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Summary

Questo protocollo descrive i passaggi critici necessari per stabilire e coltivare colture di cellule endoteliali corneali da espianti di tessuto umano o o novino. Viene inoltre presentato un metodo per la subcultura delle cellule endoteliali corneali su biomateriali membranosi.

Abstract

Le colture di cellule endoteliali corneali tendono a subire la transizione epiteliale-mesenchica (EMT) dopo la perdita del contatto tra cellule. EMT è deleterio per le cellule in quanto riduce la loro capacità di formare uno strato maturo e funzionale. Qui, presentiamo un metodo per stabilire e sottraire le colture endoteliali umane e ovine che riduce al minimo la perdita di contatto tra cellule. Gli espianti della membrana dell’endotelio/Descemet vengono prelevati dalle cornee dei donatori e messi in coltura dei tessuti in condizioni che consentono alle cellule di migrare collettivamente sulla superficie di coltura. Una volta che una cultura è stata stabilita, gli espianti vengono trasferiti in piastre fresche per avviare nuove culture. Dispase II viene utilizzato per sollevare delicatamente ciuffi di cellule dalle piastre di coltura dei tessuti per una subcultura. Le colture di cellule endoteliali eteliali che sono state stabilite utilizzando questo protocollo sono adatte per il trasferimento a membrane biomateriali per produrre strati cellulari tessuti-ingegnerizzati per il trapianto in sperimentazioni animali. Viene descritto un dispositivo su misura per sostenere le membrane biomateriali durante la coltura dei tessuti e viene presentato un esempio di innesto di tipo tessuto composto da uno strato di cellule endoteliali corneali e da uno strato di cellule stromali corneali su entrambi i lati di una membrana di collagene di tipo I.

Introduction

La cornea è un tessuto trasparente che si trova nella parte anteriore dell’occhio. È composto da tre strati principali: uno strato epiteliale sulla superficie esterna, uno strato di stroma medio e uno strato interno chiamato endotelio corneale. L’endotelio cornealeè è un monostrato di cellule che si trova su una membrana seminterrato chiamata membrana di Descemet e mantiene la trasparenza della cornea regolando la quantità di liquido che entra nello stroma dall’umorismo acquoso sottostante. Troppo fluido all’interno dello stroma provoca gonfiore corneale, opacità e perdita della vista. L’endotelio è quindi vitale per mantenere la visione.

L’endotelio corneo può diventare disfunzionale per una serie di motivi tra cui l’invecchiamento, malattia e lesioni, e l’unico trattamento corrente è la chirurgia del trapianto. Durante questo intervento, l’endotelio e la membrana di Descemet vengono rimossi dalla cornea del paziente e sostituiti con un innesto di endotelio e membrana di Descemet ottenuta da un donatore cornea. Molti innesti di endotelio contengono anche un sottile strato di tessuto stromatale per facilitare la manipolazione e l’attaccamento alla cornea^{ospite 1}.

In tutto il mondo, la domanda di tessuto del donatore di cornea per interventi chirurgici di trapianto è superiore alla quantità che può essere fornita dalle banche degli occhi². È stato quindi dimostrato di sviluppare trapianti di endotelio corneo ingegnerizzati che potrebbero essere utilizzati per alleviare questa carenza³. La motivazione di questo si basa sul fatto che attualmente, l’endotelio da un singolo cornea può essere trasferito solo a un singolo paziente, tuttavia, se le cellule endoteliali corneali sono state prima espanse e coltivate su impalcature biomateriali nella coltura del tessuto, potrebbero essere utilizzate per trattare più pazienti.

Le principali sfide che devono essere affrontate prima che i trapianti di endotelio corneo ingegnerizzati siano un’opzione fattibile per i chirurghi includono: (1) stabilire tecniche per espandere le cellule endoteliali corneali di alta qualità e per produrre strati di cellule endoteliali corneali funzionali in vitro e (2) che stabiliscono tecniche per la crescita delle cellule su scaffold biomateriali per produrre innesti di tessuto che sono uguali o migliori dei innesti derivati dalla cornea del donatore attualmente utilizzati.

Le cellule endoteliali corneali hanno un potenziale proliferativo molto basso in vivo, ma possono essere stimolate a dividersi in vitro⁴. Tuttavia, essi hanno una forte tendenza a subire una transizione epiteliale-mesenchica in vitro (EMT), che riduce la loro capacità di formare uno strato endoteliale maturo e funzionale. I fattori scatenanti noti per EMT nelle cellule endoteliali corneali includono l’esposizione a determinati fattori di crescita e la perdita del contatto da cellula a cellula⁵. È quindi quasi inevitabile che le colture di cellule endoteliali corneali che sono enzimaticamente dissociate durante la sottocultura subiranno cambiamenti associati all’EMT. Qui, presentiamo un metodo di coltura cellulare per le cellule endoteliali corneali umane o ovine che è progettato per ridurre al minimo l’interruzione dei contatti cellulare-cellulare durante le fasi di isolamento, espansione e sottocultura, per ridurre il potenziale di EMT. Inoltre, dimostriamo come gli innesti di tessuto- ingegnerici che assomigliano a innesti di membrana/tessuto strome del composto da membrana/Descemet derivati dal donatore possono essere prodotti colti producendo strati cellulari coltivati su entrambi i lati di una membrana biomateriale in un dispositivo di montaggio su misura.

Protocol

Le cornee umane con il consenso del donatore per la ricerca sono state ottenute dalla Queensland Eye Bank e utilizzate con l’approvazione etica del Comitato Etico della Ricerca Umana del Metro South Hospital and Health Service (HREC/07/QPAH/048). Le cornee di pecora sono state ottenute da animali eutanasia presso l’Herston Medical Research Facility dell’Università del Queensland in base a un accordo di condivisione dei tessuti. 1. Preparazione degli strumenti di dissezione Sterilizz…

Representative Results

Il metodo per isolare ed espandere le cellule endoteliali corneali da cornee umane o pecore è riepilogato nella Figura 1 e Figura 2. La maggior parte delle espianti che derivano dalle cornee da 1 a 2 anni o donatori umani di età inferiore ai 30 anni si attaccano alle piastre di coltura dei tessuti rivestiti di fattore di attacco entro una settimana, tuttavia, non è insolito scoprire che fino a un terzo degli espianti non riescano ad attaccarsi entro questo pe…

Discussion

Una sfida tecnica significativa associata alla creazione e all’espansione delle cellule endoteliali corneali umane impedisce che si verifichino EMT nelle colture. EMT può essere attivato nelle cellule endoteliali corneali dalla perdita di contatto cellulare-cellulare, ma la maggior parte dei protocolli di coltura cellulare per queste cellule comporta la dissociazione enzimatica a singole cellule durante l’isolamento e la sottocultura¹⁰. Qui presentiamo un protocollo alternativo di coltura cellula…

Materials

Attachment factor	Gibco	S006100	A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C.
Bovine pituitary extract	Gibco	13028014	A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots.
Calcium chloride	Merck	C5670	Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise.
Centrifuge tube, 50 ml	Labtek	650.550.050
Chondroitin sulphate	LKT Laboratories	C2960	This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Dispase II	Gibco	17105-041	Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Ethanol	Labtek	EA043	100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces.
Foetal bovine serum	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.03	This is a HyClone brand of foetal bovine serum.
Coverglass No. 1, Ø 13 mm	Proscitech	G401-13	Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture.
HBSS	Gibco	14025-092	Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride.
L-ascorbic acid 2-phosphate	Merck	A8960	Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise.
Micro-Boyden chamber	CNC Components Pty. Ltd.	Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007	Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE).
O-ring for micro-Boyden chamber	Ludowici Sealing Solutions	RSB012	Composed of silicon rubber.
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1	Gibco	51985-034	A reduced serum medium containing glutamine.
DPBS	Gibco	14190-144	Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride.
Pen Strep	Gibco	15140-122	A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin.
Petri dish	Sarstedt	82.14473.001	Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections.
Tissue culture plate, 24 well	Corning Incorporated	Costar 3524	A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2.
Tissue culture plate, 6 well	Corning Incorporated	Costar 3516	A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2.
TrypLE Select	Gibco	12563-011	A 1X enzyme solution for dissociating cells.
Versene	Gibco	15040-066	A 1X EDTA solution for dissociating cells.
Watchmaker forceps	Labtek	BWMF4	Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas.