生体物質膜上におけるヒトおよび羊角膜内皮細胞層の増殖
Summary
このプロトコルは、ヒトまたは羊組織の外植植物から角膜内皮細胞培養を確立し、成長させるために必要な重要なステップを記述する。膜状生体材料上の角膜内皮細胞を下塗りする方法も提示されている。
Abstract
角膜内皮細胞培養は、細胞間接触の喪失後に上皮間葉転換(EMT)を受ける傾向がある。EMTは、成熟した機能的な層を形成する能力を低下させるので、細胞にとって有害である。ここでは、ヒトおよび羊角膜内皮細胞培養物を確立し、細胞間接触の損失を最小限に抑える方法を紹介する。角膜内皮/デセメットの膜の外植植物は、ドナー角膜から採取され、細胞が一括して培養表面に移動することを可能にする条件下で組織培養に入れられる。培養が確立されると、外植は新鮮なプレートに移され、新しい文化を開始します。ディスパーゼIIは、細胞の塊を組織培養プレートから緩やかに持ち上げて、サブカル化するために使用されます。このプロトコルを使用して確立された角膜内皮細胞培養は、生体材料膜への転移に適しており、動物試験での移植のための組織操作細胞層を生成する。組織培養中に生体材料膜を支持するためのカスタムメイドの装置が記載されており、コラーゲンI型膜の両側に角膜内皮細胞の層と角膜間質細胞の層からなる組織工学的移植片の例が提示される。
Introduction
角膜は目の前に位置する透明な組織です。それは3つの主要な層で構成されている:外面上皮層、中間間質層、および角膜内皮と呼ばれる内層。角膜内皮は、デセメットの膜と呼ばれる基底膜に座っている細胞の単層であり、基礎となる水性房からストロマに入る流体の量を調節することによって角膜の透明性を維持する。間質内の体液が多すぎると、角膜腫脹、不透明性、視力低下を引き起こす。したがって、内皮は視力を維持するために不可欠である。
角膜内皮は、老化、病気、怪我を含む多くの理由で機能不全になり、現在の治療は移植手術だけです。この手術の間に、内皮およびデセメットの膜は患者の角膜から取り出され、ドナー角膜から得られた内皮およびデセメットの膜の移植片に置き換えられる。多くの内皮移植片はまた、ホスト角膜1への取り扱いと付着を助けるために間質組織の薄い層を含む。
世界的に、移植手術のための角膜ドナー組織の需要は、眼球バンク2によって供給できる量よりも大きい。したがって、この不足を緩和するために使用できる組織工学的な角膜内皮移植を開発するドライブがありました3.この根拠は、現在、個々の角膜からの内皮は単一の患者にのみ移すことができるという事実に基づいているが、角膜内皮細胞が最初に組織培養中の生体材料足場で拡大および増殖した場合、複数の患者を治療するために使用することができる。
組織工学による角膜内皮移植が外科医にとって実現可能な選択肢になる前に取り組む必要がある主な課題は次のとおりです: (1) 高品質の角膜内皮細胞を拡大し、成熟したインビトロでの機能的角膜内皮細胞層、および(2)生体材料足場上の細胞を成長させる技術を確立し、現在使用されているドナー角膜由来移植片と同等またはより優れた組織工学的移植片を産生する。
角膜内皮細胞は、生体内での増殖ポテンシャルが非常に低いが、インビトロ4で分裂するように刺激することができる。それにもかかわらず、それらは、成熟した機能的な内皮層を形成する能力を低下させるインビトロ上皮間葉移行(EMT)を受ける強い傾向を有する。角膜内皮細胞におけるEMTの既知のトリガーには、細胞間接触の特定の成長因子および細胞間接触の喪失5への曝露が含まれる。したがって、サブカルチャー中に酵素的に解離された角膜内皮細胞培養物がEMTに関連する変化を受けることはほぼ避けられない。ここでは、分離、拡張およびサブ培養段階における細胞間接触の破壊を最小限に抑え、EMTの可能性を低減するように設計されたヒトまたは羊角膜内皮細胞の細胞培養方法を提示する。さらに、ドナー角膜由来内皮/デセメットの膜/間質組織移植片に似た組織工学的移植片を、生体材料膜の両側に培養した細胞層をカスタムメイドの実装装置で作り上げ、どのように作り出すことができるかを実証する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ヒト角膜内皮細胞の確立と拡大に関連する重要な技術的課題は、培養中にEMTが発生するのを妨げている。EMTは、細胞間接触の喪失によって角膜内皮細胞で引き起こされ得るが、しかし、これらの細胞に対するほとんどの細胞培養プロトコルは、単一細胞の単一細胞への酵素的解離を伴う。ここでは、分離およびサブ培養段階で細胞同士の接触を最小限に抑える角膜内皮細胞?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
図7の準備中に彼女の援助のためのノエミー・ガロリーニに感謝します。この研究は、オーストラリア国民保健医療研究評議会(プロジェクト補助金1099922)によってDHに授与されたプロジェクト補助金と、クイーンズランド眼研究所財団から受け取った補助資金によって支えられました。
Materials
| Attachment factor | Gibco | S006100 | A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C. |
| Bovine pituitary extract | Gibco | 13028014 | A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots. |
| Calcium chloride | Merck | C5670 | Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Centrifuge tube, 50 ml | Labtek | 650.550.050 | |
| Chondroitin sulphate | LKT Laboratories | C2960 | This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Ethanol | Labtek | EA043 | 100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces. |
| Foetal bovine serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.03 | This is a HyClone brand of foetal bovine serum. |
| Coverglass No. 1, Ø 13 mm | Proscitech | G401-13 | Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture. |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride. |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Merck | A8960 | Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Micro-Boyden chamber | CNC Components Pty. Ltd. | Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007 | Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE). |
| O-ring for micro-Boyden chamber | Ludowici Sealing Solutions | RSB012 | Composed of silicon rubber. |
| Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1 | Gibco | 51985-034 | A reduced serum medium containing glutamine. |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride. |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin. |
| Petri dish | Sarstedt | 82.14473.001 | Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections. |
| Tissue culture plate, 24 well | Corning Incorporated | Costar 3524 | A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2. |
| Tissue culture plate, 6 well | Corning Incorporated | Costar 3516 | A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2. |
| TrypLE Select | Gibco | 12563-011 | A 1X enzyme solution for dissociating cells. |
| Versene | Gibco | 15040-066 | A 1X EDTA solution for dissociating cells. |
| Watchmaker forceps | Labtek | BWMF4 | Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas. |
References
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