flash a luce blu hanno suscitato potenziali post-naptici eccitativi (EPSP) o potenziali post-naptici inibitori (IPSP). Questo conferma le proiezioni commissreive ai neuroni VIP. Per analizzare separatamente ePP e EP pL commissrici, abbiamo usato gli antagonisti recettori al sistema per bloccare gli IPSP durante le registrazioni EPSP e viceversa. Gli EPSP e gli IPSP rappresentativi registrati durante gli esperimenti CRACM sono illustrati nella figura 5. Gli IPSP sono stati osservati in 6 dei 12 neuroni VIP ICc testati. Gli IPSP erano piccoli (1,53 mV - 0,96 mV) e avevano una cinetica moderata. I tempi di aumento del 10 - 90% degli IPSP erano 7,8 ms e 2,1 ms, le mezze larghezze erano 15,1 ms e 6,8 ms, e le costanti del tempo di decadimento erano 32,4 ms e 17,0 ms (Figura 5A, a sinistra). Gli IPSP sono stati mediati dai recettori GABAA, in quanto sono stati bloccati da 5 gabazine, un antagonista del recettore GABAA (Figura 5A, destra; n - 6). Gli EPSP sono stati osservati in 11 dei 27 neuroni VIP ICc testati. Anche gli EPP erano piccoli (1,52 mV e 1,08 mV) e avevano una cinetica moderata. I tempi di aumento del 10 - 90% degli EPSP sono stati 8,3 ms - 4,3 ms, le mezze larghezze erano 19,6 ms - 7,6 ms, e le costanti del tempo di decadimento erano 43,5 ms - 16,8 ms (Figura 5B "Controllo"). Gli EPSP sono stati mediati dai recettori AMPA e NMDA. L'applicazione di 50-M D-AP5, un antagonista del recettore NMDA, la metà larghezza ridotta dell'EPSP (14,3 ms , 4,7 ms, p - 0,006) e la tendenza verso la riduzione del tempo di salita (6,3 ms e 1,6 ms, p - 0,09), costante del tempo di decadimento (30,6 ms , 7,3 ms , p - 0,06) e ampiezza EPSP (1,388 - 0,33 mV, p - 0,15; ANOVA per misurazioni ripetute con test post-hoc Tukey). L'applicazione di 10 NBQX, un antagonista del recettore AMPA, ha bloccato il resto dell'EPSP(Figura 5B " AP5 & NBQX").

Le registrazioni di neuroni VIP nell'ICc sinistro dopo che le iniezioni di DCN hanno rivelato EPP evocati da lampi di luce blu, confermando gli input sinaptici dalla DCN ai neuroni VIP nell'IC. Esperimenti DCN CRACM sono stati condotti con GABAergic e bloccanti glicinerogici nella vasca da bagno per bloccare IPSP spontanei. Abbiamo scoperto che 2-5 ms impulsi di luce blu suscitato EPP in 19 di 25 neuroni testati. Gli EPSP ricavati dalla luce avevano ampiezze moderate (2,85 mV e 2,98 mV) e tempi di salita relativamente lenti (4,2 ms e 1,3 ms), mezze larghezze (20,6 ms - 14,4 ms) e costanti del tempo di decadimento (22,0 ms e 6,7 ms) (n - 6 celle, dati non mostrati).

Tutti i PSP evocati dall'attivazione di Chronos o ChrimsonR sono stati attivati in modo tutto o nessuno e non hanno scalato la loro ampiezza con l'aumento della potenza ottica (dati non mostrati). Tuttavia, questo risultato dipende dal numero e dalla fisiologia delle sinapsi trafette che forniscono input a un particolare neurone ed è quindi probabile che varino a seconda della particolare combinazione di proiezione assonale e tipo di neurone in fase di studio.

Figure 1
Figura 1: siti di iniezione rAAV e configurazione sperimentale. (A) Sito di iniezione e configurazione sperimentale per indagare sulle proiezioni commissriche. Sinistra: un costrutto rAAV (ad esempio, rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH) viene iniettato nell'IC destro e le registrazioni mirate vengono eseguite nell'IC contralaterale. A destra: durante le registrazioni dei morsetti, le fibre trasfette di Chronos sono eccitate con la luce blu per suscitare potenziali post-sinaptici. (B) Sito di iniezione e configurazione sperimentale per studiare proiezioni a lungo raggio dalla DCN all'IC. Sinistra: Il costrutto ChrimsonR viene iniettato nel DCN destro e le registrazioni mirate vengono eseguite nell'IC contralaterale. A destra: durante le registrazioni dei morsetti, le fibre trascate da ChrimsonR sono eccitate con la luce rossa per registrare i potenziali post-sinaptici evocati da ChrimsonR. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: espressione Chronos-EGFP dopo le iniezioni in IC e DCN. (A) Sinistra: Immagine della fetta coronale IC che mostra i neuroni VIP etichettati tdTomato in tutto l'IC (magenta) e l'espressione Chronos-EGFP in somata localizzata nei siti di iniezione nell'IC destro (verde). A destra: Immagine di ingrandimento superiore che mostra un neurone VIP registrato (bianco-verde) nel contralaterale IC al sito di iniezione. I puncta verdi sono Chronos-EGFP che esprimono proiezioni dell'IC contralaterale. (B) Immagine della fetta del tronco encefalico coronale che mostra l'espressione Chronos-EGFP nel DCN dopo l'iniezione di rAAV-Chronos-EGFP. Sinistra: Immagine del DCN, che mostra le fibre Transfected DCN ed EGFP-positive che entrano nella stria acustica dorsale. Al centro: immagine di ingrandimento più alta che mostra i corpi cellulari trascanditi da Chronos nel DCN. A destra: Chronos-EGFP espressione in fibre e terminali nell'IC contralaterale da proiezioni DCN-IC a lungo raggio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: espressione ChrimsonR-tdTomato nelle proiezioni DCN e DCN all'IC. (A) Immagine di una fetta coronale del tronco encefalico di un topo in cui il DCN destro è stato iniettato con rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH. Sinistra: immagine dell'espressione ChrimsonR nel DCN di destra. A destra: Immagine di ingrandimento superiore del DCN destro che mostra una forte trasfezione dei neuroni con ChrimsonR. (B) Immagine ad alto ingrandimento degli assoni DCN trasfettati da ChrimsonR nell'IC. (C) Gli EPSP evocati optogeneticamente registrati da un neurone VIP nel contralaterale IC al rAAV-ChrimsonR iniettavano DCN. Le tracce originali sono mostrate in grigio chiaro e l'EPSP medio è in rosso. La casella arancione indica la temporizzazione di 590 nm di impulsi luminosi. Barre della scala: 20 ms/0,5 mV. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Attivazione di ChrimsonR da bassi livelli di luce blu. (A) Attivazione di Chronos nelle proiezioni commissriche mediante impulsi di 470 nm di luce blu. In alto: tracce originali (grigio chiaro) e media (ciano) di IPSP guidati da Chronos, evocate a una potenza ottica leggermente al di sopra della soglia per l'attivazione di Chronos (le barre di scala mostrano 20 ms/0,5 mV). In basso: Relazione tra potenza ottica a 470 nm e probabilità di osservare un PSP evocato da Chronos. (B) Attivazione di ChrimsonR con 470 nm di luce blu. In alto: tracce originali (grigio chiaro) e media (rosso) di EPSP guidati da ChrimsonR, evocate con 470 nm di luce blu alla stessa potenza ottica utilizzata in A, superiore (barre di scala mostrano 20 ms /0,5 mV). In basso: relazione tra potenza ottica a 470 nm e probabilità di osservare un PSP guidato da ChrimsonR. Si noti che la soglia per l'attivazione della luce blu dei PsP ChrimsonR era identica alla soglia per l'attivazione dei PSP Chronos.

Figure 5
Figura 5: Caratterizzazione dei PSP evocati dalla luce dalle sinapsi commissrisine ai neuroni VIP. L'IC destro è stato iniettato con rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH e le registrazioni sono state fatte da neuroni VIP nell'ICc contralaterale. (A) Gli IPSP evocati da IPSP otteniti da flash di luce blu da 2 a 5 ms (a sinistra) mentre gli EPP erano bloccati da 10 NBQX e 50 M D-AP5. Gli IPSP sono stati aboliti dalla gabazina (a destra). (B) Gli EPP evocati dall'optogeneticasono sono stati evocati da lampi di luce blu da 2 a 5 ms (a sinistra) mentre gli IPSP sono stati bloccati con 1 stricnina m e 5 gabazine. Il lavaggio di 50-M D-AP5 ha ridotto significativamente la costante di tempo di decadimento e mezza larghezza degli EPSP riprodotti dalla luce (al centro). Il lavaggio di 10 NBQX ha abolito l'EPSP rimanente (a destra). Le tracce originali in A e B sono mostrate in grigio chiaro e le medie da un massimo di 50 tracce individuali sono mostrate in nero. Da Goyer et al., 2019. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

X (laterale) Y (caudal) (profondità)
Penetrazione IC destra 1 1.000 m -900 m 2.250-1500 m
(incrementi di 250 m)
Penetrazione IC destra 2 1.250 m -900 m 2.250-1750 m
(incrementi di 250 m)
DCN destro 2.155 m -1325 m 4.750 m, 4.550 m

Tabella 1: Coordinate stereotassiche per le iniezioni di rAAV in IC e DCN. Tutte le coordinate sono relative all'espressione lambda in coordinate s. sono misurate dalla superficie dorsale del cranio in lambda.

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Discussion

Abbiamo scoperto che CRACM è una tecnica potente per identificare e caratterizzare gli input sinaptici a lungo raggio ai neuroni nel mouse IC. Seguendo il protocollo qui descritto, abbiamo ottenuto una robusta trasfezione dei neuroni nella DCN e nell'IC, nonché un affidabile traffico assonale di Chronos e ChrimsonR nei terminali sinaptici nell'IC. Inoltre, abbiamo dimostrato che questa tecnica consente la misurazione e l'analisi di eventi post-sinaptici, tra cui ampiezza PSP, mezza larghezza, tempo di decadimento e farmacologia dei recettori. La nostra esperienza suggerisce che questo approccio può essere facilmente adattato per eseguire esperimenti di mappatura funzionale del circuito in tutto il tronco encefalico uditivo e oltre.

Nel complesso, la specificità della mappatura del circuito optogenetico fornisce un netto vantaggio rispetto alla stimolazione elettrica degli assoni. Le trafetti virali forniscono la capacità di limitare spazialmente e molecolarmente l'espressione delle channelrhodopsins a una popolazione mirata di neuroni pressinaptici. Al contrario, la stimolazione elettrica non può distinguere tra assoni provenienti da diversi nuclei presintanti quando tali assoni sono mescolati, come nel caso della maggior parte delle regioni del cervello. La stimolazione elettrica può anche avviare picchi ortodromici e antidromici, complicando ulteriormente le cose quando un sito di stimolazione distale contiene assoni provenienti da neuroni situati vicino al sito di registrazione.

Per garantire un'espressione stabile e un buon traffico assonale di una channelrhodopsin, la scelta del vettore virale e del sierotipo giusti è fondamentale. Abbiamo scoperto che l'espressione stabile di Chronos nei neuroni IC è stata raggiunta con un sierotipo 1 rAAV tra cui un costrutto Chronos o ChrimsonR combinato con un elemento regolatore posttranscrivionali di legnochuck (WPRE) e ormone della crescita bovina (BGH) segnale di poliadenilazione. Il sierotipo 5 non è riuscito a produrre operazioni funzionali nell'IC, ma è stato funzionale nel DCN (dati non mostrati). La convalida rigorosa delle coordinate di iniezione per ogni esperimento e la garanzia che l'espressione dell'opsina sia limitata alla regione cerebrale mirata è altrettanto importante. Un'identificazione significativa degli input è possibile solo se l'espressione dell'opsin è attentamente controllata e documentata per ogni esperimento.

Il costrutto rAAV1.ChrimsonR utilizzato nel protocollo di cui sopra produceva un'espressione stabile e un buon traffico assonale della proteina, anche nelle proiezioni a lungo raggio dalla DCN all'IC (Figura 3). Questo rende ChrimsonR un'operazione adatta per la mappatura del circuito a lungo raggio. Un opsina rimando come ChrimsonR può essere utile se i parametri sperimentali richiedono una penetrazione della luce in profondità nel tessuto, ma lo sperimentatore deve essere consapevole del fatto che tutte le opsine spostate in rosso attualmente disponibili mostrano alcune attivazioni incrociate con luce blu. Anche se alcuni studi hanno sostenuto che ChrimsonR e Chronos possono essere attivati separatamente6,14,16, i nostri dati suggeriscono che grande attenzione deve essere presa con questo approccio. Una relazione recente descrive in dettaglio i metodi aggiuntivi che devono essere utilizzati se si tenta di separare le operazioni con spostamento rosso da Chronos13. Pertanto, quando si utilizza ChrimsonR e Chronos in due esperimenti CRACM a colori, è necessario eseguire esperimenti di controllo attentamente progettati per garantire una netta separazione dell'attivazione delle operazioni di opsinblu e rosse.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da una Deutsche Forschungsgemeinschaft Research Fellowship (GO 3060/1-1, progetto numero 401540516, alla DG) e national Institutes of Health grant R56 DC016880 (MTR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH Addgene 59171-AAV1
AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH Addgene 59170-AAV1
Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) Jackson Laboratory stock #007914
Amber (590nm) LUXEON Rebel LED Luxeon Star LEDs SP-01-A8
Blue (470nm) LUXEON Rebel LED Luxeon Star LEDs SP-01-B4
Carproject (carprofen) Henry Schein Animal Health 59149
Drummond glas capillaries Drummond Scientific Company 3-000-203-G/X
Drummond Nanoject 3 Drummond Scientific Company 3-300-207
Electrode beveler Sutter Instrument FG-BV10-D
Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures Ethicon local pharmacy
Fixed stage microscope any n/a
Gas anesthesia head holder David Kopf Instruments 933-B
General surgery tools Fine Science Tools N/A
Golden A5 pet clipper Oster 078005-010-003
Heating pad Custom build N/A
Hooded induction chamber w/ vacuum system Patterson Scientific 78917760
Hot bead sterilizer Steri 250 Inotech IS-250
Iodine solution 10% MedChoice local pharmacy
Isoflurane vaporizer Patterson Scientific 07-8703592
Lidocain topical jelly 2% Akorn local pharmacy
Micro motor drill 1050 Henry Schein Animal Health 7094351
Micro motor drill bits 0.5 mm Fine Science Tools 19007-05
Motorized Micromanipulator Sutter Instrument MP-285/R
Ophthalmic ointment Artificial Tears Akorn local pharmacy
P-1000 electrode puller Sutter Instrument P-1000
Patch clamp amplifier incl data acquisition software any n/a
Portable anethesia machine Patterson Scientific 07-8914724
Small animal steroetaxic frame David Kopf Instruments 930-B
Standard chemicals local vendors N/A
standard imaging solutions
Sterile towel drapes Dynarex 4410
Surgical marker Fine Science Tools 18000-30
Temperature controller Custom build N/A
Vibratome any n/a
VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) Jackson Laboratory stock #010908
Water bath any n/a

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References

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Neuroscienze Numero 156 mappatura dei circuiti assistiti da Channelrhodopsin optogenetica Chronos ChrimsonR collicolo inferiore tronco encefalico uditivo
Mappatura del circuito a lungo raggio assistita da Channelrhodopsin dei neuroni Colliculus inferiori con Channelrhodopsins blu e rosso
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Goyer, D., Roberts, M. T. Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins. J. Vis. Exp. (156), e60760, doi:10.3791/60760 (2020).

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