Vækst af menneskelige og får Hornhinde endotelcellelag på biomaterialemembraner

Summary

Denne protokol beskriver de kritiske skridt, der kræves for at etablere og dyrke hornhinde endotelcellekulturer fra explants af humant eller fårevæv. Der præsenteres også en metode til subkulering af hornhindeeniceller på membranøse biomaterialer.

Abstract

Hornhinde endotelcellekulturer har en tendens til at gennemgå epitel-til-mesenkymale overgang (EMT) efter tab af celle-til-celle kontakt. EMT er skadeligt for cellerne, da det reducerer deres evne til at danne et modent og funktionelt lag. Her præsenterer vi en metode til etablering og subkulering af menneskelige og får ehornhinde endotelcellekulturer, der minimerer tabet af celle-til-celle kontakt. Explants af hornhinde endotel / Descemet membran er taget fra donor hornhinder og placeres i vævkultur under forhold, der gør det muligt for cellerne til kollektivt at migrere på kulturens overflade. Når en kultur er etableret, overføres explanterne til friske plader for at indlede nye kulturer. Dispase II bruges til forsigtigt at løfte klumper af celler fra vævskulturplader til undervænning. Hornhinde endotelcellekulturer, der er etableret ved hjælp af denne protokol er egnet til overførsel til biomateriale membraner til at producere væv-manipuleret celle lag til transplantation i dyreforsøg. En skræddersyet anordning til støtte for biomaterielle membraner under vævskultur er beskrevet, og et eksempel på et vævsmanipuleret transplantat bestående af et lag hornhinde endotelceller og et lag af hornhinde stromale celler på hver side af en kollagen type I membran præsenteres.

Introduction

Hornhinden er et gennemsigtigt væv, der er placeret på forsiden af øjet. Det består af tre store lag: et epitellag på den ydre overflade, et midterstromalag og et indre lag kaldet hornhindenen. Hornhinden endotel er et monolag af celler, der sidder på en kælder membran kaldet Descemet membran, og det fastholder gennemsigtigheden af hornhinden ved at regulere mængden af væske, der kommer ind i stroma fra den underliggende vandighumor. For meget væske i stroma forårsager hornhinde hævelse, uigennemsigtighed og synstab. Endotel er derfor afgørende for at opretholde synet.

Hornhinden endotel kan blive dysfunktionel for en række årsager, herunder aldring, sygdom og skade, og den eneste nuværende behandling er transplantation kirurgi. Under denne operation fjernes endotel og Descemets membran fra patientens hornhinde og erstattes med et transplantat af endotel og Descemets membran fremstillet af en donorhornhinde. Mange endotelgrafts indeholder også et tyndt lag stromale væv til at hjælpe håndtering og fastgørelse til værten hornhinde¹.

På verdensplan er efterspørgslen efter hornhindedonorvæv til transplantationsoperationer større end det beløb, der kan leveres af øjenbanker². Der har derfor været et forsøg på at udvikle vævsfremstillede hornhindeendoteltransplantationer, der kan anvendes til at afhjælpe denne mangel³. Begrundelsen for dette er baseret på det faktum, at i øjeblikket, endotel fra en individuel hornhinde kan kun overføres til en enkelt patient, men hvis hornhinden endotelceller blev først udvidet og dyrket på biomateriale stilladser i vævkultur, de kunne bruges til behandling af flere patienter.

Store udfordringer, der skal løses, før vævsfremstillede hornhindeendoteltransplantationer bliver en mulig mulighed for kirurger, omfatter: 1) etablering af teknikker til udvidelse af hornhindeendotelceller af høj kvalitet og til produktion af modne og funktionelle hornhinde endotelcellelag in vitro, og (2) etablering af teknikker til dyrkning af celler på biomateriale stilladser til fremstilling af væv-manipuleret grafts, der er lig med, eller bedre end donor hornhinden-afledte transplantater, der i øjeblikket anvendes.

Hornhinde endotelceller har en meget lav proliferative potentiale in vivo, men kan stimuleres til at opdele in vitro⁴. Ikke desto mindre har de en stærk tendens til at gennemgå in vitro epithelial-to-mesenchymal transition (EMT), som reducerer deres evne til at danne et modent, funktionelt endotellag. Kendte udløsere for EMT i hornhindeendotelceller omfatter eksponering for visse vækstfaktorer og tab af celle-til-celle kontakt⁵. Det er således næsten uundgåeligt, at hornhinde endotelcellekulturer, der er enzymativt adskilt under subkultur vil gennemgå ændringer i forbindelse med EMT. Her præsenterer vi en cellekulturmetode for humane eller fårehornhindeendotelceller, der er designet til at minimere forstyrrelser af celle-til-celle-kontakter under isolations-, ekspansions- og subkulturfaser for at reducere risikoen for EMT. Desuden viser vi, hvordan vævsfremstillede transplantater, der ligner donorhornhinden-afledt endothelium/Descemets membran/stromale vævstransplantater, kan fremstilles af dyrkningsdyrkede cellelag på begge sider af en biomateriel membran i en specialfremstillet monteringsanordning.

Protocol

Menneskelige hornhinder med donorsamtykke til forskning blev indhentet fra Queensland Eye Bank og brugt med etik godkendelse fra Metro South Hospital and Health Service's Human Research Ethics Committee (HREC/07/QPAH/048). Fårhornhinde blev fremstillet af euthaniserede dyr på Herston Medical Research Facility ved University of Queensland i henhold til en aftale om vævsdeling.

1. Udarbejdelse af dissektionsværktøjer

1. Steriliser to par nummer 4 urmager pincet ved enten iblødsætning dem i en opløsning på 70% ethanol i 5 min eller ved autoklavering dem.

2. Udarbejdelse af kulturmedium- og vævskulturplader

1. Forbered 100 ml kulturmedium, der indeholder Opti-MEM 1 (1x) + GlutaMAX-1, 5% føtal kvægserum og 100 U/ml Pen/Strep. Dette dyrkningsmedium er tilstrækkeligt til fårehornhindecellekulturer, men for humane hornhindecellekulturer skal mediet suppleres med 50 μg/ml kvæghypitærekstrakt, 0,08% chondroitinsulfat, 200 μg/mL calciumchlorid og 0,3 mM L-ascorbinsyre 2-fosfat. Kulturmediet kan opbevares i mørke ved 4 °C i to uger.
2. Coat brøndene i en 6-brøndvævskulturplade med fastgørelsesfaktor ved hjælp af producentens anvisninger, og tilføj derefter 1 ml kulturmedium til hver belagt brønd. Forbered en brønd for hver hornhinde.

3. Procedure for udryddelseaf dissektion og cellekultur

1. Placer hornhinden, endotel side op, i en steril Petri skål på scenen af en dissekere mikroskop. Juster belysningen, så hornhindens overflade er godt oplyst med tilstrækkelig kontrast til at fremhæve det endotellag. Juster zoomen, så kanten og nogle centrale hornhindeendotel er i betragtning.
2. Brug steriliserede urmagerpincet til forsigtigt at løfte og rive Descemets membran væk fra den underliggende stroma (Figur 1). Membranen vil løsne sig fra stroma som en strimmel, der straks krøller op. Placer strimlen i en brønd af en 6-brøndvævkulturplade, der er belagt med attachment factor og indeholder 1 ml kulturmedium. Låget af vævskulturpladen skal altid holdes tændt, undtagen når der tilsættes graveplanter, for at reducere risikoen for kontaminering.
3. Fjern strimler af Descemets membran fra den ekstreme periferi af endotel først og derefter fra centrale regioner senere. Placer alle strimler fra en hornhinde i en enkelt brønd inden for 6-brøndspladen.
4. Inkubere explanterne i en befugtet cellekulturkuvøse, der er fastsat til 5% CO₂ og 37 °C. Lad kulturen være uforstyrret i 2 dage, så explanterne kan bosætte sig og fastgøres til pladeoverfladen. Typisk, op til en tredjedel af explants undlader at knytte til pladen.
5. Fjern mediet og eventuelle ikke-vedlagte explants fra kulturen efter 4 dage og tilsæt forsigtigt 2 ml frisk kultur medium, der tager sig af ikke at forstyrre de vedlagte explants. Kulturmediet bør ændres to gange om ugen.

4. Kontinuerlig produktion af hornhinde endotelceller ved seriel explant kultur

BEMÆRK: Explants kan overføres til friske vævkulturplader efter 10 dage for at etablere yderligere hornhindecellekulturer.

1. Placer explant kulturen på scenen af et dissekeret mikroskop og juster belysningen og zoom, så explanterne er synlige.
2. Brug steriliseret urmager pincet, forsigtigt plukke hver explant fra sin kultur plade og overføre det til en frisk brønd af en 6-brønd væv kultur plade, der er blevet belagt med Attachment Factor og indeholder 1 ml kultur medium.
3. Lad explants at bosætte sig på overfladen af deres nye plade i 4 dage, før udskiftning af kulturmedium med 2 ml frisk kultur medium. Skift kulturmedium ændret to gange om ugen.

5. Dyrkning af hornhindeendotelceller på glasdækseringsprøver til immunfluorescensanalyser

BEMÆRK: Cellekulturer, der er bestemt til at blive analyseret ved hjælp af immunfluorescens, bør etableres på glasdækstræk, der kan monteres på glasmikroskopslides efter farvningsproceduren.

1. Steriliser en pakke runde glasdæksglider med en diameter på 13 mm i en autoklave eller ved iblødsætning i 70 % ethanol i 15 minutter efterfulgt af tre skylninger i fosfatbufferet saltvand (PBS).
2. Placer individuelle coverslips i brøndene på en 24-brøndvævkulturplade, coat dem med attachment factor, og tilsæt derefter 0,5 ml kulturmedium til hver brønd.
3. Ved hjælp af steriliserede urmager pincet fjerne explants fra deres væv kultur plader og overføre dem til brønde, der indeholder coverslips. Lad explants at bosætte sig på dæksedler i 4 dage, før du skifter mediet.
4. Efter den krævede inkubationstid skal du fastgøre og plette coverslip-kulturerne i deres kulturbrønde. Monter de farvede dækslips på glasmikroskopslides til analyse under et fluorescensmikroskop.

6. Subkultur af hornhinde endotelceller ved hjælp af Dispase II

BEMÆRK: Store fibroblastiske celler kan selektivt fjernes fra explant kulturer i 6-brøndplader før undervænning ved hjælp af denne procedure. Hvis alle celler skal være subkulturerede, må du ikke udføre trin 6.2 til 6.4. Formålet med denne procedure er at overføre cellerne til friske plader og samtidig bevare deres celle-til-celle kontakter så meget som muligt. Cellerne skal håndteres forsigtigt. Helt flydende brønde bør passage i et forhold på 1:2, mens subconfluent brønde bør passage i et forhold på 1:1 eller mindre.

1. Fjern mediet fra kulturen og skyl kort med DPBS.
2. Tilføj 1 ml versne. Inkuberved stuetemperatur i 30 s.
3. Fjern Versene og tilføj 1 ml trypLE. Inkuber ved 37 °C i vævskulturkuvøseren i 3 min.
4. Overhold kulturen ved hjælp af et fasekontrastmikroskop. Tryk forsigtigt på kulturen for at løsne celler fra pladen. Så snart de store fibroblastiske celler har løsrevet sig fra pladen fjerne dem og TrypLE ved hjælp af en 1 ml pipette. Vask resterende TrypLE fra de resterende celler ved at skylle to gange med 2 ml DPBS.
5. Tilføj 1 ml 1 mg/ml Dispase II til kulturen og inkubatoren i vævskulturinkubatoren i 1 til 2 timer, eller indtil alle celler er løsrevet fra pladen. Cellerne skal gradvist flyde væk fra pladen i klumper.
6. Opsaml cellerne ved hjælp af en 1 ml pipette og overføres til 20 ml DPBS i et 50 ml centrifugerør. Centrifugeret i 5 min ved 300 x g ved stuetemperatur.
7. Fjern supernatantet, og ophæng forsigtigt cellepelletved trituration med en 1 ml pipette i 1 ml kulturmedium. Celleaffjedringen overføres til enten en eller to brønde af en 6-brønds plade, til passage i et forhold på henholdsvis 1:1 eller 1:2.
8. Fyld mediet op i hver brønd for at lave 2 ml og placere kulturerne i vævskulturkuvøsen. Udskift mediet med 2 ml frisk medium to gange om ugen.

7. Vækst af hornhinde endotelcellelag på biomaterialemembraner

BEMÆRK: Følgende procedure beskriver de trin, der er involveret i montering af et membranøst biomateriale i en specialfremstillet monteringsenhed – kaldet et mikro-Boyden kammer – til cellekultur. Se vores seneste publikation⁶ for yderligere oplysninger om enheden og for at købe oplysninger.

1. Saml det øverste kammer i mikro-Boyden kammer ved at placere en rød O-ring i midten.
2. Brug en trephine med en diameter på 18 mm til at slå en disk ud fra et biomaterialeark på et polytetrafluorethylen (PTFE) skærebræt. Placer denne skive over den røde O-ring i mikro-Boyden kammerets øverste kammer.
3. Skru det nederste kammer på det øverste kammer, sikre biomateriale disken i mellem.
4. Soak den samlede mikro-Boyden kammer i 70% ethanol i 1 time for at sterilisere det.
5. Det samlede mikro-Boyden-kammer nedsænkes fuldstændigt i sterile HBSS i 10 minutter for at fjerne ethanolen. Gentag dette vasketrin to gange. Udfør et sidste vasketrin i 10 min i ikke-suppleret kulturmedium.
6. Overfør det steriliserede mikro-Boyden kammer til kulturmedium i brønden af en 6-brønds plade, der sikrer, at det øverste kammer er øverste. Juster kulturmediets niveau, så det kommer i kontakt med den nederste overflade af den biomaterielle membran, men ikke strømmer ind i det øverste kammer.
7. Forbered en suspension af hornhinde endotelceller ved hjælp af proceduren i afsnit 6. Der bør opnås tilstrækkelig celletæthed i suspensionen til at tillade en såningstæthed på mindst 100.000 celler pr. cm² på membranen i mikro-Boydenkammeret. Kulturarealet i mikro-Boyden kammeret er 0,5 cm^2, og det kan rumme et volumen på 100 μL. Derfor bør der fremstilles en suspension indeholdende 500.000 celler/ml.
8. Pipette 100 μL celleaffjedring (50.000 celler) på membranen i mikro-Boyden kammeret. Inkuberie i vævskultur kuvøse i 4 timer, før topping op medium til helt nedsænkekammeret. Inkuberkulturen i den ønskede periode og erstatter mediet to gange om ugen.
   BEMÆRK: Når hornhinden endotelceller har knyttet til den øverste overflade af den biomaterielle membran mikro-Boyden kammeret kan vendes i kulturen godt, således at det nederste kammer er øverste. Flere celler kan derefter føjes til kammeret for at indlede cellekulturer på den anden overflade af membranen. For eksempel kan hornhinde stromale celler let anvendes på den alternative overflade og dermed efterligne den relative placering af hornhinde celletyper som ses i den bageste hornhinde.

Representative Results

Metoden til isolering og udvidelse af hornhindeendotelceller fra human- eller fårehorn er sammenfattet i figur 1 og figur 2. De fleste explants, der er afledt af hornhinder ne af 1 til 2-årige får eller menneskelige donorer på under 30 år vil knytte til Attachment Factor-belagtvæv kultur plader inden for en uge, men det er ikke usædvanligt at opdage, at op til en tredjedel af explants undlader at vedhæfte inden for denne tid. Disse 'flydende' explants kan fjernes fra kulturerne. Explants fra menneskelige donorer ældre end 30 år er mindre tilbøjelige til at knytte til pladen og også mindre tilbøjelige til at producere cellekulturer. Repræsentative billeder af hornhindecellekulturer fra får og menneskelige eksplanter er vist i figur 3 og figur 4. De celler, der kommer ud af explants generelt forblive i kontakt med hinanden, da de migrerer ud på pladen. Denne form for migration er kendt som kollektiv celle migration, og det er en funktion af epitelceller⁷. Ved 2 ugers kultur, pletter af små, tætpakkede celler vil have dannet umiddelbart ved siden af mange af de explants fra både får og menneskelige hornhinder⁸. Disse plastre af celler udviser ikke morfologiske egenskaber af EMT og udvide langsomt over tid. Større celler med mere uregelmæssige, fibroblastiske former kan findes uden for disse patches. Når kulturerne er etableret, kan explanterne fjernes ved hjælp af pincet og placeres i friske plader for at etablere nye kulturer.

Små, tætpakkede celler i hornhindenensendotelcellekulturer er meget modstandsdygtige over for fordøjelsen med TrypLE, mens de større fibroblastiske celler er mere følsomme over for det. Denne forskel i TrypLE-resistens kan udnyttes til selektivt at fjerne store celler fra kulturerne, før de overfører de mindre celler til nye plader. Repræsentative billeder af menneskelige hornhinde endotelcellekulturer under hele subkuleringsprocessen ved hjælp af TrypLE og Dispase II er vist i figur 4.

Immunfluorescensanalyser kan udføres på hornhindeendotelcellekulturer for at finde specifikke proteiner i cellerne. Et eksempel herpå findes i figur 5. Explants fra får og menneskelige hornhinder blev placeret på Attachment Factor-belagte glasdækslips i 24-brøndsplader og dyrket i 4 uger. Explants blev fjernet, og derefter kulturer blev analyseret ved hjælp af immunfluorescens for tilstedeværelsen af ZO-1, et stramt kryds protein, og N-cadherin, en tilhængere krydsprotein, ifølge vores offentliggjorte protokol⁹. De samme anti-ZO-1 og anti-N-cadherin antistoffer blev brugt til både får og humane celler, og resultaterne viste, at begge proteiner blev påvist i plasmamembraner af celler fra begge arter. ZO-1 er normalt til stede som et særskilt bånd ved cellegrænsen, men bliver svag eller fraværende i celler, der gennemgår EMT. Derfor viste det robuste ZO-1-udtryk i disse kulturer, at cellerne ikke havde undergået EMT.

Vores specialfremstillede mikro-Boyden kamre er designet til at suspendere en biomaterialemembran i brønden af en 6-brøndvævkultur plade (Figur 6). Proceduren for montering af en biomateriel membran i et mikro-Boyden kammer er vist i figur 7. Udformningen af mikro-Boyden kammer gør det muligt begge sider af membranen suspenderet i det, der skal anvendes som cellekultur overflader samtidigt. For at påvise dette, får stromale celler stammer fra hornhinden stromale væv blev seedet ved en tæthed på 100.000 celler / cm² på den ene side af en kollagen type I membran og derefter 24 timer senere kammeret blev vendt over og får hornhinde endotelceller blev seedet på den anden side af membranen i en tæthed på 400.000 celler / cm². De vævsmanipulerede cellelag blev dyrket i 4 uger, derefter fastgjort med 10% neutral bufferformalin og farves ved hjælp af rhodamin phalloidin og Hoechst nukleare farvestof 33342. De blev derefter undersøgt og fotograferet ved hjælp af et konfokalmikroskop (figur 8). Et tværsnit visning af væv-manipuleret celle konstruktion afslørede et enkelt lag af hornhinde endotelceller på den ene overflade af kollagen membran og en multi-lagkultur af hornhinde stromale celler på den anden overflade.

Figur 1: Teknik til opnåelse af explants af endotel/Descemets membran fra friske hornhinder. (A) Hornhinden er placeret endotel-side op i en petriskål under et dissekeret mikroskop. (B) Nærbillede af det område, der er angivet med et rødt rektangel i (A). Urmager pincet bruges til forsigtigt at skrælle væk Descemet membran fra den underliggende stroma. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Procedure for etablering og udvidelse af kulturer af hornhindeendotelceller fra endotel/Descemets membran udleder. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Repræsentative fasekontrastbilleder af endotelcellekulturer under den første etablering fra udstillingsplanter af fårehornhindendothelium/Descemets membran. (A) En fårehornhinde endotel /Descemetmembran enplante efter 3 dage i kultur. Hornhinde endotelceller er begyndt at migrere på pladen. (B) En fåregravningskultur efter 1 uge. Explanten er omgivet af et flydende ark celler. (C)En fåregravkultur efter 2 uger. Små celler omgiver explant, mens større celler er placeret længere væk. (D) En fåregravkultur efter 6 uger. Et område med små, tætpakkede celler ses ved siden af et område med større celler. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Isolering af små, tætpakkede humane hornhindeendotelceller til subkulturer. (A) En menneskelig hornhinde endotel / Descemet membran explant kultur efter 7 uger. Mange små, tætpakkede celler er til stede ved siden af explant. (B) Regioner med små, tætpakkede celler udvikler sig i menneskelige explant kulturer på samme måde som dem, der observeres i fårefrikulturer. (C)En menneskelig explant kultur efter fjernelse af explant og efter 20 min eksponering for TrypLE. Små, tætpakkede celler har bevaret deres tilknytning til pladen, mens de større celler har flød væk. (D) En menneskelig hornhinde endotelcellekultur efter 1 time i Dispase II. De fleste celler har løsrevet fra pladen som fritflydende klumper. (E) En menneskelig hornhinde endotelcelle subkultur efter 1 dag. Celler har migreret udad fra celleklumper, der blev isoleret fra den oprindelige explant kultur. (F) En menneskelig hornhinde endotelcelle subkultur efter 12 dage. Cellerne har dannet et flydende monolag. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Lokalisering af ZO-1- og N-cadherinproteiner i fåre- og menneskehornhindens endotelceller ved dobbeltmærkning af immunfluorescens. Får og menneskelige hornhinde endotel / Descemet membran explant kulturer blev etableret på Attachment Factor-belagtglas coverslips og analyseret efter 4 uger. Både ZO-1 (grøn plet) og N-cadherin (rød plet) blev påvist i fårene (A og B) og menneskelige (D og E)hornhinde endotelceller. Analyse af de fusionerede billeder viste, at de to proteiner var stærkt co-lokaliseret inden for kulturerne (C og F). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Diagram over et mikroboykammer, der vises i tværsnit. Vores specialfremstillede mikro-Boyden kammer består af et øvre kammer, et lavere kammer og en O-ring. Det kan bruges til at suspendere enhver form for membranøs materiale inden for en vævkultur godt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 7: Proceduren for montering af en biomateriel membran i et mikro-Boyden kammer til vævskultur. A) Det udstyr, der kræves til denne procedure, omfatter et polytetrafluorethylenskærebræt, et par pincet, en trephine med en diameter på 18 mm, et specialfremstillet mikroboydenkammer og en biomateriel membran. (B) Brug trephine til at slå en skive ud fra den biomaterielle membran. C) Placer O-ringen i monteringsanordningens øverste kammer, og læg derefter den biomaterialeskive over den. (D) Skru underkammeret på monteringsanordningens øverste kammer. (E) Det samlede mikro-Boyden kammer er klar til at blive steriliseret med 70% ethanol. (F) Nedsænke steriliseret mikro-Boyden kammer i vævkultur medium i brønden af en 6-brønd væv kultur plade. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 8: Fårehornhindeendotels- og stromale celler på modsatte sider af en kollagentype I-membran. Cellerne blev plettet med phalloidin rhodamin at visualisere actin (rød) og Hoechst at visualisere kerner (blå). Kollagen type I membran var ikke plettet og er derfor ikke synlig i disse billeder, der blev indsamlet ved hjælp af konfokal mikroskopi. A) Lav forstørrelse, tværsnittet af den vævskonstruerede konstruktion. Et tyndt lag actin, der repræsenterer en hornhindecellekultur, er synlig på membranens overside, og et tykkere lag actin, der repræsenterer en stromale cellekultur, er til stede på membranens nederste overflade. Blå kerner vises ikke på dette billede. (B) Et ansigtsbillede af hornhinden endotelcellelag, der viser både actin og nuclei farvning. (C) En ansigtsvisning af hornhinden stromale cellelag viser både actin og kerner farvning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

En betydelig teknisk udfordring forbundet med at etablere og udvide humane hornhinde endotelceller forhindrer EMT i at forekomme i kulturerne. EMT kan udløses i hornhinde endotelceller ved tab af celle-til-celle kontakt, men de fleste cellekultur protokoller for disse celler indebærer enzymatisk dissociation til enkelte celler under isolation og subkultur¹⁰. Her præsenterer vi en alternativ cellekultur protokol for hornhinde endotelceller, der minimerer risikoen for celler mister kontakten med hinanden i isolation og subkultur faser.

Vores metode til oprettelse af hornhinde endotelcellekulturer indebærer at placere explants af endothelium / Descemet membran fra donor hornhinder i vævkultur plader under forhold, der gør det muligt for cellerne til kollektivt at migrere ud fra membraner og på pladerne. For at dette kan lykkes, skal explant danne en stram fastgørelse til vævskulturpladen, og dette opnås bedst ved ikke at forstyrre pladen i flere dage efter, at kulturerne er blevet oprettet. En anden kritisk faktor i den vellykkede etablering af hornhinde endotelcellekulturer fra mennesker er en alder af donor. Højere succesrater tendens til at blive opnået fra donorer yngre end 30 år.

En ulempe ved at bruge explant kultur metode til oprettelse af hornhinde endotelcellekulturer er den relativt lange periode, der eksisterer mellem opsætning af kulturer og opnå et stort antal celler. Såkaldte 'peel-and-digest' metoder indebærer stripning endotel fra donor hornhinder og fordøje det med enzymer til at frigive cellerne til kultur¹¹. Disse typer metoder vil producere kulturer, der indeholder flere celler i første omgang end dem, der er etableret fra explants.

Vores explant kultur metode til hornhinde endotelceller producerer kulturer, der indeholder meget små, kompakte, modne celler af høj kvalitet. Men kulturerne indeholder også større, mindre ideelle celler mod pladens periferi. De større celler kan fjernes ved fordøjelsen med TrypLE og kasseres, hvis det ønskes, men dette reducerer antallet af celler til rådighed for subkultur. Men, explants, der med succes har indledt primære cellekulturer er næsten altid i stand til at indlede yderligere cellekulturer, og denne evne kan udnyttes til at opnå et stort antal celler af høj kvalitet.

Vores subkulturmetode til hornhindeeneceller indebærer, at dispase II forsigtigt løftecelleklumper væk fra vævskulturpladen til overførsel til friske plader, og selv om denne metode er designet til at minimere muligheden for EMT forekommer i passage celler, skal det bemærkes, at det ikke reducerer risikoen til nul.

Det har været målet for mange grupper at udvikle væv-manipuleret hornhinde endotelcelle lag til transplantation formål. Mange forskellige materialer er blevet afprøvet som bærere for cellerne og en række forskellige metoder er blevet brugt til at begrænse materialet fra at bevæge sig rundt i kulturpladen under cellekultur. De fleste metoder indebærer forankring af materialet til overfladen af vævskulturpladen eller anden måde, begrænse cellevækst til den øverste overflade af membranen alene. Mens disse metoder kan anvendes til at producere enkelte lag af væv-manipuleret hornhinde endotel, der ville svare til endothelium / Descemet membran grafts (DMEK grafts), kunne de ikke bruges til at producere væv-manipuleret ækvivalenter af endotel / Descemet membran / stroma grafts (DSEK eller DSAEKs grafts), der er mest almindeligt anvendt af kirurger i øjeblikket. Vi har derfor udviklet en membran montering enhed kaldet en mikro-Boyden kammer, der gør det muligt for celler, der skal samtidig dyrkes på begge overflader af en suspenderet biomateriale membran, og har brugt det til at producere væv-manipuleret grafts bestående af hornhinde endotelceller og hornhinde stromale celler på modsatte overflader af kollagen type I membraner. Disse dobbeltlagede vævsfremstillede transplantater kan potentielt anvendes til at erstatte donorhornhindebaserede transplantater af endotel- og stromale væv på begge sider af Descemets membran (DSEK- eller DSAEK-transplantater).

Sammenfattende er de metoder, der præsenteres i denne artikel er designet til dem, der ønsker at opnå primære hornhinde endotelceller af høj kvalitet til brug i vævstekniske undersøgelser. Blide dyrkningsmetoder beskrives, som er designet til at reducere risikoen for, at cellerne gennemgår EMT, og der præsenteres en metode til dyrkning af cellerne på suspenderede biomaterialemembraner. Vi håber, at disse metoder kan hjælpe andre i retning af deres mål om at producere væv-manipuleret hornhinde endotel transplantationer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Attachment factor	Gibco	S006100	A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C.
Bovine pituitary extract	Gibco	13028014	A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots.
Calcium chloride	Merck	C5670	Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise.
Centrifuge tube, 50 ml	Labtek	650.550.050
Chondroitin sulphate	LKT Laboratories	C2960	This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Dispase II	Gibco	17105-041	Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Ethanol	Labtek	EA043	100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces.
Foetal bovine serum	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.03	This is a HyClone brand of foetal bovine serum.
Coverglass No. 1, Ø 13 mm	Proscitech	G401-13	Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture.
HBSS	Gibco	14025-092	Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride.
L-ascorbic acid 2-phosphate	Merck	A8960	Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise.
Micro-Boyden chamber	CNC Components Pty. Ltd.	Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007	Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE).
O-ring for micro-Boyden chamber	Ludowici Sealing Solutions	RSB012	Composed of silicon rubber.
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1	Gibco	51985-034	A reduced serum medium containing glutamine.
DPBS	Gibco	14190-144	Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride.
Pen Strep	Gibco	15140-122	A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin.
Petri dish	Sarstedt	82.14473.001	Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections.
Tissue culture plate, 24 well	Corning Incorporated	Costar 3524	A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2.
Tissue culture plate, 6 well	Corning Incorporated	Costar 3516	A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2.
TrypLE Select	Gibco	12563-011	A 1X enzyme solution for dissociating cells.
Versene	Gibco	15040-066	A 1X EDTA solution for dissociating cells.
Watchmaker forceps	Labtek	BWMF4	Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas.