Summary
Denne protokollen beskriver de kritiske trinnene som kreves for å etablere og vokse hornhinne endotelcellekulturer fra explants av menneskelig eller sauvev. En metode for å subculturing hornhinne endotelceller på membranøse biomaterialer er også presentert.
Abstract
Hornhinnen endotelcellekulturer har en tendens til å gjennomgå epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) etter tap av celle-til-celle kontakt. EMT er skadelig for cellene da det reduserer deres evne til å danne et modent og funksjonelt lag. Her presenterer vi en metode for å etablere og subculturing menneskelige og sauehornhinne endotelcellekulturer som minimerer tap av celle-til-celle kontakt. Explants av hornhinne endotel / Descemets membran er tatt fra donor hornhinner og plassert i vevkultur under forhold som tillater cellene å kollektivt migrere på kulturoverflaten. Når en kultur er etablert, overføres eksplantene til ferske plater for å initiere nye kulturer. Ulike II brukes til å forsiktig løfte klumper av celler av vevkulturplater for å subculturing. Hornhinnen endotelcellekulturer som er etablert ved hjelp av denne protokollen, er egnet for overføring til biomaterialmembraner for å produsere vevskonstruerte cellelag for transplantasjon i dyreforsøk. En skreddersydd enhet for å støtte biomaterialmembraner under vevskultur er beskrevet, og et eksempel på et vevskonstruert pode bestående av et lag av hornhinneendotelceller og et lag med hornhinnestrofeceller på hver side av en kollagentype I membran presenteres.
Introduction
Hornhinnen er et gjennomsiktig vev som ligger foran øyet. Den består av tre store lag: et epitellag på den ytre overflaten, et mellomstromalag og et indre lag kalt hornhinnen endotelet. Hornhinnen endotel er et monolayer av celler som sitter på en kjellermembran kalt Descemets membran, og det opprettholder gjennomsiktigheten av hornhinnen ved å regulere mengden væske som kommer inn i stroma fra den underliggende vandighumor. For mye væske i stroma forårsaker hornhinne hevelse, tetthet og synstap. Endotelet er derfor avgjørende for å opprettholde synet.
Hornhinnen endotel kan bli dysfunksjonelle av flere grunner, inkludert aldring, sykdom og skade, og den eneste nåværende behandlingen er transplantasjon kirurgi. Under denne operasjonen fjernes endotelet og Descemets membran fra pasientens hornhinnen og erstattes med et transplantat av endotel og Descemets membran hentet fra en donor hornhinne. Mange endotelgrafter inneholder også et tynt lag av stromal vev for å hjelpe håndtering og vedlegg til verten hornhinnen1.
Over hele verden er etterspørselen etter hornhinnedonorvev for transplantasjonsoperasjoner større enn mengden som kan leveres av øyebanker2. Det har derfor vært en drivkraft for å utvikle vevskonstruerte hornhinneendoteltransplantasjoner som kan brukes til å lindre denne mangelen3. Begrunnelsen for dette er basert på det faktum at for tiden kan endotel fra en individuell hornhinne bare overføres til en enkelt pasient, men hvis hornhinnen endotelceller først ble utvidet og dyrket på biomaterialstillas i vevskultur, kan de brukes til å behandle flere pasienter.
Store utfordringer som må løses før vevskonstruerte hornhinneendoteltransplantasjoner blir et mulig alternativ for kirurger inkluderer: (1) å etablere teknikker for å utvide hornhinnen endotelceller av høy kvalitet og for å produsere modne og funksjonell hornhinne endotelcellelag in vitro, og (2) etablere teknikker for å dyrke cellene på biomaterialstillas for å produsere vevskonstruerte grafts som er lik, eller bedre enn, donor hornhinnen-avledet grafts som er i dag brukt.
Hornhinnen endotelceller har et svært lavt proliferativt potensial in vivo, men kan stimuleres til å dele in vitro4. Likevel har de en sterk tendens til å gjennomgå in vitro epitel-til-mesenchymal overgang (EMT), noe som reduserer deres evne til å danne et modent, funksjonelt endotellag. Kjente utløsere for EMT i hornhinne endotelceller inkluderer eksponering for visse vekstfaktorer og tap av celle-til-celle kontakt5. Det er derfor nesten uunngåelig at hornhinnen endotelcellekulturer som er enzymatically dissosiert under subkultur vil gjennomgå endringer forbundet med EMT. Her presenterer vi en cellekulturmetode for menneskelige eller sauehornhinneendotelceller som er utformet for å minimere forstyrrelse av celle-til-celle-kontakter under isolasjon, ekspansjon og subkulturstadier, for å redusere potensialet for EMT. Videre viser vi hvordan vevskonstruerte grafts som ligner donor hornhinne-avledet endotel / Descemets membran / stromal vev grafts kan produseres ved å dyrke kultiverte cellelag på begge sider av en biomaterialmembran i en skreddersydd monteringsenhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humane corneas med donor samtykke for forskning ble innhentet fra Queensland Eye Bank og brukt med etikk godkjenning fra Metro South Hospital and Health Service Human Research Ethics Committee (HREC/07/QPAH/048). Sauer hornhinner ble hentet fra euthanized dyr ved Herston Medical Research Facility ved University of Queensland under en vev deling avtale.
1. Utarbeidelse av disseksjonsverktøy
- Steriliser to par nummer 4 urmaker tang ved enten soaking dem i en løsning på 70% etanol i 5 min eller ved autoklaving dem.
2. Utarbeidelse av kulturmedium- og vevskulturplater
- Forbered 100 ml kulturmedium som inneholder Opti-MEM 1 (1x) + GlutaMAX-1, 5 % fosterstorfeserum og 100 U/ml penn/strep. Dette kulturmediet er tilstrekkelig for sauehornhinne endotelcellekulturer, men for humant hornhinneendotelcellekulturer bør mediet suppleres med 50 μg/ml storfe hypofysen ekstrakt, 0,08% chondroitin sulfat, 200 μg / ml kalsiumklorid og 0,3 m L-askorbinsyre 2-fosfat. Kulturmedium kan lagres i mørket ved 4 °C i to uker.
- Coat brønnene til en 6-brønnvevkulturplate med vedleggsfaktor ved hjelp av produsentens instruksjoner, og legg deretter til 1 ml kulturmedium til hver belagt brønn. Forbered en brønn for hver hornhinnen.
3. Explant disseksjon og cellekultur prosedyre
- Plasser hornhinnen, endotelside opp, i en steril Petri-tallerken på scenen til et dissekeringsmikroskop. Juster belysningen slik at hornhinnen overflaten er godt opplyst med tilstrekkelig kontrast for å markere endotellaget. Juster zoomen slik at kanten og noen sentrale hornhinneendotel er i sikte.
- Bruk steriliserte urmakertang for å forsiktig løfte og rive Descemets membran bort fra den underliggende stroma (Figur 1). Membranen vil løsne fra stroma som en stripe som umiddelbart krøller seg opp. Plasser stripen i en brønn av en 6-brønns vevskulturplate som er belagt med vedleggsfaktor og inneholder 1 ml kulturmedium. Lokket på vevskulturplaten bør holdes på til enhver tid, unntatt når explants blir lagt til det, for å redusere risikoen for forurensning.
- Fjern strimler av Descemets membran fra den ekstreme periferien av endotelet først og deretter fra sentrale regioner senere. Legg alle strimler fra en hornhinne i en enkelt brønn innenfor 6-brønnsplaten.
- Inkuber eksplantene i en fuktet cellekulturinkubator satt til 5% CO2 og 37 °C. La kulturen være uforstyrret i 2 dager for å la eksplantene bosette seg og feste seg til plateoverflaten. Vanligvis klarer opptil en tredjedel av explants ikke å feste til platen.
- Fjern mediet og eventuelle utilknyttede explants fra kulturen etter 4 dager og legg forsiktig til 2 ml frisk kulturmedium, pass på at du ikke forstyrrer de vedlagte eksplantene. Kulturmedium bør endres to ganger i uken.
4. Kontinuerlig produksjon av hornhinne endotelceller ved serieeksplantkultur
MERK: Explants kan overføres til friske vevkulturplater etter 10 dager for å etablere ytterligere hornhinneendotelcellekulturer.
- Plasser eksplantkulturen på scenen av et dissekeringsmikroskop og juster belysningen og zoom slik at eksplantene er synlige.
- Ved hjelp av steriliserte urmaker tang, plukk forsiktig hver explant fra sin kulturplate og overfør den til en frisk brønn av en 6-brønns vevkulturplate som har blitt belagt med vedleggsfaktor og inneholder 1 ml kulturmedium.
- La eksplantene bosette seg på overflaten av sin nye plate i 4 dager før de erstatter kulturmediet med 2 ml friskt kulturmedium. Endre kulturmedium endret seg to ganger i uken.
5. Voksende hornhinneendotelceller på glasstrekkslepper for immunofluorescensanalyser
MERK: Cellekulturer som skal analyseres ved hjelp av immunfluorescens, bør etableres på glassforsidelepper som kan monteres på glassmikroskoplysbilder etter fargeprosedyren.
- Steriliser en pakke med runde glasstrekkslepper på 13 mm diameter i en autoklav eller ved å bløte i 70 % etanol i 15 min etterfulgt av tre skyll i fosfatbufret saltvann (PBS).
- Plasser individuelle coverslips i brønnene til en 24-brønns vevskulturplate, belegge dem med vedleggsfaktor, og legg deretter til 0,5 ml kulturmedium til hver brønn.
- Ved hjelp av steriliserte urmaker tang fjerne explants fra sine vev kultur plater og overføre dem til brønner som inneholder coverslips. La eksplantene bosette seg på dekkslips i 4 dager før du endrer mediet.
- Etter den nødvendige inkubasjonsperioden, fiks og beis dekk til dekkslipkulturene i sine kulturbrønner. Monter de fargede dekkslipsene på glassmikroskoplysbilder for analyse under et fluorescensmikroskop.
6. Subkultur av hornhinne endotelceller ved hjelp av Dispase II
MERK: Store fibroblastiske celler kan selektivt fjernes fra explant kulturer i 6-brønnplater før du underculturing ved hjelp av denne prosedyren. Hvis alle celler skal subkulturisere, må du ikke utføre trinn 6.2 til 6.4. Målet med denne prosedyren er å overføre cellene til friske plater samtidig som de opprettholder sine celle-til-celle-kontakter så mye som mulig. Cellene skal håndteres forsiktig. Fullstendig konfluent brønner bør passeres i et forhold på 1:2, mens underkonfluent brønner bør passeres i forholdet 1:1 eller mindre.
- Fjern mediet fra kulturen og skyll kort med DPBS.
- Legg til 1 ml Versene. Inkuber ved romtemperatur i 30 s.
- Fjern Versene og legg til 1 ml TrypLE. Inkuber ved 37 °C i vevskulturinkubatoren i 3 min.
- Vær oppmerksom på kulturen ved hjelp av et fasekontrastmikroskop. Trykk forsiktig på kulturen for å løsne celler fra platen. Så snart de store fibroblastcellene har løsnet fra platen, fjerner de og TrypLE ved hjelp av en 1 ml pipette. Vask gjenværende TrypLE av de resterende cellene ved å skylle to ganger med 2 ml DPBS.
- Tilsett 1 ml 1 mg/ml Dispase II til kulturen og inkubatoriet i vevskulturinkubatoren i 1 til 2 timer eller til alle celler har løsnet fra platen. Cellene skal gradvis flyte bort fra platen i klumper.
- Samle cellene ved hjelp av en 1 ml pipette og overfør til 20 ml DPBS i et 50 ml sentrifugerør. Sentrifuge i 5 min ved 300 x g ved romtemperatur.
- Fjern supernatanten og resuspender cellepellet forsiktig ved tredning med en 1 ml pipette i 1 ml kulturmedium. Overfør cellesuspensjonen til enten en eller to brønner av en 6-brønnsplate, til passasje med et forhold på henholdsvis 1:1 eller 1:2.
- Fyll opp mediet i hver brønn for å lage 2 ml og plassere kulturene i vevkulturinkubatoren. Skift ut mediet med 2 ml friskt medium to ganger i uken.
7. Vekst av hornhinnen endotelcellelag på biomaterialmembraner
MERK: Følgende prosedyre beskriver trinnene som er involvert i montering av et membranøs biomateriale i en skreddersydd monteringsenhet – kalt et mikro-Boyden-kammer – for cellekultur. Se vår nylige publikasjon6 for mer informasjon om enheten og for å kjøpe detaljer.
- Monter det øvre kammeret i mikro-Boyden kammeret ved å plassere en rød O-ring i midten.
- Bruk en trefien på 18 mm diameter til å slå ut en plate fra et biomaterialeark på et polytetrafluoretylen (PTFE) skjærebrett. Plasser denne platen over den røde O-ringen i mikro-Boyden kammerets øvre kammer.
- Skru det nedre kammeret på det øvre kammeret, og fest biomaterialskiven i mellom.
- Bløtlegg det monterte mikro-Boyden kammeret i 70% etanol i 1 t for å sterilisere den.
- Dypp det monterte mikroboydenkammeret helt i steril hbss i 10 min for å fjerne etanol. Gjenta dette vasketrinnet to ganger. Utfør et siste vasketrinn i 10 min i usuppleret kulturmedium.
- Overfør det steriliserte mikro-Boyden kammeret til kulturmedium i brønnen av en 6-brønnplate som sikrer at det øvre kammeret er øverst. Juster nivået av kulturmedium slik at den kontakter den nedre overflaten av biomaterialmembranen, men strømmer ikke inn i det øvre kammeret.
- Forbered en suspensjon av hornhinneendotelceller ved hjelp av prosedyren som er beskrevet i avsnitt 6. Tilstrekkelig celletetthet i suspensjonen bør oppnås for å tillate en frøtetthet på minst 100.000 celler per cm2 på membranen i mikro-Boyden kammeret. Kulturarealet i mikro-Boyden kammeret er 0,5 cm2 og det kan holde et volum på 100 μL. Derfor bør en suspensjon som inneholder 500.000 celler/ ml utarbeides.
- Pipette 100 μL cellesuspensjon (50 000 celler) på membranen i mikro-Boyden-kammeret. Inkuber i vevskulturinkubatoren i 4 timer før du fyller opp mediet for å fullstendig senke kammeret. Inkuber kulturen for den nødvendige tidsperioden, og erstatter mediet to ganger i uken.
MERK: Når hornhinnen endotelceller har festet til den øvre overflaten av biomaterialmembranen, kan mikro-Boyden-kammeret vendes over i kulturbrønnen slik at det nedre kammeret er øverst. Flere celler kan deretter legges til kammeret for å initiere cellekulturer på den andre overflaten av membranen. For eksempel kan hornhinnestromalceller lett påføres den alternative overflaten og dermed etterligne den relative plasseringen av hornhinnecelletyper som vist i bakre hornhinnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden for å isolere og utvide hornhinnen endotelceller fra humane eller sauehornhinner er oppsummert i figur 1 og figur 2. De fleste explants som er avledet fra hornhinnene av 1 til 2 år gamle sauer eller menneskelige donorer på mindre enn 30 år vil feste seg til Vedlegg Faktor-belagt vev kultur plater innen en uke, men det er ikke uvanlig å finne at opptil en tredjedel av explants ikke klarer å feste innen denne tiden. Disse "flytende" eksplantene kan fjernes fra kulturene. Explants fra menneskelige donorer eldre enn 30 år er mindre sannsynlig å feste til platen og også mindre sannsynlig å produsere cellekulturer. Representative bilder av hornhinnen endotelcellekulturer generert fra sauer og menneskelige eksplanter er vist i figur 3 og figur 4. Cellene som kommer ut av eksplantene forblir vanligvis i kontakt med hverandre når de migrerer ut på platen. Denne typen migrasjon er kjent som kollektiv cellemigrasjon, og det er en funksjon av epitelceller7. Ved 2 uker med kultur, patcher av små, tettpakket celler vil ha dannet umiddelbart ved siden av mange av explants fra både sauer og menneskelige hornhinner8. Disse patchene av celler viser ikke morfologiske egenskaper av EMT og ekspanderer sakte over tid. Større celler med mer uregelmessige, fibroblastiske former finnes utenfor disse patchene. Når kulturene er etablert, kan eksplantene fjernes ved hjelp av tang og plasseres i ferske plater for å etablere nye kulturer.
Små, tettpakkede celler i hornhinnen endotelcellekulturer er svært motstandsdyktige mot fordøyelsen med TrypLE, mens de større fibroblastcellene er mer følsomme for det. Denne forskjellen i TrypLE-resistens kan utnyttes til selektivt å fjerne store celler fra kulturene før de overfører de mindre cellene til nye plater. Representative bilder av menneskelige hornhinne endotelcellekulturer gjennom hele subculturing prosessen ved hjelp av TrypLE og Dispase II er vist i figur 4.
Immunofluorescensanalyser kan utføres på hornhinnen endotelcellekulturer for å finne spesifikke proteiner i cellene. Et eksempel på dette presenteres i figur 5. Explants fra sauer og menneskelige hornhinner ble plassert på Vedlegg Factor-belagt glass coverslips i 24-brønnplater og kultivert i 4 uker. Eksplantene ble fjernet, og deretter ble kulturene analysert ved hjelp av immunofluorescens for tilstedeværelse av ZO-1, et stramt koblingsprotein og N-kadherin, et tilhengerkryssprotein, i henhold til vår publiserte protokoll9. De samme anti-ZO-1 og anti-N-kadherin antistoffer ble brukt for både sauer og menneskelige celler, og resultatene viste at begge proteiner ble oppdaget i plasmamembraner av celler fra begge artene. ZO-1 er normalt til stede som et distinkt bånd ved cellegrensen, men blir svak eller fraværende i celler som gjennomgår EMT. Derfor indikerte det robuste ZO-1-uttrykket i disse kulturene at cellene ikke hadde gjennomgått EMT.
Våre skreddersydde mikro-Boyden kamre er designet for å suspendere en biomaterialmembran i brønnen av en 6-brønnvevkulturplate(Figur 6). Prosedyren for montering av en biomaterialmembran i et mikro-Boyden kammer er vist i figur 7. Utformingen av mikro-Boyden kammeret gjør at begge sider av membranen suspendert i den skal brukes som cellekultur overflater samtidig. For å demonstrere dette ble sauestromalceller avledet fra hornhinnestromalvev sådd med en tetthet på 100.000 celler / cm2 på den ene siden av en kollagen type I membran og deretter 24 t senere kammeret ble snudd og sauhornhinne endotelceller ble seeded på den andre siden av membranen på en tetthet på 400.000 celler / cm2. De vevskonstruerte cellelagene ble dyrket i 4 uker, deretter festet med 10% nøytral bufret formalin og farget ved hjelp av rhodamin phalloidin og Hoechst kjernefysisk ekle 33342. De ble deretter undersøkt og fotografert ved hjelp av et konfokalmikroskop (Figur 8). En tverrsnittsvisning av vevskonstruert cellekonstruksjon avslørte et enkelt lag av hornhinneendotelceller på den ene overflaten av kollagenmembranen og en flerlags kultur av hornhinnestromale celler på den andre overflaten.
Figur 1: Teknikk for å skaffe planter av endotel/Descemets membran fra friske hornhinner. (A) Hornhinnen er plassert endotel-side opp i en Petriskål under et disseksjonsmikroskop. (B) Nærbilde av området som er angitt av et rødt rektangel i (A). Urmaker tang brukes til å forsiktig skrelle bort Descemets membran fra den underliggende stroma. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Prosedyre for å etablere og utvide kulturer av hornhinne endotelceller fra endotel / Descemets membranplanter. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representative fasekontrastbilder av endotelcellekulturer under innledende etablering fra planter av sauehornhinneendotel/Descemets membran. (A) En sauehornhinne endotel / Descemets membran explant etter 3 dager i kultur. Hornhinnen endotelceller har begynt å migrere på platen. (B) En sau explant kultur etter 1 uke. Eksplanten er omgitt av et konfluent ark med celler. (C) En sau explant kultur etter 2 uker. Små celler omgir explant mens større celler ligger lenger unna. (D) En sau explant kultur etter 6 uker. En region med små, tettpakkede celler ses ved siden av en region med større celler. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Isolering av små, tettpakkede humane hornhinneendotelceller for subkulturer. (A) En menneskelig hornhinne endotel / Descemets membran explant kultur etter 7 uker. Mange små, tettpakkede celler er til stede ved siden av explant. (B) Regioner av små, tettpakkede celler utvikler seg i menneskelige explant kulturer på samme måte som observert i sauer explant kulturer. (C) En menneskelig explant kultur etter fjerning av explant og etter 20 min eksponering for TrypLE. Små, tettpakkede celler har beholdt vedlegget til platen mens de større cellene har fløt bort. (D) En menneskelig hornhinne endotelcellekultur etter 1 t i Dispase II. De fleste celler har løsnet fra platen som frittflytende klumper. (E) En menneskelig hornhinne endotelcelle subkultur etter 1 dag. Celler har migrert utover fra celleklumper som ble isolert fra den opprinnelige explant kulturen. (F) En menneskelig hornhinne endotelcellesubkultur etter 12 dager. Cellene har dannet en confluent monolayer. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Lokalisering av ZO-1- og N-kadherinproteiner i sauens membraner og humane hornhinneendotelceller ved dual-labelling immunofluorescence. Sauer og menneskelig hornhinne endotel / Descemets membran explant kulturer ble etablert på Vedlegg Factor-belagt glass coverslips og analysert etter 4 uker. Både ZO-1 (grønn flekk) og N-kadherin (rød flekk) ble påvist i sauens membraner (A og B) og human (D og E) endothelial celler. Analyse av de sammenslåtte bildene viste at de to proteinene var svært samlokalisert i kulturene (C og F). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Diagram over et mikro-Boyden kammer vist i tverrsnitt. Vårt spesiallagde mikro-Boyden kammer består av et øvre kammer, et lavere kammer og en O-ring. Den kan brukes til å suspendere alle typer membranøs materiale i en vevskultur brønn. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Prosedyren for montering av en biomaterialmembran i et mikro-Boyden kammer for vevskultur. (A) Utstyret som kreves for denne prosedyren inkluderer et polytetrafluoretylenskjærebrett, et par tang, en trephine på 18 mm i diameter, et skreddersydd mikro-Boyden kammer og en biomaterialmembran. (B) Bruk trephine til å slå ut en plate fra biomaterialmembranen. (C) Plasser O-ringen i det øvre kammeret på monteringsenheten, og legg deretter den biomaterialskiven over den. (D) Skru det nedre kammeret på det øvre kammeret på monteringsenheten. (E) Det monterte mikro-Boyden kammeret er klar til å steriliseres med 70% etanol. (F) Fordyp det steriliserte mikroboydenkammeret i vevskulturmedium i brønnen av en 6-brønns vevskulturplate. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 8: Sauehornhinne endotelceller og stromale celler på motsatte sider av en kollagentype I membran. Cellene ble farget med phalloidin rhodamin for å visualisere actin (rød) og Hoechst for å visualisere kjerner (blå). Kollagentype I membranen var ikke farget og er derfor ikke synlig i disse bildene som ble samlet inn ved hjelp av konfokal mikroskopi. (A) En lav forstørrelse, tverrsnittvisning av vevskonstruert konstruksjon. Et tynt lag av actin som representerer en hornhinne endotelcellekultur er synlig på membranens øvre overflate, og et tykkere lag av actin som representerer en stromal cellekultur er tilstede på membranens nedre overflate. Blå kjerner vises ikke i dette bildet. (B) En ansiktsvisning av hornhinnen endotelcellelag som viser både actin og kjerneflekker. (C) En ansiktsvisning av hornhinnen stromal cellelag som viser både actin og kjerneflekker. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En betydelig teknisk utfordring knyttet til å etablere og utvide menneskelige hornhinneendotelceller hindrer EMT i å foregå i kulturene. EMT kan utløses i hornhinne endotelceller ved tap av celle-til-celle-kontakt, men de fleste cellekulturprotokoller for disse cellene involverer enzymatisk dissosiasjon til enkeltceller under isolasjon og subkultur10. Her presenterer vi en alternativ cellekulturprotokoll for hornhinneendotelceller som minimerer risikoen for at celler mister kontakt med hverandre under isolasjons- og subkulturstadiene.
Vår metode for å etablere hornhinne endotelcellekulturer innebærer å plassere planter av endotel/ Descemets membran fra donorhornhinner i vevskulturplater under forhold som tillater cellene å kollektivt migrere ut fra membranene og på platene. For at dette skal lykkes, må eksplanten danne et tett vedlegg til vevskulturplaten, og dette oppnås best ved å ikke forstyrre platen i flere dager etter at kulturene er satt opp. En annen kritisk faktor i vellykket etablering av hornhinne endotelcellekulturer fra mennesker er donorens alder. Høyere suksessrater har en tendens til å oppnås fra givere yngre enn 30 år.
En ulempe med å bruke explant kulturmetoden for å etablere hornhinne endotelcellekulturer er den relativt lange perioden som eksisterer mellom å sette opp kulturer og få et stort antall celler. Såkalte "peel-and-digest" metoder innebærer stripping av endotelet fra donor hornhinner og fordøye det med enzymer for å frigjøre cellene for kultur11. Disse typer metoder ville produsere kulturer som inneholder flere celler i utgangspunktet enn de som er etablert fra explants.
Vår explant kultur metode for hornhinne endotelceller produserer kulturer som inneholder svært små, kompakte, modne celler av høy kvalitet. Imidlertid inneholder kulturene også større, mindre ideelle celler mot periferien av platen. De større cellene kan fjernes ved fordøyelsen med TrypLE og kasseres om ønskelig, men dette reduserer antall celler som er tilgjengelige for subkultur. Imidlertid er explants som har startet primære cellekulturer nesten alltid i stand til å initiere ytterligere cellekulturer, og denne evnen kan utnyttes for å oppnå et stort antall celler av høy kvalitet.
Vår subkulturmetode for hornhinneendotelceller innebærer å bruke Dispase II til å forsiktig løfte celleklumper bort fra vevskulturplaten for overføring til ferske plater, og selv om denne metoden er utformet for å minimere muligheten for EMT som forekommer i passasjer celler, bør det bemerkes at det ikke reduserer risikoen til null.
Det har vært målet for mange grupper å utvikle vevskonstruerte hornhinneendotelcellelag for transplantasjonsformål. Mange forskjellige materialer har blitt prøvd som bærere for cellene og en rekke forskjellige metoder har blitt brukt til å begrense materialet fra å bevege seg rundt i kulturplaten under cellekultur. De fleste metoder innebærer å forankre materialet til overflaten av vevskulturplaten på en eller annen måte, og begrense celleveksten til bare membranens øvre overflate. Mens disse metodene kan brukes til å produsere enkeltlag av vev-konstruert hornhinne endotel som ville være ekvivalent med endotel / Descemets membran grafts (DMEK grafts), de kunne ikke brukes til å produsere vev-konstruertekvivalenter av endotelet / Descemets membran / stroma grafts (DSEK eller DSAEK grafts) som oftest brukes av kirurger i dag. Vi har derfor utviklet en membranmonteringsenhet kalt et mikro-Boyden kammer som gjør at celler kan dyrkes samtidig på begge overflater av en suspendert biomaterialmembran, og har brukt den til å produsere vevskonstruerte grafts bestående av hornhinne endotelceller og hornhinne stromal celler på motsatte overflater av kollagen type I membraner. Disse tolags vevskonstruerte transplantatene kan potensielt brukes til å erstatte donor hornhinnen-avledede grafts av endotel og stromal vev på hver side av Descemets membran (DSEK eller DSAEK grafts).
Oppsummert er metodene som presenteres i denne artikkelen utformet for de som ønsker å oppnå primære hornhinneendotelceller av høy kvalitet for bruk i vevstekniske studier. Milde kulturmetoder er beskrevet som er utformet for å redusere risikoen for cellene som gjennomgår EMT og en metode for å dyrke cellene på suspenderte biomaterialmembraner presenteres. Vi håper at disse metodene kan hjelpe andre mot deres mål om å produsere vevskonstruerte hornhinneendoteltransplantasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Takk til Noémie Gallorini for hennes hjelp under utarbeidelsen av Figur 7. Dette arbeidet ble støttet av et prosjekttilskudd tildelt DH av National Health and Medical Research Council of Australia (Project Grant 1099922), og ved supplerende finansiering mottatt fra Queensland Eye Institute Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Attachment factor | Gibco | S006100 | A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C. |
| Bovine pituitary extract | Gibco | 13028014 | A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots. |
| Calcium chloride | Merck | C5670 | Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Centrifuge tube, 50 ml | Labtek | 650.550.050 | |
| Chondroitin sulphate | LKT Laboratories | C2960 | This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Ethanol | Labtek | EA043 | 100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces. |
| Foetal bovine serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.03 | This is a HyClone brand of foetal bovine serum. |
| Coverglass No. 1, Ø 13 mm | Proscitech | G401-13 | Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture. |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride. |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Merck | A8960 | Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Micro-Boyden chamber | CNC Components Pty. Ltd. | Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007 | Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE). |
| O-ring for micro-Boyden chamber | Ludowici Sealing Solutions | RSB012 | Composed of silicon rubber. |
| Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1 | Gibco | 51985-034 | A reduced serum medium containing glutamine. |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride. |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin. |
| Petri dish | Sarstedt | 82.14473.001 | Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections. |
| Tissue culture plate, 24 well | Corning Incorporated | Costar 3524 | A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2. |
| Tissue culture plate, 6 well | Corning Incorporated | Costar 3516 | A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2. |
| TrypLE Select | Gibco | 12563-011 | A 1X enzyme solution for dissociating cells. |
| Versene | Gibco | 15040-066 | A 1X EDTA solution for dissociating cells. |
| Watchmaker forceps | Labtek | BWMF4 | Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas. |
References
- Güell, J. L., El Husseiny, M. A., Manero, F., Gris, O., Elies, D. Historical Review and Update of Surgical Treatment for Corneal Endothelial Diseases. Ophthalmology and Therapy. 3, 1-15 (2014).
- Tan, D. T. H., Dart, J. K. G., Holland, E. J., Kinoshita, S. Corneal transplantation. The Lancet. 379 (9827), 1749-1761 (2012).
- Soh, Y. Q., Peh, G. S. L., Mehta, J. S. Translational issues for human corneal endothelial tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regnerative Medicine. 11 (9), 2425-2442 (2017).
- Senoo, T., Joyce, N. C. Cell Cycle Kinetics in Corneal Endothelium from Old and Young Donors. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 41 (3), 660-667 (2000).
- Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Thériault, M., Proulx, S. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 56, 1228-1237 (2015).
- Harkin, D. G., et al. Mounting of Biomaterials for Use in Ophthalmic Cell Therapies. Cell Transplantation. 26 (11), 1717-1732 (2017).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).
- Walshe, J., Harkin, D. G. Serial explant culture provides novel insights into the potential location and phenotype of corneal endothelial progenitor cells. Experimental Eye Research. 127, 9-13 (2014).
- Al Abdulsalam, N. K., Barnett, N. L., Harkin, D. G., Walshe, J. Cultivation of corneal endothelial cells from sheep. Experimental Eye Research. 173, 24-31 (2018).
- Parekh, M., Ferrari, S., Sheridan, C., Kaye, S., Ahmad, S. Concise Review: An Update on the Culture of Human Corneal Endothelial Cells for Transplantation. Stem Cells Translational Medicine. 5 (2), 258-264 (2016).
- Peh, G. S., Toh, K. P., Wu, F. Y., Tan, D. T., Mehta, J. S. Cultivation of human corneal endothelial cells isolated from paired donor corneas. PLoS One. 6 (12), 28310 (2011).
