Summary
Dit protocol presenteert een robuust, reproduceerbaar model van vascularized composiet allotransplant (VCA) gericht op gelijktijdige studie van immunologie en functioneel herstel. De tijd geïnvesteerd in zorgvuldige techniek in een rechter mid-dij achterpoot orthotopische transplantatie met de hand genaaid vasculaire anastomoses en neurale coaptatie levert de mogelijkheid om functioneel herstel te bestuderen.
Abstract
Limb in het bijzonder en gevasculariseerde composiet allotransplant (VCA) in het algemeen hebben brede therapeutische belofte die zijn gedwarsboomd door de huidige beperkingen in immunosuppressie en functioneel neuromotorisch herstel. Veel diermodellen zijn ontwikkeld voor het bestuderen van unieke kenmerken van VCA, maar hier presenteren we een robuust reproduceerbaar model van orthotopische achterpoottransplantatie bij ratten die zijn ontworpen om tegelijkertijd beide aspecten van de huidige VCA-beperking te onderzoeken: immunosuppressiestrategieën en functioneel neuromotorisch herstel. In de kern van het model rust een inzet voor nauwgezette, beproefde microchirurgische technieken zoals met de hand genaaid vasculaire anastomoses en de hand genaaid neurale coaptatie van de femorale zenuw en de heupzenuw. Deze aanpak levert duurzame ledemaat reconstructies die het mogelijk maken voor langer levende dieren in staat van revalidatie, hervatting van de dagelijkse activiteiten, en functionele testen. Met de behandeling op korte termijn van conventionele immunosuppressieve middelen overleefden allotransplanted dieren tot 70 dagen na de transplantatie, en isotransplanted dieren bieden langdurige controles na 200 dagen na de operatie. Bewijs van neurologisch functioneel herstel is aanwezig met 30 dagen post operatief. Dit model biedt niet alleen een nuttig platform voor het ondervragen van immunologische vragen die uniek zijn voor VCA en zenuwregeneratie, maar maakt het ook mogelijk om in vivo nieuwe therapeutische strategieën te testen die specifiek zijn afgestemd op VCA.
Introduction
Ledemaattransplantatie onder de bredere categorie van vascularized-composiet allotransplant (VCA) of composiet weefsel allotransplant (CTA) heeft nog niet voldoen aan haar therapeutische belofte. Sinds de eerste succesvolle menselijke handtransplantaties in Lyon, Frankrijk en Louisville, Kentucky in 1998 en 1999, zijn meer dan 100 bovenste extremiteitstransplantaties wereldwijd uitgevoerd bij zorgvuldig geselecteerde patiënten1. Bredere toepasbaarheid is gestwarsboomd door aanzienlijke immunosuppressie en beperkt functioneel neuromotorisch herstel. De huidige immunosuppressiestrategieën resulteren in 85% incidentie van acute afstoting in het gezicht van 77% incidentie van opportunistische infectie2. Aan de andere kant vindt functioneel herstel na handtransplantatie plaats; gemiddelde Handicap van Arm Schouder en Hand (DASH) scores verbeteren van 71 tot 43, maar dat niveau van de functie kan nog steeds in aanmerking komen als een handicap2. Gezien de niet-levensreddende aard van ledemaattransplantatie, moeten de huidige technieken worden verfijnd in diermodellen om de volgende stap in VCA te zetten.
Sinds het eerste rattenmodel van ledemaattransplantatie in 19783zijn veel innovatieve diermodellen ontwikkeld om het veld van VCA4te bevorderen, met vasculaire geboeide anastomoses om de operatieve tijd5,6,heterotopische osteo te minimaliserenmyocutane transplantaties om fysiologische beledigingen aan het ontvangende dier te minimaliseren7,8,9,10,11, en nieuwe immunologische benaderingen7,12,13,14. Het hier gepresenteerde rattenmodel van orthotopische rechter achterpoot transplantatie benadrukt nauwgezette, beproefde microchirurgische technieken zoals met de hand genaaide vasculaire anastozos en neurale coaptatie als een investering vooraf in een robuust, reproduceerbaar modelplatform om tegelijkertijd beide aspecten van de huidige VCA te onderzoeken: immunosuppressiestrategieën en functioneel neuromotorisch herstel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health (NIH) en werden goedgekeurd door de Northwestern University Animal Care and Use Committee. De specifieke procedures werden uitgevoerd volgens protocol IS00001663.
OPMERKING: Twee stammen van ratten werden gebruikt, Lewis ratten en Augustus Kopenhagen x Ierse (ACI) ratten. De dieren werden verdeeld in drie behandelingsgroepen: allotransplant zonder immune suppression (ACI aan Lewis), allotransplant met conventionele immune suppressie (ACI aan Lewis), en isotransplant (Lewis aan Lewis of ACI aan ACI). Lewis is een inteelt stam, terwijl ACI ratten vertegenwoordigen een out-gefokte wild-type, daarom werd deze combinatie gekozen om de slechtere-case afwijzing reactie model. Conventionele immunosuppressie werd onderhuids toegediend als rapamycine 1 mg/kg vanaf postoperatieve dag (POD) min 1 tot POD 28 of als FK506 3 mg/kg van POD 0 tot POD 14, en daarna eenmaal per week. Zowel mannelijke als vrouwelijke ratten waren in aanmerking komende ontvangers van 8 tot 16 weken oud, met een gewicht tussen 250 en 400 gram op het moment van de operatie.
1. Oogst van rechter achterpoten van donoren
- Induceer algemene anesthesie met 5% isofluraan in zuivere zuurstof via een vaporizer met een geschikt opruimsysteem.
- Bevestig voldoende diepte van anesthesie met teensnuifje, en gebruik dan haarknippers om de vacht af te snijden van de rechter achterpoot en rechterlies chirurgische site
- Down-titrate de isoflurane via een knaagdier neus kegel tot 2-2,5%.
- Plaats de rat supine met uitgespreide ledematen afgeplakt aan de zijkanten op een bedieningspaneel met een verwarmingskussen eronder. Desinfecteer de haarloze huid met 70% alcohol en bescherm het chirurgische veld met steriel gaas.
- Met behulp van een geschikte microchirurgische microscoop, microchirurgische instrumenten, en met gemakkelijke toegang tot bipolaire en monopolaire elektrocauterie, beginnen de dissectie.
- Gebruik een schaar om een omtrekhuid /onderhuidse weefselincisie rond de rechter achterpoot te maken. Begin in de inguinale vouw medially op ongeveer hetzelfde niveau als de inguinale ligament en breid dorsaal-zijwaarts uit om de omtrekincisie te voltooien.
- Na blootgesteld de spierlaag direct onder de incisie, ontleden en cauterize de oppervlakkige epigastrische vaten die leiden van de spierlaag naar de proximale huid / onderhuidf flap net gemaakt.
- Reflecteer de proximale flap superomedially aan de inguinale ligament en de distale huid / onderhuidse flap inferolateraal aan de knie.
- Gebruik een draad oprolmechanisme of rolgaas om het veld bloot te leggen.
- Merk op dat de inguinale anatomie van de rat vergelijkbaar is met mensen; van laterale tot mediaal liggen de zenuw, slagader, en ader.
- Ontleed de dijzenzenuw, verdeel het scherp bij de liesligament, proximaal aan de splitsing indien mogelijk. Trek de verdeelde zenuw inferieur, houden het veilig uit de weg, bedekt onder vochtig gaas.
- Als u de aandacht op de dijbeenslagader en ader besteedt, gebruikt u 4 cm 7-0 zijdebanden om de vaten atraumatisch in te trekken in plaats van ze rechtstreeks te hanteren.
- Ligate alle takken van de dijbeenvaten als ze ontstaan met 7-0 zijden banden; verdeel de takken tussen de banden. Voor zeer kleine takken, kan bipolaire cautery in plaats van banden worden gebruikt.
OPMERKING: Arteriële en veneuze takken die verdeeldheid vereisen omvatten de oppervlakkige circumflex iliacale en de gespierde bloedvaten. De oppervlakkige circumflex iliacale is meestal het grootst en lijkt diep te duiken net als de profunda femoral bij de mens, maar de profunda is afwezig in de rat15. Meer distale takken van de dijbeenvaten zoals de hoogste geniculaire en de saphenous tak vereisen meestal geen verdeling. - Injecteer stelselmatig 500 internationale eenheden heparine via de penisader bij een mannelijke rattendonor. Gebruik de oppervlakkige epigastrische ader als de donorrat vrouwelijk is.
- Laat de heparine systemisch circuleren gedurende 2 minuten voordat u verder gaat met de volgende stappen.
- Ligate de dijbeenslagader met 7-0 zijden banden zo proximaal aan de inguinale ligament mogelijk en verdelen tussen de banden.
- Vergelijkbaar met de slagader, ligate en verdeel de dijbeenader.
- Reflecteer zowel slagader als ader inferieur, veilig uit de weg, bedekt onder vochtig gaas samen met de eerder bedekte dijbeenzenuw. Ontleden de ventrale spiergroepen, waarbij u ervoor zorgt dat elk zichtbaar vat dat ontstaat, wordt gecauteriseerd. Aandacht voor hemostase hier zal het minimaliseren van de ontvanger bloedverlies na reperfusie.
- Diep aan de ventrale spiergroepen, identificeren en scherp verdelen de heupzenuw proximale aan haar takken. Drie heuptakken zijn meestal zichtbaar: scheenbeen, peroneale en sural. Alle drie moeten ze allemaal bewaard blijven in de donorledemaat. Een vierde cutane tak is meestal niet te zien in deze dissectie15,16.
- Werk het delen van de resterende ventrale en rugspier groepen op mid-dijniveau met zorgvuldige hemostase. Het kan nodig zijn om de ledemaat medially in te trekken om de scheiding van de spieren te voltooien.
- Transect het dijbeen bot in de middenvorm met behulp van een hand-held draadloze roterende zaag.
- Na het verwijderen van de ledematen graft van de donor, snijd de zijde gebonden uiteinden van de graft kant dijbeenslagader en ader stronken, waardoor het heropenen van de vaten.
- Steek een 24-gauge angiocatheter in de graft slagader stomp en spoel de graft met 250 internationale eenheden van heparine verdund in 5 mL van ijskoude normale zoutoplossing, kijken naar het uitstromen duidelijk door de geopende ader.
- Langzaam, zachtjes spoelen de graft voor ongeveer 3 min. Overtollige krachtige blozen kan het endotheel beschadigen.
- Plaats het transplantaat in een gekoelde zoutschaal genesteld in een ijsemmer tot transplantatie.
- Euthanaseer de donorrat met bilaterale thoracotomie.
- Reinig alle chirurgische instrumenten op de juiste manier.
2. Ontvanger inheemse rechter achterpoot amputatie
- Induceer anesthesie met isofluraan bij 5%, bevestig diepte, trim de vacht, plaats het dier en ontsmet de huid met alcohol zoals beschreven voor de donorrat.
- Down-titrate isoflurane tot 2-2,5% en injecteren onderhuidse preoperatieve analgesie met buprenorfine 1,2 mg/kg, en preoperatieve profylaxe met enrofloxacine 7,5 mg/kg.
- Hetzelfde als voor de donor, maak een omtrek incisie in de inguinale vouw, reflecteer huidflappen die hemostase verzekeren en ontleden de femorale zenuw, slagader en ader, waarbij dezelfde takvaten als hierboven worden geligeerd.
- Verdeel de femorale zenuw meer distally dan voor de donor, maar proximally aan de splitsing indien mogelijk.
- Ontleed de dijbeenslagader en ader met voldoende ruimte om elk afzonderlijk klem op het niveau van de inguinale ligament. Klem de ader en slagader met microchirurgische bulldog klemmen. Eenmaal geklemd, verdeel elk vat scherp met een schaar.
- Verdeel de ventrale en rugspieren van de dij op mid-dijniveau met nauwgezette hemostase, waarbij de ledemaat mediaal wordt ingetrokken als dat nodig is.
- Identificeren en verdelen van de heupzenuwen proximale aan hun tak punten zoals hierboven.
- Transect het dijbeen op middenvorm met behulp van de zaag.
- Verwijder de ontvanger native rechter achterpot en gooi de juiste.
- Down-titrate de isoflurane tot 1-1,5% door de neus kegel.
3. Donor tot implantatie van ledematen
- Met behulp van de hand-held macht zaag, scheren eventuele onregelmatigheden van zowel donor en ontvanger dijbeen gesneden uiteinden.
- Met behulp van de zaag, afgesneden de hub einde van een 18-gauge naald, die het dijbeen intramedullaire staaf zal worden.
- Voordat u het bot manipuleert, breng u een kleine hoeveelheid beenwax aan op het afgeknipte uiteinde van het dijbeen om beenmergbloedingen tijdens het reamingproces te verminderen.
- Coapt de donor en ontvanger femorale botten met behulp van de 18-gauge naald als een intramedullaire staaf. Enige kracht is noodzakelijk, maar niet ream beide bot voor zover de cortex breken.
- Verwijder indien nodig de naald en trim deze op een geschikte lengte, zodat beide botten soepel over de naald passen zonder naald die tussen het bot wordt weergegeven.
- Plaats een kleine steun, zoals een pad van gaas of een kleine rots of modellering klei onder de donor ledemaat om het te houden van spanning.
- Reapproximate de ventrale spiergroepen met acht tot tien eenvoudige onderbroken 5-0 polyglactine hechtingen, zodat de graft niet rond de dijbeennaald draait. Dit geeft de ledemaat stabiliteit voor de anastomoses.
- Irrigeer het graf en chirurgisch veld periodiek met ijskoude zoutoplossing voor een betere visualisatie en om warme ischemische reperfusieletsel te verminderen.
- Lijn de donor en ontvanger femorale slagaders en anastomose ze in end-to-end mode met behulp van eenvoudige onderbroken 10-0 nylon hechting, het vermijden van zowel spanning en looping. De slagader vereist een gemiddelde van zes hechtingen.
- Vergelijkbaar met de slagader, anastomose de donor en ontvanger femorale aderen in end to end mode. De ader vereist zes tot acht hechtingen.
OPMERKING: Royale koude zoutoplossing irrigatie, atraumatische schip handling techniek, en het verlaten van lange staarten om te dienen als verblijf hechtingen voor het intrekken van schepen zijn belangrijke instrumenten voor effectieve microchirurgische anastomoses. - Plaats een kleine hoeveelheid hemostatische cellulosepoeder rond beide anastomoses, en verwijder vervolgens de proximale microchirurgische bulldog klemmen op de ader en de slagader.
- Inspecteer zowel anastomoses voor een goede patency en flow. Gebruik wattenstaafjes om zachtjes de ader te prikken en zorgen voor een goede hemostase van beide anastomoses. Houd druk over bloeden sites en plaats meer hemostatische cellulose poeder indien nodig. Een andere hechting kan worden geplaatst door een bloeden gat op het risico van "back-walling" de naald alleen als laatste redmiddel.
- Wanneer beide anastomoses bevredigend worden bevestigd, trim om het even welke resterende lang verblijf hechtingsstaarten kort om anderen aan te passen.
- Herpositioneer de rat naar de linker laterale decubituspositie, gebruik liberale elektrocauterie om nauwgezette hemostase van een reperfusiespierbloeding te bereiken.
- Zet de aandacht op de zenuw anastomoses zodra spier hemostase is verzekerd. Trim terug elke zenuwsnede uiteinden die lijken haveloos.
- Reapproximate de rugspiergroepen onder heupzenuw met eenvoudige onderbroken 5-0 polyglactine hechtingen.
- De heupzenuw oogsten. Acht tot tien 10-0 nylon neurale eenvoudige onderbroken hechtingen zal meestal volstaan.
- Reapproximate de herinnerende rugspiergroepen en sluit vervolgens de rughuid met 4-0 polyglactine continue hechting.
- Herpositioneer de rat terug naar supine positie en reapproximate de femorale zenuw. Twee tot drie 10-0 nylon neurale eenvoudige onderbroken hechtingen zal meestal volstaan.
- Sluit de ventrale huid met 4-0 polyglactine continue hechting. Vermijd overtollige hechting staart, die kan irriterend zijn voor de rat eenmaal wakker.
4. Postoperatieve zorg
- Herstel dieren in hun kooien met een verwarmingskussen onder de kooi en klaar toegang tot voedsel en water, monitoring voor vroege complicaties dagelijks voor de eerste week.
- Voorslepen postoperatieve analgesie met onderhuidse meloxicam 1 mg/kg dagelijkse injectie via POD 2. Zorg voor postoperatieve antibiotica profylaxe verdunnen enrofloxaacine spray. Zorg voor ontmoediging voor autotomie (zelfverminking) met Bitter Safe Mist twee keer per dag gespoten naar de graft via POD 7.
- Onderhouden getransplanteerde ratten in kooien met andere ratten, om terug te keren naar dagelijkse activiteiten te stimuleren en rehabiliteren de getransplanteerde ledemaat.
5. Postoperatieve sensatietesten
- Breng de Hargreaves testen van thermische sensatie protocol, ook elders beschreven17,18.
- Plaats de rat in de testcontainer en laat hem 20 minuten acclimatiseren. Het apparaat glas is bevestigd schoon, en de warmtebron bevestigd te werken met de vinger van de onderzoeker.
- Voor het testen, bevestigen dat de rat wakker is en de geteste poot is geplaatst over de infrarood bewegingsdetector.
- Breng thermische energie over op intensiteitsniveau 90. Vertraging in het dier bewegen zijn poot uit de buurt van de warmtebron wordt geregistreerd. Als er binnen 20 seconden geen beweging optreedt, wordt de test afgebroken om letsel te voorkomen.
- Verkrijg vijf proeven per geteste ledemaat, met uitzondering van de hoogste en laagste waarde voor het berekenen van de gemiddelde opnamelatentietijd voor elk dier.
6. Postoperatieve motorproeven
- Met behulp van een loopanalyse loopband en geïntegreerd software-analyseplatform, selecteer kandidaten voor loopband testen op vier tot zes weken na de operatie.
- Trim alle rat teennagels een of twee dagen voor het testen.
- Acclimatiseren dieren naar de testruimte voor een uur voor het testen, en laat voor een minuut van pre-test aaien om angst te kalmeren.
- Het plaatsen van de rat in de loopband, lopen de loopband bij proeven van toenemende snelheid, van 10 cm/ s, tot 14 cm / s, om het doel 18 cm / s. Als de rat terughoudend is en niet kan worden overgehaald om te lopen, aborteren de testen die dag om negatieve conditionering te voorkomen. Laat hoge performers tot 24 cm/s lopen.
- Spoel het loopbandapparaat af met 70% ethanol tussen de geteste dieren.
- Gangparameters zijn output van de eigen software van het analyseplatform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overleving en herstel zijn afhankelijk van een nauwgezette chirurgische techniek. Aandacht voor de vasculaire anastomoses en de neurale anastomoses, evenals de botcoaptatie zoals hierboven beschreven is cruciaal het maximaliseren van het succes van dit model. Operatief ontwerp en representatieve anastomotische resultaten zijn te zien in figuur 1.
De totale mortaliteit was afhankelijk van de immunosuppressiestrategie, waarbij de meerderheid van de isotransplanted dieren het eindpunt van 100-200 postoperatieve dagen bereikte, zoals te zien is in figuur 2. Eenmaal buiten het acute postoperatieve venster konden behandelde allotransplantatiedieren overleven tot 58 postoperatieve dagen. Isografted ratten leefden voor onbepaalde tijd in de loop van de studie, terwijl allograft getransplanteerde ratten had variabele sterfte van rapamycine en FK506. Uit de behandelingen bevorderde FK506 de langste levensvatbaarheid (dag 57), terwijl rapamycine tweede beste (dag 20) over de onbehandelde controle (dag 10) was.
Sensorische en motorische terugwinning kan worden weergegeven in figuur 3. Dieren bleken de sensorische zenuwfunctie van de getransplanteerde poot te hebben hersteld met behulp van het Hargreaves-apparaat op dag 30. De dieren vertoonden vier weken na de operatie een aanzienlijk herstel (Aii). Dieren vertoonden duidelijke verbeteringen in de motorische functie van de getransplanteerde ledemaat met behulp van een loopanalyseband en geïntegreerd softwareanalyseplatform. Voorbeeld gang parameter op basis van specifieke ledematen worden getoond (Bii) en een Sciatic Function Index (SFI) worden ook gepresenteerd (Biii).
Figuur 1: Operatief ontwerp is afgebeeld in cartoon formaat. (A) De rat wordt weergegeven met (B) rechter achterbeen dwarsdoorsnede beeltenis (i) de femorale bundel (zenuw, slagader, en ader) (ii) de heupzenuw, en (iii) het bot. (C) Representatieve micrografen uit de operatiemicroscoop (donor links en ontvanger rechts) werden genomen van de (i) heupzenuw anastomose (ii) de femorale zenuwslagader, en ader anastomoses (getoond van boven naar beneden), en (iii) de 18-gauge naald intramedullaire staaf-femur bot coaptatie. Let op de donorstructuren verschijnen aan de linkerkant in elke foto. Let ook op het dijbeen wordt getoond vóór volledige coaptatie wanneer beide botten zijn tegengewerkt en de naald is verborgen binnen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Procentuele overleving van dieren zoals gepresenteerd dagen na de operatie (POD). Getoonde groepen zijn isograft, allografts zonder behandeling, rapamycine en FK506 immunosuppressiva. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Sensorisch zenuwherstel wordt aangetoond bij (A) Hargreaves die getransplanteerde dieren elk op zes postoperatieve tijdstippen testen en in (B) nog steeds zijn afgeschoten van loopbandtesten met Behulp van DigiGait. i) Representatieve afbeeldingen worden weergegeven met ii) respectieve pootgegevens. De respectievelijke kleurgecodeerde afbeeldingen van poten bevinden zich ook in 0,025 ms-frames. Digigate modellen (iii) worden ook getoond. Betekenis werd bepaald met behulp van een one-way ANOVA met een Bonferroni's meervoudige vergelijkingstest en SEM, waar n=7 en p< 0,05. Deze bijzondere DigiGait-gegevens zijn afkomstig van een isogene dier dat op postoperatieve dag 28 is getest. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Limb transplantatie, onder de bredere categorie van gevasculariseerde component allotransplantation (VCA), heeft op grote schaal toepasbare therapeutische belofte nog onvervuld. De belangrijkste wegversperringen liggen in onopgeloste immunologische problemen die uniek zijn voor VCA en neuromotorische hersteltechnieken die momenteel worden gebruikt. De ontwikkeling van nieuwe technieken zal afhangen van dierlijke modellering die flexibel, robuust en reproduceerbaar is.
Veel diermodellen zijn gevestigd in VCA, elk met specifieke voordelen4. Niet-menselijke primatenmodellen bieden aantrekkelijke vertaalbaarheid voor menselijke patiënten, maar worden belemmerd door kostenproblemen en toxische niveaus van immunosuppressie vereist4. Hondenmodellen zijn gezien als voordelig voor specifieke gelijkenissen van de spierstructuur als mensen en een meer ervaren immuunsysteem19,20. Varkensmodellen bieden de voordelen van een groot diermodel waarbij het immuunsysteem steeds beter bestudeerd wordt21,22. Muismodelsystemen presenteren de meest geavanceerde technieken om immunologie te bestuderen, maar ondanks belangrijke vooruitgang in geboeide vasculaire microchirurgische anastomose23, blijft de transplantatie van de muisledebeen technisch uitdagend en heeft een aantal beperkingen in de functionele herstelbeoordeling5,24,25,26.
Rat modellen in VCA zijn gebruikt sinds 19783, het verstrekken van een volwassen platform om zowel immunologische en neuromotorische hypothesen te onderzoeken6,9,13,14,17,27,28,38. Het model combineert hier de voordelen van hindlimb orthotopische benadering, hechtanoose, zenuwherenamensing en potentieel voor loopanalyse. Hindlimb orthotopic in tegenstelling tot voorpoottransplantatie is minder een last aan de rat tijdens het herstelproces en zorgt voor voortdurende normale verzorging en voeding gedrag post operatief. Suture anastomose hoewel nauwgezet kan mogelijk bieden minder technische verstoren voor lange termijn studies. Zenuw re-benadering zorgt voor toekomstig onderzoek17,,18 en gang analyse. Dit protocol is gebaseerd op nauwgezette, beproefde microchirurgische technieken die elders goed beschrevenzijn 29, waarbij constante aandacht nodig is om de onmiddellijke valkuilen van verdovingsoverosis, anastomotisch falen, anastomotische trombose en overmatig chirurgisch bloedverlies te voorkomen. Hoewel meerdere microchirurgen de workflow kunnen verbeteren, hebben we een methode beschreven waarmee een enkele werkende microchirurg voldoende experimentele output kan bereiken.
Autotomie of zelfverminking is een fenomeen opgemerkt in verschillende microchirurgische modellen, en het is verondersteld om omgekeerd correleren met zenuwgenezing30,31. Autotomie werd over het algemeen gecontroleerd in dit model, mogelijk gerelateerde nauwgezette neurale anastomotische techniek. Autotomie daalde ook verder in de leercurve. Bitter Safe Mist was een waardevolle aanvulling op het beheersen van dit fenomeen.
De ganganalyse bij ratten is onderzocht op meerdere modellen van letsel32,33,34, het meest relevant voor heupzenuwletsel35,36. Ratten, zelfs wanneer niet ledematen transplantatie ontvangers zijn bekend als heterogene onderwerpen voor ganganalyse, en onderzoekers nog steeds debatteren welke analyse parameters beschrijven herstel37. In dit model hebben we verschillende methoden beschreven om de beste gegevens te verkrijgen van getransplanteerde ontvangers die bereid en in staat zijn om te lopen. De voorselectie van voldoende wandelaars was niet voorspellend voor postoperatieve samenwerking. Hoewel dieren in staat zijn om te bewegen over hun huisvesting zo snel als enkele uren na de operatie, ze zijn niet klaar voor loopband ambulatie tot ten minste vier tot zes weken na de operatie.
Het vermogen van een protocol om zenuwherstel bij VCA te meten is afhankelijk van zijn strategie voor revalidatie. Dit protocol bevordert expliciet transplantatie ontvangers interactie met andere ratten als aansporing om te functioneren. Deze strategie is zich bewust van het belang van het modelleren van revalidatie, maar is eenvoudig, economisch, en is grotendeels standaard. Toekomstige strategieën kunnen bestaan uit meer actieve revalidatie, zoals loopband training.
De immunologische technieken die op dit model van toepassing zijn, vallen buiten het bereik van deze discussie, maar in het bijzonder biedt het vergelijken van isotransplantatie versus allotransplanted dieren een nuttige controle om allograft immunologische verschijnselen en afstoting te onderscheiden van de ischemische reperfusieletsel, ontsteking, revascularisatie en postchirurgische infectieprocessen die inherent zijn aan de transplantatieoperatie zelf. Isotransplants bieden een soortgelijke controle voor zenuwfunctie studies om dezelfde reden.
Met behulp van dit platform, onderzoekers kunnen zowel VCA immunologie en neuromotorisch herstel vooraf.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de Frankel Foundation en het Northwestern Memorial Hospital McCormick Grant (Operatie RESTORE). Onderzoek gemeld in deze publicatie werd ondersteund door het National Institute of General Medicial Sciences van de National Institutes of Health onder Award Number T32GM008152. Dit werk werd ondersteund door de Northwestern University Microsurgery Core en Behavioral Phenotyping Core.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | Vet Equip | 911103 | |
| 0.5cc syringe | Exel | 26018 | |
| 18-gauge needle | BD | 305196 | |
| 1cc syringe | BD | 309659 | |
| 22-gauge needle | BD | 305156 | |
| 24-gauge angiocatheter | Sur-Vet | SROX2419V | |
| 25-gauge needle | Exel | 26403 | |
| 3 cc syringe | BD | 309657 | |
| 5cc syringe | Exel | 26230 | |
| Alcohol | Fisher Scientific | HC-600-1GAL | |
| Anesthesia induction chamber | Vet Equip | 941443 | |
| Anesthetic gas scavenger system | Vet Equip | 931401 | |
| Bipolar electrocautery | Aura | 26-500 | |
| Bitter Spray Mist | Henry Schein | 5553 | |
| Bone wax | CP Medical | CPB31A | |
| Breathing circuit | Vet Equip | 921413 | |
| Buprenophine | Reckitt Benckiser | 12496075705 | |
| Castro-Viejos needle drivers | Roboz | RS-6416 | |
| Cordless rotary saw | Dremel | 8050-N/18 | |
| Cotton swab stick | Fisher Scientific | 23-400-101 | For hemostasis |
| DigiGait Appparatus and Software | Mouse Specifics | MSI-DIG, DIG-SOFT | |
| Dumont forceps (#4) | Roboz | RS-4972 | |
| Dumont forceps (#5) | Roboz | RS-5035 | |
| Enrofloxacin | Norbrook | ANADA 200-495 | |
| FK-506 | Astellas | 301601 | |
| Gauze | Kendall | 1903 | |
| Gauze | Covidien | 8044 | |
| Gloves | Microflex | DGP-350-M | |
| Hair clippers | Oster | 078005-010-003 | |
| Handheld monopolar electrocautery | Bovie | AA00 | |
| Hargreaves Apparatus | Ugo Basile S.R.L. Gemonio, Italy | 37370 | |
| Heating pad | Walgreens | 126987 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | 42592K | |
| Hot plate | Corning | PC-351 | For warming resusscitation fluid |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Lactated ringers | Baxter | 2B2074 | |
| Large petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | For donor graft while in chilled saline |
| Meloxicam | Henry Schein | 49755 | |
| micro Collin Hartmann retractor | |||
| Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5841 | |
| Microfibrillar collagen powder | BD | 1010590 | For hemostasis |
| Microvascular clips | Roboz | RS-5420 | |
| Normal saline | Baxter | 2F7124 | |
| Opthalmic lube | Dechra | IS4398 | |
| Rapmycin | MedChem Express | HY-10219 | |
| Small petri dish | Fisher Scientific | FB0875713A | For warmed resusscitation fluid |
| Sterile drapes | ProAdvantage | N207100 | |
| Surgical gown | Cardinal Health | 9511 | |
| Surgical mask | 3M | 1805 | |
| Surgical microscope, optic model OPMIMD | Zeiss | 169756 | |
| Surgical microscope, Universal S3 | Zeiss | 243188 | |
| Suture 10-0 nylon | Covidien | N2512 | |
| Suture 5-0 vicryl | Ethicon | J213H | |
| Suture 7-0 silk tie | Teleflex | 103-S | |
| Tape | 3M | 1530-1 | |
| Ultrasonic instrument cleaner | Roboz | RS-9911 | |
| Vessel dilation forceps | Roboz | RS-5047 |
References
- Elliott, R. M., Tintle, S. M., Levin, L. S. Upper extremity transplantation: current concepts and challenges in an emerging field. Current Reviews in Musculoskeletal Medicine. 7 (1), 83-88 (2014).
- Petruzzo, P., et al. The International Registry on Hand and Composite Tissue Transplantation. Transplantation. 90 (12), 1590-1594 (2010).
- Shapiro, R. I., Cerra, F. B. A model for reimplantation and transplantation of a complex organ: the rat hind limb. Journal of Surgical Research. 24 (6), 501-506 (1978).
- Brandacher, G., Grahammer, J., Sucher, R., Lee, W. P. Animal models for basic and translational research in reconstructive transplantation. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 96 (1), 39-50 (2012).
- Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. Journal of Visualized Experiments. (108), e53483 (2016).
- Sucher, R., et al. Orthotopic hind-limb transplantation in rats. Journal of Visualized Experiments. (41), e2022 (2010).
- Horner, B. M., et al. In vivo observations of cell trafficking in allotransplanted vascularized skin flaps and conventional skin grafts. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (4), 711-719 (2010).
- Fleissig, Y., et al. Modified Heterotopic Hindlimb Osteomyocutaneous Flap Model in the Rat for Translational Vascularized Composite Allotransplantation Research. Journal of Visualized Experiments. (146), e59458 (2019).
- Zhou, X., et al. A series of rat segmental forelimb ectopic implantation models. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
- Adamson, L. A., et al. A modified model of hindlimb osteomyocutaneous flap for the study of tolerance to composite tissue allografts. Microsurgery. 27 (7), 630-636 (2007).
- Ulusal, A. E., Ulusal, B. G., Hung, L. M., Wei, F. C. Heterotopic hindlimb allotransplantation in rats: an alternative model for immunological research in composite-tissue allotransplantation. Microsurgery. 25 (5), 410-414 (2005).
- Fries, C. A., et al. enzyme responsive, tacrolimus-eluting hydrogel enables long-term survival of orthotopic porcine limb vascularized composite allografts: A proof of concept study. PLoS One. 14 (1), 0210914 (2019).
- Cottrell, B. L., et al. Neuroregeneration in composite tissue allografts: effect of low-dose FK506 and mycophenolate mofetil immunotherapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 5 (2006).
- Benhaim, P., Anthony, J. P., Lin, L. Y., McCalmont, T. H., Mathes, S. J. A long-term study of allogeneic rat hindlimb transplants immunosuppressed with RS-61443. Transplantation. 56 (4), 911-917 (1993).
- Greene, E. C. Anatomy of the rat. Volume N.S. American Philos. Soc. , Philadelphia, Pa. 27 (1935).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
- Cheah, M., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. Assessment of Thermal Pain Sensation in Rats and Mice Using the Hargreaves Test. Bio-protocol. 7 (16), (2017).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Hong, S. H., Eun, S. C. Experimental Forelimb Allotransplantation in Canine Model. BioMed Research International. 2016, 1495710 (2016).
- Mathes, D. W., et al. A preclinical canine model for composite tissue transplantation. Journal of Reconstructive Microsurgery. 26 (3), 201-207 (2010).
- Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. Journal of Visualized Experiments. (80), e50475 (2013).
- Fries, C. A., et al. A Porcine Orthotopic Forelimb Vascularized Composite Allotransplantation Model: Technical Considerations and Translational Implications. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (3), 71 (2016).
- Kim, M., Fisher, D. T., Powers, C. A., Repasky, E. A., Skitzki, J. J. Improved Cuff Technique and Intraoperative Detection of Vascular Complications for Hind Limb Transplantation in Mice. Transplantation Direct. 4 (2), 345 (2018).
- Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (12), 015495 (2013).
- Sucher, R., et al. Mouse hind limb transplantation: a new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery. Transplantation. 90 (12), 1374-1380 (2010).
- Tung, T. H., Mohanakumar, T., Mackinnon, S. E. Development of a mouse model for heterotopic limb and composite-tissue transplantation. Journal of Reconstructive Microsurgery. 17 (4), 267-273 (2001).
- Tang, J., et al. A vascularized elbow allotransplantation model in the rat. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 24 (5), 779-786 (2015).
- Yan, Y., et al. Nerve regeneration in rat limb allografts: evaluation of acute rejection rescue. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (4), 511 (2013).
- Georgiade, N. G., Serafin, D. A Laboratory Manual of Microsurgery. Fourth Printing. , (1986).
- Tseng, S. H. Suppression of autotomy by N-methyl-D-aspartate receptor antagonist (MK-801) in the rat. Neuroscience Letters. 240 (1), 17-20 (1998).
- Haselbach, D., et al. Regeneration patterns influence hindlimb automutilation after sciatic nerve repair using stem cells in rats. Neuroscience Letters. 634, 153-159 (2016).
- Kloos, A. D., Fisher, L. C., Detloff, M. R., Hassenzahl, D. L., Basso, D. M. Stepwise motor and all-or-none sensory recovery is associated with nonlinear sparing after incremental spinal cord injury in rats. Experimental Neurology. 191 (2), 251-265 (2005).
- Berryman, E. R., Harris, R. L., Moalli, M., Bagi, C. M. Digigait quantitation of gait dynamics in rat rheumatoid arthritis model. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 9 (2), 89-98 (2009).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Deumens, R., Marinangeli, C., Bozkurt, A., Brook, G. A. Assessing motor outcome and functional recovery following nerve injury. Methods in Molecular Biology. 11622, 179-188 (2014).
- Bozkurt, A., et al. Aspects of static and dynamic motor function in peripheral nerve regeneration: SSI and CatWalk gait analysis. Behavioural Brain Research. 219 (1), 55-62 (2011).
- Neckel, N. D. Methods to quantify the velocity dependence of common gait measurements from automated rodent gait analysis devices. Journal of Neuroscience Methods. 253, 244-253 (2015).
- Yeh, L. S., Gregory, C. R., Theriault, B. R., Hou, S. M., Lecouter, R. A. A functional model for whole limb transplantation in the rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (5), 1704-1711 (2000).
