Groei van menselijke en schapen hoornvlies endotheliale cellagen op biomateriële membranen

Summary

Dit protocol beschrijft de kritieke stappen die nodig zijn om hoornvliesendotheliale celculturen uit explants van menselijk of schapenweefsel vast te stellen en te kweken. Er wordt ook een methode gepresenteerd voor het subculturen van hoornvliescellen op membranous biomaterialen.

Abstract

Hoornvlies endotheelcelculturen hebben de neiging om epitheel-naar-mesenchymale overgang (EMT) te ondergaan na verlies van cel-op-cel contact. EMT is schadelijk voor de cellen omdat het hun vermogen om een volwassen en functionele laag te vormen vermindert. Hier presenteren we een methode voor het vaststellen en subcultureren van menselijke en schapen hoornvlies endotheliale celculturen die het verlies van cel-op-cel contact minimaliseert. Explants van hoornvlies endothehelium / Descemet's membraan worden genomen uit donorhoornvliezen en geplaatst in weefselcultuur onder omstandigheden die het mogelijk maken de cellen collectief migreren naar het cultuuroppervlak. Zodra een cultuur is vastgesteld, worden de explants overgebracht naar verse platen om nieuwe culturen te initiëren. Dispase II wordt gebruikt om klontjes cellen voorzichtig van weefselkweekplaten te tillen voor subculturing. Hoornvlies endotheelcelculturen die met dit protocol zijn vastgesteld, zijn geschikt voor de overdracht naar biomateriële membranen om weefsel-gemanipuleerde cellagen te produceren voor transplantatie in dierproeven. Een op maat gemaakt apparaat voor de ondersteuning van biomateriële membranen tijdens weefselkweek wordt beschreven en een voorbeeld van een weefsel-engineered graft samengesteld uit een laag hoornvlies endotheelcellen en een laag hoornvlies stromal cellen aan weerszijden van een collageen type I membraan wordt gepresenteerd.

Introduction

Het hoornvlies is een transparant weefsel dat zich aan de voorkant van het oog bevindt. Het bestaat uit drie grote lagen: een epitheellaag op het buitenoppervlak, een middelste stromalaag en een binnenste laag genaamd het hoornvliesendotheel. Het hoornvlies endothehelium is een monolaag van cellen die zit op een kelder membraan genaamd Descemet's membraan en het handhaaft de transparantie van het hoornvlies door het reguleren van de hoeveelheid vloeistof die de stroma van de onderliggende waterige humor. Te veel vocht in de stroma veroorzaakt hoornvlies zwelling, dekking en verlies van het gezichtsvermogen. Het endotheel is daarom van vitaal belang voor het behoud van visie.

Het hoornvlies endotheel kan disfunctioneel worden om een aantal redenen, waaronder veroudering, ziekte en letsel, en de enige huidige behandeling is transplantatie chirurgie. Tijdens deze operatie worden het endotheel en het membraan van Descemet uit het hoornvlies van de patiënt verwijderd en vervangen door een graft van endotheel en het membraan van Descemet verkregen uit een donorhoornvlies. Veel endotheelgrafts bevatten ook een dunne laag stromal weefsel om de behandeling en gehechtheid aan het gastheerhoornvlies te helpen¹.

Wereldwijd is de vraag naar hoornvliesdonorweefsel voor transplantatieoperaties groter dan het bedrag dat door oogbanken kan worden geleverd². Er is daarom een drive om weefsel-engineered hoornvlies endotheeltransplantaties die kunnen worden gebruikt om dit tekort te verlichten³ontwikkelen. De reden hiervoor is gebaseerd op het feit dat momenteel, endotheel van een individueel hoornvlies kan alleen worden overgedragen aan een enkele patiënt, echter, als het hoornvlies endotheel cellen werden voor het eerst uitgebreid en geteeld op biomateriële steigers in weefselcultuur, ze kunnen worden gebruikt om meerdere patiënten te behandelen.

Grote uitdagingen die moeten worden aangepakt voordat weefsel-engineered hoornvlies endotheeltransplantaties een haalbare optie voor chirurgen worden: (1) het vaststellen van technieken voor het uitbreiden van hoornvlies endotheelcellen van hoge kwaliteit en voor het produceren van volwassen en functionele hoornvlies endotheel cellagen in vitro, en (2) het vaststellen van technieken voor het kweken van de cellen op biomateriële steigers om weefsel-engineered grafts die gelijk zijn aan, of beter dan, de donor hoornvlies-afgeleide grafts die momenteel worden gebruikt te produceren.

Hoornvliesendotheliale cellen hebben een zeer laag proliferative potentieel in vivo, maar kunnen worden gestimuleerd om in vitro te verdelen⁴. Niettemin hebben ze een sterke neiging om in vitro epitheel-naar-mesenchymale overgang (EMT) te ondergaan, wat hun vermogen om een volwassen, functionele endotheellaag te vormen vermindert. Bekende triggers voor EMT in hoornvlies endotheelcellen zijn blootstelling aan bepaalde groeifactoren en verlies van cel-op-cel contact⁵. Het is dus bijna onvermijdelijk dat hoornvliesendotheliale celculturen die enzymatisch gescheiden zijn tijdens de subcultuur veranderingen zullen ondergaan die verband houden met EMT. Hier presenteren we een celkweekmethode voor menselijke of schapen hoornvliesendotheliale cellen die is ontworpen om verstoring van cel-cel-celcontacten tijdens isolatie-, expansie- en subcultuurfasen te minimaliseren, om het potentieel voor EMT te verminderen. Bovendien tonen we aan hoe weefsel-engineered grafts die lijken op donor hoornvlies-afgeleide endotheel / Descemet's membraan / stromal weefsel grafts kunnen worden geproduceerd door groeiende gekweekte cellagen aan beide zijden van een bio-materiaal membraan in een op maat gemaakte montage-apparaat.

Protocol

Menselijke hoornvliezen met donortoestemming voor onderzoek werden verkregen van de Queensland Eye Bank en gebruikt met ethische goedkeuring van de Metro South Hospital en Health Service's Human Research Ethics Committee (HREC/07/QPAH/048). Schapen hoornvliezen werden verkregen uit geëuthanaseerde dieren op de Herston Medical Research Facility van de Universiteit van Queensland onder een weefsel delen overeenkomst.

1. Bereiding van hulpmiddelen voor ontleding

1. Steriliseren twee paar van nummer 4 horlogemaker forceps door ofwel weken ze in een oplossing van 70% ethanol voor 5 min of door autoclaving hen.

2. Bereiding van kweekmedium- en weefselkweekplaten

1. Bereid 100 mL kweekmedium met Opti-MEM 1 (1x) + GlutaMAX-1, 5% foetaal runderserum en 100 U/mL Pen/Strep. Dit kweekmedium is voldoende voor schapenhoornvliescelculturen, maar voor menselijke hoornvliesendotheliale celculturen moet het medium worden aangevuld met 50 μg/mL runderpituitary extract, 0,08% chondroitinsulfaat, 200 μg/mL calciumchloride en 0,3 mM L-ascorbinezuur 2-fosfaat. Kweekmedium kan twee weken lang in het donker bij 4 °C worden opgeslagen.
2. Bestrijk de putten van een 6-goed weefsel kweekplaat met Attachment Factor met behulp van de instructies van de fabrikant en voeg vervolgens 1 mL kweekmedium toe aan elke goed gecoate gecoate. Bereid een goed voor elk hoornvlies.

3. Explant dissectie en celkweekprocedure

1. Plaats het hoornvlies, endotheel kant omhoog, in een steriele petrischaal op het podium van een ontledende microscoop. Pas de verlichting zo aan dat het hoornvliesoppervlak goed verlicht is met voldoende contrast om de endotheellaag te markeren. Pas de zoom zo in dat de rand en een centraal hoornvliesendotheel in zicht is.
2. Gebruik gesteriliseerde horlogemaker forceps om voorzichtig lift en scheur Descemet's membraan uit de buurt van de onderliggende stroma (Figuur 1). Het membraan zal loskomen van de stroma als een strip die onmiddellijk opgerold. Plaats de strip in een put van een 6-goed weefsel kweekplaat die is bekleed met Attachment Factor en bevat 1 mL van cultuur medium. Het deksel van de weefselkweekplaat moet te allen tijde worden ingeschakeld, behalve wanneer er explanten aan worden toegevoegd, om het risico op besmetting te verminderen.
3. Verwijder strips van Het membraan van Descemet uit de extreme periferie van het endotheel eerst en vervolgens uit centrale gebieden later. Plaats alle stroken van één hoornvlies in één enkele put binnen de 6-put plaat.
4. Bebroed de explants in een bevochtigde celkweekincubator op 5% CO₂ en 37 °C. Laat de cultuur 2 dagen ongestoord staan om de explants te laten verzinken en aan het plaatoppervlak te bevestigen. Meestal, tot een derde van de explants niet te hechten aan de plaat.
5. Verwijder het medium en eventuele niet-aangesloten explants na 4 dagen uit de cultuur en voeg voorzichtig 2 mL vers kweekmedium toe, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de bijgevoegde explants niet worden verstoord. Cultuurmedium moet twee keer per week worden gewijzigd.

4. Continue productie van hoornvliesendotheelcellen door seriële explantcultuur

OPMERKING: Explants kunnen na 10 dagen worden overgebracht naar verse weefselkweekplaten om extra hoornvliescelculturen vast te stellen.

1. Plaats de explantcultuur op het podium van een ontledende microscoop en pas de verlichting aan en zoom zodat de explants zichtbaar zijn.
2. Met behulp van gesteriliseerde horlogemaker forceps, voorzichtig plukken elke explant uit zijn cultuur plaat en breng het naar een frisse put van een 6-goed weefsel cultuur plaat die is bekleed met Attachment Factor en bevat 1 mL van cultuur medium.
3. Laat de explants zich 4 dagen op het oppervlak van hun nieuwe plaat nestelen voordat ze het kweekmedium vervangen door 2 mL vers kweekmedium. Verandering cultuur medium veranderd twee keer per week.

5. Teelt hoornvliesendotheliale cellen op glashoezen voor immunofluorescentieanalyses

OPMERKING: Celculturen die bestemd zijn om te worden geanalyseerd met behulp van immunofluorescentie moeten worden vastgesteld op glazen afdekkingen die na de kleuringsprocedure op glazen microscoopdia's kunnen worden gemonteerd.

1. Steriliseren van een pak ronde glazen afdekkingen met een diameter van 13 mm in een autoclave of door gedurende 15 minuten 70% ethanol te weken, gevolgd door drie spoelingen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
2. Plaats individuele coverslips in de putten van een 24-put weefsel cultuur plaat, coat ze met Attachment Factor, en voeg dan 0,5 mL van de cultuur medium aan elke put.
3. Met behulp van gesteriliseerde horlogemaker forceps verwijderen explants uit hun weefsel cultuur platen en breng ze naar putten met coverslips. Laat de explants zich 4 dagen op de coverslips nestelen voordat ze het medium veranderen.
4. Na de vereiste incubatietijd, vast te stellen en vlekken op de coverslip culturen binnen hun cultuur putten. Monteer de gekleurde coverslips op glazen microscoopdia's voor analyse onder een fluorescentiemicroscoop.

6. Subcultuur van hoornvliesendotheliale cellen met Dispase II

OPMERKING: Grote fibroblastische cellen kunnen selectief worden verwijderd uit explant culturen in 6-goed platen voordat subculturing met behulp van deze procedure. Als alle cellen moeten worden subcultuurd, voer dan geen stappen 6.2 tot 6.4 uit. Het doel van deze procedure is om de cellen over te brengen naar verse platen met behoud van hun cel-naar-cel contacten zoveel mogelijk. De cellen moeten voorzichtig worden behandeld. Volledig confluent putten moeten worden doorgepassaged op een verhouding van 1:2, terwijl subconfluent putten moeten worden doorgepassaged bij een verhouding van 1:1 of minder.

1. Haal het medium uit de cultuur en spoel kort af met DPBS.
2. Voeg 1 mL Versene toe. Incubeer bij kamertemperatuur voor 30 s.
3. Verwijder de Versene en voeg 1 mL TrypLE toe. Incubeer bij 37 °C in de weefselkweekincubator gedurende 3 min.
4. Observeer de cultuur met behulp van een fase contrast microscoop. Tik voorzichtig op de cultuur om cellen van de plaat los te maken. Zodra de grote fibroblastische cellen hebben losgemaakt van de plaat verwijder ze en de TrypLE met behulp van een 1 mL pipet. Was de resterende TrypLE van de resterende cellen door twee maal te spoelen met 2 mL DPBS.
5. Voeg 1 mL van 1 mg/mL Dispase II toe aan de kweek en incubeer in de weefselkweekincubator gedurende 1 tot 2 uur of totdat alle cellen van de plaat zijn losgemaakt. De cellen moeten geleidelijk wegdrijven van de plaat in klonten.
6. Verzamel de cellen met behulp van een 1 mL pipet en breng over op 20 mL DPBS in een centrifugebuis van 50 mL. Centrifugeer gedurende 5 min bij 300 x g bij kamertemperatuur.
7. Verwijder de supernatant en voorzichtig opnieuw de cel pellet door trituratie met een 1 mL pipetin in 1 mL van cultuur medium. Breng de celvering over op één of twee putten van een 6-putplaat, naar passage bij een verhouding van respectievelijk 1:1 of 1:2.
8. Vul het medium in elke put aan om 2 mL te maken en plaats de culturen in de weefselkweekincubator. Vervang het medium twee keer per week door 2 mL vers medium.

7. Groei van hoornvliesendotheliale cellagen op biomateriële membranen

OPMERKING: De volgende procedure beschrijft de stappen die betrokken zijn bij het monteren van een membranous biomateriaal in een op maat gemaakt montageapparaat - een micro-Boyden-kamer genoemd - voor celcultuur. Raadpleeg onze recente publicatie⁶ voor meer informatie over het apparaat en voor aankoopgegevens.

1. Monteer de bovenste kamer van de micro-Boyden kamer door het plaatsen van een rode O-ring in het midden.
2. Gebruik een trephine met een diameter van 18 mm om een schijf uit een biomateriaalplaat op een polytetrafluorethyleen (PTFE) snijplaat te slaan. Plaats deze schijf over de rode O-ring in de bovenkamer van de micro-Boyden kamer.
3. Schroef de onderste kamer op de bovenste kamer en vastzet de biomateriaalschijf ertussen.
4. Week de geassembleerde micro-Boyden kamer in 70% ethanol voor 1 uur om het te steriliseren.
5. Dompel de geassembleerde micro-Boyden-kamer gedurende 10 min volledig onder in steriele HBSS om de ethanol te verwijderen. Herhaal deze wasstap twee keer. Voer een laatste wasstap uit voor 10 min in onaangevuld kweekmedium.
6. Breng de gesteriliseerde micro-Boyden kamer naar kweekmedium in de put van een 6-put plaat ervoor te zorgen dat de bovenste kamer is bovenste. Pas het niveau van kweekmedium aan zodat het het onderste oppervlak van het biomateriaalmembraan raakt, maar niet in de bovenste kamer stroomt.
7. Bereid een suspensie van hoornvlies endotheelcellen met behulp van de procedure beschreven in sectie 6. Er moet voldoende celdichtheid in de suspensie worden bereikt om een zaaidichtheid van ten minste 100.000 cellen per cm² op het membraan in de micro-Boyden-kamer mogelijk te maken. Het kweekoppervlak binnen de micro-Boyden kamer is 0,5 cm² en kan een volume van 100 μL bevatten. Daarom moet een suspensie met 500.000 cellen/mL worden voorbereid.
8. Pipetteer 100 μL celsuspensie (50.000 cellen) op het membraan in de micro-Boyden-kamer. Incubeer in de weefselkweekincubator gedurende 4 uur voordat u het medium bijvult om de kamer volledig onder te dompelen. Incubeer de cultuur voor de vereiste periode van tijd, ter vervanging van het medium twee keer per week.
   OPMERKING: Zodra het hoornvlies endotheel cellen hebben bevestigd aan het bovenste oppervlak van het biomateriaal membraan de micro-Boyden kamer kan worden omgedraaid binnen de cultuur goed, zodat de onderste kamer is bovenste. Meer cellen kunnen vervolgens worden toegevoegd aan de kamer om celculturen te initiëren op het andere oppervlak van het membraan. Bijvoorbeeld, hoornvlies stromal cellen kunnen gemakkelijk worden toegepast op het alternatieve oppervlak waardoor het nabootsen van de relatieve locatie van hoornvlies celtypes zoals gezien in het achterste hoornvlies.

Representative Results

De methode voor het isoleren en uitbreiden van hoornvliescellen van menselijke of schapenhoornvliezen wordt samengevat in figuur 1 en figuur 2. De meeste explants die zijn afgeleid van de hoornvliezen van 1 tot 2-jarige schapen of menselijke donoren van minder dan 30 jaar oud zal hechten aan Attachment Factor-gecoate weefsel kweekplaten binnen een week, echter, is het niet ongebruikelijk om te vinden dat tot een derde van de explants niet hechten binnen deze tijd. Deze 'zwevende' explants kunnen uit de culturen worden verwijderd. Explants van menselijke donoren ouder dan 30 jaar hebben minder kans om hechten aan de plaat en ook minder kans op celculturen te produceren. Representatieve afbeeldingen van hoornvliesendotheliale celculturen die voortkomen uit schapen en menselijke explants worden weergegeven in figuur 3 en figuur 4. De cellen die uit de explants komen, blijven over het algemeen in contact met elkaar als ze op de plaat migreren. Dit soort migratie staat bekend als collectieve celmigratie, en het is een kenmerk van epitheelcellen⁷. Door 2 weken van cultuur, patches van kleine, strak verpakte cellen zal hebben gevormd onmiddellijk naast veel van de explants van zowel schapen en menselijke hoornvliezen⁸. Deze pleisters van cellen vertonen geen morfologische kenmerken van EMT en breiden zich langzaam uit in de tijd. Grotere cellen met meer onregelmatige, fibroblastische vormen kunnen worden gevonden buiten deze patches. Zodra de culturen zijn vastgesteld, kunnen de explants worden verwijderd met behulp van tangen en geplaatst in verse platen om nieuwe culturen te vestigen.

Kleine, strak verpakte cellen in het hoornvlies endotheel celculturen zijn zeer resistent tegen de spijsvertering met TrypLE, terwijl de grotere fibroblastische cellen zijn gevoeliger voor. Dit verschil in TrypLE weerstand kan worden benut om selectief te verwijderen grote cellen uit de culturen alvorens de kleinere cellen over te dragen aan nieuwe platen. Representatieve beelden van menselijke hoornvliesendothelialecelculturen gedurende het subculturingproces met behulp van TrypLE en Dispase II worden weergegeven in figuur 4.

Immunofluorescentie analyses kunnen worden uitgevoerd op hoornvlies endotheliale celculturen om specifieke eiwitten in de cellen te lokaliseren. Een voorbeeld hiervan wordt gepresenteerd in figuur 5. Explants van schapen en menselijke hoornvliezen werden geplaatst op Attachment Factor-gecoate glazen coverslips in 24-goed platen en gekweekt voor 4 weken. De explants werden verwijderd en vervolgens de culturen werden geanalyseerd met behulp van immunofluorescentie voor de aanwezigheid van ZO-1, een strakke kruising eiwit, en N-cadherin, een aanhangers knooppunt eiwit, volgens onze gepubliceerde protocol⁹. Dezelfde anti-ZO-1 en anti-N-cadherine antilichamen werden gebruikt voor zowel schapen als menselijke cellen, en de resultaten toonden aan dat beide eiwitten werden gedetecteerd in de plasmamembranen van cellen van beide soorten. ZO-1 is normaal gesproken aanwezig als een aparte band aan de celgrens, maar wordt zwak of afwezig in cellen die EMT ondergaan. Daarom gaf de robuuste ZO-1-uitdrukking in deze culturen aan dat de cellen geen EMT hadden ondergaan.

Onze op maat gemaakte micro-Boyden kamers zijn ontworpen om een biomateriaal membraan op te schorten in de put van een 6-goed weefsel kweekplaat (Figuur 6). De procedure voor het monteren van een biomateriaalmembraan in een micro-Boyden-kamer is weergegeven in figuur 7. Het ontwerp van de micro-Boyden kamer maakt het mogelijk beide zijden van het membraan opgehangen binnen het gelijktijdig worden gebruikt als celkweek oppervlakken. Om dit aan te tonen, werden schapenstromale cellen afkomstig van hoornvliesstromal weefsel gezaaid met een dichtheid van 100.000 cellen/cm² op de ene kant van een collageentype I membraan en vervolgens 24 uur later werd de kamer omgedraaid en schapen hoornvlies endotheliale cellen werden gezaaid op de andere kant van het membraan met een dichtheid van 400.000 cellen/cm². De weefsel-engineered cellagen werden gekweekt voor 4 weken, dan vastgesteld met 10% neutrale gebufferd formaline en gekleurd met rhodamine falliine en Hoechst nucleaire kleurstof 33342. Vervolgens werden ze onderzocht en gefotografeerd met behulp van een confocale microscoop(figuur 8). Een dwarsdoorsnede van de weefsel-engineered cel constructie bleek een enkele laag van hoornvlies endotheel cellen op een oppervlak van het collageen membraan en een multi-gelaagde cultuur van hoornvlies stromal cellen op het andere oppervlak.

Figuur 1: Techniek voor het verkrijgen van explants van endotheel/Descemet's membraan uit verse hoornvliezen. (A) Het hoornvlies wordt geplaatst endotheel-kant omhoog in een petrischaalonder een ontledende microscoop. (B) Close-up weergave van het gebied aangegeven door een rode rechthoek in (A). Watchmaker tangen worden gebruikt om voorzichtig afpellen Descemet's membraan van de onderliggende stroma. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Procedure voor het tot stand brengen en uitbreiden van culturen van hoornvliesendotheelcellen uit endotheel/de membraanexplant van Descemet. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Representatieve fasecontrastbeelden van endotheelcelculturen tijdens de eerste vestiging van explants van schapenhoornvliesendotheel/het membraan van Descemet. (A) Een schapenhoornvlies endotheel / Descemet membraan explant na 3 dagen in de cultuur. Hoornvlies endotheel cellen zijn begonnen te migreren op de plaat. (B) Een schapen explant cultuur na 1 week. De explant wordt omringd door een confluent vel cellen. (C) Een schapenexplant cultuur na 2 weken. Kleine cellen omringen de explant, terwijl grotere cellen zich verder weg bevinden. (D) Een schapenexplant cultuur na 6 weken. Een gebied van kleine, strak verpakte cellen wordt gezien naast een gebied van grotere cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Isolatie van kleine, strak verpakte menselijke hoornvliesendotheliale cellen voor subculturen. (A) Een menselijk hoornvlies endotheel / Descemet membraan explant cultuur na 7 weken. Veel kleine, strak verpakte cellen zijn aanwezig naast de explant. B) In menselijke explantculturen ontwikkelen zich zich in menselijke explantculturen op dezelfde wijze als in plantenculturen van schapen. (C) Een menselijke explantcultuur na verwijdering van de explant en na 20 min blootstelling aan TrypLE. Kleine, strak verpakte cellen hebben hun gehechtheid aan de plaat behouden, terwijl de grotere cellen zijn weggedreven. (D) Een menselijke hoornvlies endotheel celcultuur na 1 uur in Dispase II. De meeste cellen hebben losgemaakt van de plaat als vrij zwevende klonten. (E) Een menselijke hoornvlies endotheel cel subcultuur na 1 dag. Cellen zijn naar buiten gemigreerd van celklontjes die geïsoleerd waren van de oorspronkelijke explantcultuur. (F) Een menselijke hoornvlies endotheel cel subcultuur na 12 dagen. De cellen hebben een confluente monolayer gevormd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Lokalisatie van ZO-1- en N-cadherine-eiwitten in de membranen van schapen en menselijke hoornvliesendotheelcellen door immunofluorescentie met dubbele etikettering. Schapen en menselijk hoornvlies endotheel / Descemet's membraan explant culturen werden vastgesteld op Attachment Factor-gecoate glas coverslips en geanalyseerd na 4 weken. Zowel ZO-1 (groene vlek) als N-cadherine (rode vlek) werden gedetecteerd in de membranen van schapen (A en B) en menselijke (D en E)hoornvliescellen. Analyse van de samengevoegde beelden bleek dat de twee eiwitten waren zeer co-gelokaliseerd binnen de culturen (C en F). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: Diagram van een micro-Boyden kamer weergegeven in dwarsdoorsnede. Onze op maat gemaakte micro-Boyden kamer bestaat uit een bovenkamer, een onderkamer en een O-ring. Het kan worden gebruikt om elk type membranous materiaal binnen een weefselcultuur goed op te schorten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 7: De procedure voor het monteren van een biomateriaalmembraan in een micro-Boyden kamer voor weefselkweek. (A) De voor deze procedure vereiste uitrusting omvat een polytetrafluorethyleensnijplank, een tang, een trefine met een diameter van 18 mm, een op maat gemaakte micro-Boydenkamer en een biomateriaalmembraan. (B) Gebruik de trephine om een schijf uit het biomateriaalmembraan te slaan. (C) Plaats de O-ring in de bovenste kamer van de montageinrichting en leg de biomateriaalschijf eroverheen. (D) Schroef de onderste kamer op de bovenste kamer van de montageinrichting. (E) De geassembleerde micro-Boyden kamer is klaar om te worden gesteriliseerd met 70% ethanol. (F) Dompel de gesteriliseerde micro-Boyden kamer onder in weefselkweekmedium in de put van een 6-put weefselkweekplaat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 8: Schapenhoornvlies endotheel en stromale cellen aan de andere zijden van een collageentype I membraan. De cellen werden bevlekt met falloïdine rhodamine om actine (rood) en Hoechst te visualiseren om kernen (blauw) te visualiseren. Het collageentype I membraan was niet gekleurd en is daarom niet zichtbaar in deze beelden die werden verzameld met behulp van confocale microscopie. (A) Een lage vergroting, dwarsdoorsnede weergave van de weefsel-engineered constructie. Een dunne laag actine die een hoornvlies endotheliale celcultuur vertegenwoordigt is zichtbaar op het bovenste oppervlak van het membraan, en een dikkere laag actine die een stromalcelcultuur vertegenwoordigt is aanwezig op het onderste oppervlak van het membraan. Blauwe kernen worden niet weergegeven in deze afbeelding. (B) En gezicht uitzicht op het hoornvlies endotheel cel laag met zowel actine en kernen vlekken. (C) En gezicht uitzicht op het hoornvlies stromal cel laag met zowel actine en kernen vlekken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Een belangrijke technische uitdaging in verband met het opzetten en uitbreiden van menselijke hoornvlies endotheelcellen is het voorkomen van EMT optreden in de culturen. EMT kan worden geactiveerd in hoornvlies endotheelcellen door verlies van cel-op-cel contact, maar de meeste celkweek protocollen voor deze cellen te betrekken enzymatische dissociatie naar enkele cellen tijdens isolatie en subcultuur¹⁰. Hier presenteren we een alternatief celkweekprotocol voor hoornvliesendotheliale cellen dat het risico minimaliseert dat cellen contact met elkaar verliezen tijdens de isolatie- en subcultuurstadia.

Onze methode voor het vaststellen van hoornvlies endotheelcelculturen omvat het plaatsen van explants van endotheel /Descemet's membraan van donorhoornvliezen in weefselkweekplaten onder omstandigheden die het mogelijk maken de cellen collectief uit de membranen en op de platen te migreren. Om dit succesvol te laten zijn, moet de explant een strakke bevestiging vormen aan de weefselkweekplaat, en dit kan het best worden bereikt door de plaat enkele dagen nadat de culturen zijn opgezet niet te storen. Een andere kritische factor in de succesvolle oprichting van hoornvlies endotheliale celculturen van de mens is de leeftijd van de donor. Hogere slagingspercentages worden meestal bereikt door donoren jonger dan 30 jaar.

Een nadeel van het gebruik van de explant cultuur methode voor de oprichting van hoornvlies endotheel celculturen is de relatief lange periode die bestaat tussen het opzetten van de culturen en het verkrijgen van grote aantallen cellen. Zogenaamde 'peel-and-digest'-methoden omvatten het strippen van het endotheel van donorhoornvliezen en het verteren met enzymen om de cellen vrij te geven voor cultuur¹¹. Dit soort methoden zou produceren culturen die meer cellen in eerste instantie dan die vastgesteld uit explants.

Onze explant kweekmethode voor hoornvliesendotheelcellen produceert culturen die zeer kleine, compacte, volwassen cellen van hoge kwaliteit bevatten. De culturen bevatten echter ook grotere, minder ideale cellen naar de periferie van de plaat. De grotere cellen kunnen worden verwijderd door de spijsvertering met TrypLE en weggegooid indien gewenst, maar dit vermindert het aantal cellen beschikbaar voor subcultuur. Echter, explants die met succes primaire celculturen hebben geïnitieerd zijn bijna altijd in staat om verdere celculturen te initiëren, en dit vermogen kan worden benut om grote aantallen cellen van hoge kwaliteit te verkrijgen.

Onze subcultuurmethode voor hoornvliesendotheelcellen omvat het gebruik van Dispase II om celklontjes voorzichtig weg te tillen van de weefselkweekplaat voor overdracht naar verse platen, en hoewel deze methode is ontworpen om de kans op EMT in passage te minimaliseren cellen, moet worden opgemerkt dat het niet het risico tot nul te verminderen.

Het is het doel van vele groepen om weefsel-engineered hoornvlies endotheel cellagen voor transplantatiedoeleinden te ontwikkelen. Veel verschillende materialen zijn onderzocht als dragers voor de cellen en een verscheidenheid van verschillende methoden zijn gebruikt om het materiaal te beperken van bewegen in de cultuurplaat tijdens de celcultuur. De meeste methoden omvatten het verankeren van het materiaal aan het oppervlak van de weefselkweekplaat een of andere manier, het beperken van de celgroei tot het bovenste oppervlak van het membraan alleen. Hoewel deze methoden kunnen worden gebruikt om enkele lagen weefsel-engineered hoornvlies endothehelium die gelijkwaardig zou zijn aan endothelium / Descemet's membraan grafts (DMEK grafts) te produceren, konden ze niet worden gebruikt voor weefsel-engineered equivalenten van het endothelium / Descemet's membraan / stroma grafts (DSEK of DSAEK grafts) die het meest worden gebruikt door chirurgen op dit moment te produceren. We hebben daarom een membraanmontageapparaat ontwikkeld, een micro-Boyden-kamer genaamd, waarmee cellen gelijktijdig op beide oppervlakken van een zwevend biomateriaalmembraan kunnen worden gekweekt en hebben het gebruikt om weefsel-ontworpen grafts te produceren, bestaande uit hoornvliesendotheelcellen en hoornvliesstromale cellen op tegenovergestelde oppervlakken van collageen type I membranen. Deze dubbelgelaagde weefsel-engineered grafts kunnen mogelijk worden gebruikt ter vervanging van donor hoornvlies-afgeleide grafts van endotheel en stromal weefsel aan weerszijden van het membraan van Descemet (DSEK of DSAEK grafts).

Samengevat, de methoden die in dit artikel zijn ontworpen voor degenen die willen primaire hoornvlies endotheel cellen van hoge kwaliteit te verkrijgen voor gebruik in weefsel engineering studies. Zachte kweekmethoden worden beschreven die zijn ontworpen om het risico van de cellen die EMT ondergaan te verminderen en een methode voor het kweken van de cellen op zwevende biomateriële membranen wordt gepresenteerd. We hopen dat deze methoden anderen kunnen helpen bij hun doelen van het produceren van weefsel-engineered hoornvlies endotheeltransplantaties.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Attachment factor	Gibco	S006100	A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C.
Bovine pituitary extract	Gibco	13028014	A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots.
Calcium chloride	Merck	C5670	Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise.
Centrifuge tube, 50 ml	Labtek	650.550.050
Chondroitin sulphate	LKT Laboratories	C2960	This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Dispase II	Gibco	17105-041	Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Ethanol	Labtek	EA043	100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces.
Foetal bovine serum	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.03	This is a HyClone brand of foetal bovine serum.
Coverglass No. 1, Ø 13 mm	Proscitech	G401-13	Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture.
HBSS	Gibco	14025-092	Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride.
L-ascorbic acid 2-phosphate	Merck	A8960	Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise.
Micro-Boyden chamber	CNC Components Pty. Ltd.	Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007	Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE).
O-ring for micro-Boyden chamber	Ludowici Sealing Solutions	RSB012	Composed of silicon rubber.
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1	Gibco	51985-034	A reduced serum medium containing glutamine.
DPBS	Gibco	14190-144	Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride.
Pen Strep	Gibco	15140-122	A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin.
Petri dish	Sarstedt	82.14473.001	Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections.
Tissue culture plate, 24 well	Corning Incorporated	Costar 3524	A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2.
Tissue culture plate, 6 well	Corning Incorporated	Costar 3516	A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2.
TrypLE Select	Gibco	12563-011	A 1X enzyme solution for dissociating cells.
Versene	Gibco	15040-066	A 1X EDTA solution for dissociating cells.
Watchmaker forceps	Labtek	BWMF4	Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas.