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एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थ मक्का इंनस्ल लाइनों के एग्रोबैक्टीरियम -मध्यस्थता अपरिपक्व भ्रूण परिवर्तन मॉर्फोजेनिक जीन का उपयोग कर

Published: February 14, 2020 doi: 10.3791/60782
Automatic Translation
1,2, 1,3,4, 1,3, 1,3,5, 2, 2, 1,3
1Department of Agronomy, Iowa State University, 2Department of Applied Science and Technology, Corteva Agriscience, 3Crop Bioengineering Center, Iowa State University, 4Interdepartmental Plant Biology Major, Iowa State University, 5Interdepartmental Genetics and Genomics Major, Iowa State University

Summary

पौधे मॉर्फोजेनिक जीन का उपयोग अड़ियल जीनोटाइप के आनुवंशिक परिवर्तन में सुधार करने के लिए किया जा सकता है। यहां वर्णित तीन महत्वपूर्ण सार्वजनिक मक्का नस्ल लाइनों के लिए एक एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थताआनुवंशिक परिवर्तन (क्विककॉर्न) प्रोटोकॉल है।

Abstract

यहां प्रदर्शित एग्रोबैक्टीरियम-मॉर्मोजेनिकजीन बेबी बूम (बीबीएम)और वुशेल2 (Wus2)का उपयोग करके मक्का नस्ल लाइनों के आनुवंशिक परिवर्तन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है । बीबीएम को मक्का फॉस्फोलिपिड ट्रांसफरेज जीन(पीएलटीपी)प्रमोटर द्वारा विनियमित किया जाता है, और Wus2 मक्का ऑक्सिन-इंड्यूबल(एक्सीजी1)प्रमोटर के नियंत्रण में है। स्थानांतरण डीएनए (टी-डीएनए) पर इन मॉर्फोजेनिक जीन ले जाने वाला एग्रोबैक्टीरियम तनाव और एग्रोबैक्टीरियम उग्रता(वीर)जीन की अतिरिक्त प्रतियों का उपयोग मक्का अपरिपक्व भ्रूण एक्सप्लांटको संक्रमित करने के लिए किया जाता है। संक्रमित भ्रूण के स्कूटेला पर दैहिक भ्रूण बनते हैं और शाकनाशी प्रतिरोध द्वारा चुने जा सकते हैं और पौधों में अंकुरित हो सकते हैं। डीएनए निर्माण में निर्मित एक गर्मी-सक्रिय क्रे/लोक्सपी पुनर्संयोजन प्रणाली परिवर्तन प्रक्रिया के प्रारंभिक चरण के दौरान मक्का जीनोम से मॉर्फोजेनिक जीन को हटाने की अनुमति देती है । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके क्रमशः W22, B73 और Mo17 के लिए लगभग 14%, 4%, और 4% (प्रति 100 संक्रमित भ्रूण प्रति स्वतंत्र ट्रांसजेनिक घटनाओं की संख्या) की परिवर्तन आवृत्तियों को प्राप्त किया जा सकता है।

Introduction

परिवर्तन मक्का में विदेशी जीन अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने और अनुसंधान और वाणिज्यिक दोनों प्रयोजनों के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित मकई लाइनों का उत्पादन करने के लिए एक बुनियादी उपकरण है । उच्च थ्रूपुट परिवर्तन तक पहुंच मक्का आणविक और सेलुलर जीव विज्ञान अध्ययन1के लिए बढ़ी हुई आवश्यकता को सुविधाजनक बना सकती है । फसल प्रजातियों को आनुवंशिक रूप से बदलने की क्षमता सार्वजनिक और निजी दोनों प्रयोगशालाओं के लिए महत्वपूर्ण है । यह जीन विनियमन तंत्र की मौलिक समझ के साथ-साथ वैश्विक स्तर पर फसल सुधार दोनों के लिए एक बढ़ती आबादी का समर्थन करने की अनुमति देता है ।

मक्का से अपरिपक्व भ्रूण का उपयोग पुनर्योजी कालस के उत्पादन के लिए की जाने वाली खोज का उपयोग 19752में हुआ था . इस रहस्योद्घाटन के बाद से, सबसे स्केलेबल मक्का परिवर्तन प्रोटोकॉल3उत्थान से पहले कॉलस गठन और चयन की आवश्यकता है । आनुवंशिक परिवर्तन की प्रक्रिया के दौरान, एग्रोबैक्टीरियम-संक्रमितया बायोलिस्टिक-बमबारी अपरिपक्व भ्रूण भ्रूणीय कॉलस प्रेरण के लिए मीडिया पर सुसंस्कृत हैं। प्रेरित कैली तो चयनात्मक मीडिया पर सुसंस्कृत कर रहे है (उदाहरण के लिए, एक शाकनाशी युक्त) ताकि केवल बदल कॉलस टुकड़े जीवित रहने में सक्षम हैं । ये शाकनाशी प्रतिरोधी ख्यात ट्रांसजेनिक कैली को थोक और पौधों में पुनर्जीवित किया जाता है। हालांकि यह विधि प्रभावी है, प्रक्रिया लंबी और श्रम-प्रधान है, और इसे पूरा करने में 3 महीने की ऊपर की ओर ले जा सकतेहैं। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि पारंपरिक मक्का परिवर्तन प्रोटोकॉल की बहुत बड़ी सीमा है, अर्थात केवल मक्का के जीनोटाइप की सीमित संख्या5,6को बदल सकती है।

लोव एट अल7,8 ने पहले एक "क्विककॉर्न" परिवर्तन विधि की सूचना दी थी जिसने न केवल परिवर्तन प्रक्रिया की अवधि को बहुत कम कर दिया बल्कि परिवर्तनीय जीनोटाइप की सूची का विस्तार भी किया। क्विककॉर्न विधि अरबीडोप्सिस ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर्स बेबी बूम (बीबीएम)9 और वुशेल (डब्ल्यूयूएस)10के मक्का ऑर्थोलोग्स(जेडएम-बीबीएम और जेडएम-Wus2)का उपयोग करती है। जब परिवर्तन वेक्टर प्रणाली में शामिल किया जाता है, तो ये जीन भ्रूणीय विकास को प्रोत्साहित करने के लिए सहक्रियात्मक रूप से काम करतेहैं7।

इस कार्य में वर्णित क्विककॉर्न प्रोटोकॉल जोन्स एट अल11में प्रोटोकॉल पर आधारित था , जो लोव एट अल7,8द्वारा सूचित विधि में और सुधार था । वर्तमान अध्ययन में, एक एग्रोबैक्टीरियम तनाव LBA4404 (तेरा-) एक बाइनरी वेक्टर निर्माण PHP81430(चित्रा 1)और गौण प्लाज्मिड PHP7153912 परिवर्तन के लिए उपयोग किया जाता है । PHP81430 के टी डीएनए में निम्नलिखित आणविक घटक शामिल हैं। (1) ट्रांसफॉर्मेशन चुनिंदा मार्कर जीन एचआरए एक्सप्रेशन कैसेट । मक्का एचआरए (जेडएम-एचआरए)जीन एक संशोधित एसीटोलैक्टेस सिंथासे (एएलएस) जीन है जो एएलएस-बाधा शाकनाशी जैसे सल्फोनिलुरास और इमिडाजोलिनोन13,14के प्रति सहिष्णु है। जेडएम-एचआरए जीन को ज्वार एएलएस प्रमोटर8 और आलू प्रोटीन्स अवरोधक II(पिनII) टर्मिनेटर15द्वारा विनियमित किया जाता है। टी डीएनए भी (2) परिवर्तन स्क्रीनेबल मार्कर जीन ZsGreenरखने के एक अभिव्यक्ति कैसेट शामिल हैं । जोएंथस एसपी रीफ कोरल16 से यह ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन जेडग्रीन को ज्वार सर्वव्यापी प्रमोटर/इंट्रोन और चावल सर्वव्यापक टर्मिनेटर द्वारा विनियमित किया जाता है ।

इसके अतिरिक्त, टी डीएनए में (3) मॉर्फोजेनिक जीन बीबीएम अभिव्यक्ति कैसेट शामिल है। बीबीएम भ्रूण विकास9,17से जुड़ा एक प्रतिलेखन कारक है . बीबीएम को मक्का फॉस्फोलिपिड ट्रांसफराज प्रोटीन(पीएलटीपी)प्रमोटर8 और चावल टी -28 टर्मिनेटर18द्वारा विनियमित किया जाता है । Zm-Pltp भ्रूण स्कूटीएलर एपिथेलियम, रेशम बाल, और पत्ती सहायक कोशिकाओं (गार्ड कोशिकाओं को flanking), प्रजनन अंगों में कम अभिव्यक्ति, और जड़ों8में कोई अभिव्यक्ति में मजबूत अभिव्यक्ति के साथ एक जीन है । इसमें (4) मॉर्फोजेनिक जीन Wus2 एक्सप्रेशन कैसेट भी होता है। WUS2 एक और ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर है जो एपिकल मेरिस्टेम19के रखरखाव से जुड़ा हुआ है । Zm-WUS2 एक मक्का ऑक्सिन-प्रेरक प्रमोटर(Zm-Axig1)20 और मक्का In2-1 टर्मिनेटर21के नियंत्रण में है । अंत में, टी-डीएनए में (5) क्रे-लोक्सपी पुनर्संयोजन प्रणाली शामिल है। क्रे रीकॉम्बिनेज जीन22 मक्का हीट शॉक प्रोटीन 17.7(Hsp17.7)23 प्रमोटर और आलू पिनII टर्मिनेटर के नियंत्रण में है। दो लोक्सपी साइटें (एक ही अभिविन्यास में)24 ZsGreen, cre, Bbm और Wus2सहित चार जीन अभिव्यक्ति कैसेट पार्श्व ।

क्योंकि मॉर्फोजेनिक जीन की उपस्थिति पौधों की परिपक्वता और बाद में संतान के लिए वांछित नहीं है, गर्मी से प्रेरित क्रे-लोक्सपी पुनर्संयोजन प्रणाली को सामान्य कॉलस पुनर्जनन और पौधे के विकास की अनुमति देने के लिए मक्का जीनोम से मॉर्फोजेनिक जीन को हटाने के लिए टी-डीएनए में बनाया गया था। गर्मी उपचार पर, सीआरई प्रोटीन की अभिव्यक्ति एचआरए चयन जीन को छोड़कर सभी ट्रांसजीन को हटा देती है। सफल ट्रांसफॉर्मेंट शाकनाशी प्रतिरोधी लेकिन ZsGreen-नकारात्मकहोना चाहिए। परिवर्तन आवृत्ति को और बढ़ाने के लिए, एग्रोबैक्टीरियम तनाव एक अतिरिक्त सहायक प्लाज्मिड (PHP71539) को भी आश्रय देता है जिसमें एग्रोबैक्टीरियम उग्रता(वीर)जीन12की अतिरिक्त प्रतियां हैं।

क्विककॉर्न विधि पारंपरिक मक्का परिवर्तन प्रोटोकॉल से अलग है, क्योंकि इसमें परिवर्तन के दौरान कॉलस इंडक्शन कदम शामिल नहीं है। एग्रोबैक्टीरियमके साथ संक्रमण के बाद पहले सप्ताह के दौरान, संक्रमित अपरिपक्व भ्रूण के स्कूटीएलर एपिथेलियम पर दैहिक भ्रूण विकसित होते हैं। भ्रूण तो हार्मोन है कि भ्रूण परिपक्वता और गोली मार गठन को प्रोत्साहित के साथ एक माध्यम में स्थानांतरित कर रहे हैं । दैहिक भ्रूणों को परिपक्वता/शूट फॉर्मेशन मीडियम पर तेजी से स्थानांतरित करना पहले मक्का परिवर्तन के लिए उपयोग किए जाने वाले पारंपरिक कॉलस चरण को रोक देता है और टी0 पौधों की प्रत्यक्ष पीढ़ी को8की अनुमति देता है । पहले प्रकाशित मक्का परिवर्तन विधियों की तुलना में6,क्विककॉर्न विधि तेज, अधिक कुशल और कम जीनोटाइप-निर्भर है। इस विधि का उपयोग करके, जड़ें पौधे आमतौर पर पारंपरिक प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक तीन या अधिक महीनों के बजाय सिर्फ 5-7 सप्ताह में मिट्टी में स्थानांतरित करने के लिए तैयार होते हैं। इस लेख का उद्देश्य एक में गहराई से वर्णन और विधि का प्रदर्शन प्रदान करने के लिए है, एक प्रयोगशाला में आसान प्रतिकृति के लिए अनुमति आम तौर पर सबसे अकादमिक संस्थानों में पाया ।

Protocol

1. विकास मीडिया की तैयारी

  1. इस प्रोटोकॉल के लिए सटीक विकास मध्यम व्यंजनों के लिए, कृपया तालिका 1का उल्लेख करें।
  2. मीडिया के 1 एल तैयार करने के लिए, एक हलचल प्लेट पर एक 2 एल बीकर जगह है और अंदर एक हलचल बार जगह है ।
  3. आसुत पानी के 900 मिली0 मीटर के साथ बीकर भरें और हलचल प्लेट चालू करें। हलचल बार एक मध्यम गति से कताई होना चाहिए।
  4. सभी पाउडर सामग्री तौलना और एक बीकर में भंग।
  5. सभी तरल अवयवों को मापें, यदि कोई हो, और बीकर में जोड़ें।
  6. आसुत पानी का उपयोग कर के 1 एल करने के लिए अंतिम मात्रा लाओ।
  7. पीएच को मापें और नुस्खा विनिर्देशों में समायोजित करें।
  8. यदि तरल विकास माध्यम तैयार किया जाता है, तो कोई आगर नहीं जोड़ा जाता है। एक वैक्यूम पंप के लिए एक फिल्टर स्टरलाइजर संलग्न करें और फिल्टर के माध्यम से तरल विकास माध्यम डालना। पंप चालू करें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि सभी तरल को खींचा न जाए। कंटेनर पर एक टोपी रखें और एक लेबल संलग्न करें।
  9. यदि पीएच समायोजित होने के बाद ठोस विकास माध्यम तैयार कर रहे हैं, तो आगर को सीधे बोतल या फ्लास्क में जोड़ें।
  10. 1 एल तरल विकास माध्यम को 2 एल एर्लेंमेयेर फ्लास्क में डालें, या इसे दो 1 एल ऑटोक्लेवबल बोतलों (500 मीटर प्रत्येक) में विभाजित करें। अगर दो बोतलों का इस्तेमाल किया जाता है तो आगर को डिवाइड कर सीधे बोतलों में डालें।
  11. भाप से बचने की अनुमति देने के लिए, एल्यूमीनियम पन्नी की दो परतों जैसे सांस कवर के साथ फ्लास्क को कवर करें। यदि बोतल का उपयोग कर रहे हैं, तो शीर्ष पर स्क्रू ढक्कन को शिथिल करें।
  12. 25 मिन के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोक्लेव।
  13. ऑटोक्लेव के बाद, ऑटोक्लेव से विकास माध्यम को हटा दें और 55-60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें (55 डिग्री सेल्सियस तक सेट पानी स्नान इसे आसान बना सकता है)। विकास माध्यम को कुछ घंटों के लिए तरल अवस्था में रखें जब तक कि प्लेटें डालना सुविधाजनक न हो।
  14. एक बार ठंडा होने के बाद, सभी पोस्ट नसबंदी एडिटिव्स (टेबल 1देखें) जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं।
  15. सभी अवयवों को जोड़े जाने के बाद, एक लैमिनार प्रवाह हुड में पसंद के कंटेनर में नामित मात्रा डालें।
  16. विकास माध्यम को मैन्युअल रूप से वांछित पेट्री व्यंजनों में डाला जा सकता है या तरल वितरण उपकरण का उपयोग कर के किया जा सकता है। मैन्युअल रूप से डालने के दौरान, हैंडलिंग में आसानी के लिए बड़ी मात्रा में ऑटोक्लेव्ड मध्यम को एक छोटे बाँझ बीकर (500 मिलील) में स्थानांतरित करने की सिफारिश की जाती है।
  17. विकास माध्यम को ठंडा और जमना की अनुमति दें।
  18. विकास माध्यम उपयोग के लिए उपलब्ध हो जाएगा एक बार ठोस बनने और सबसे अच्छा lidded प्लेटों के ढेर के रूप में एक बाँझ प्रवाह हुड में थोड़ा रात भर सुखाने के बाद अगले दिन प्रयोग किया जाता है । रात भर सूखने के बाद, प्लेटों को प्लास्टिक आस्तीन में स्थानांतरित करें, ढीले अंत पर मोड़ें, और इसे टेप के एक छोटे से बिट के साथ रखें। यह अत्यधिक सूखने से बचाता है। मध्यम को 1 महीने तक के लिए शांत, अंधेरे और स्वच्छ वातावरण (4-16 डिग्री सेल्सियस) में संग्रहित किया जा सकता है।

2. बढ़ते दाता पौधों और अपरिपक्व कानों की कटाई

  1. 1.5 गैलन (5.9 एल) बर्तन ों में एक ग्रीनहाउस में किसी भी सार्वजनिक रूप से उपलब्ध मक्का इंनस्ल (यानी, बी 73, Mo17, या W22) उगाएं जिसमें मिट्टी रहित सब्सट्रेट होता है। दिन के दौरान औसत तापमान 25.5 डिग्री सेल्सियस और रात में 20 डिग्री सेल्सियस के साथ 16/8 (दिन/रात) फोटो अवधि का उपयोग करें।
  2. पौधों को जरूरत के रूप में पानी दिया जाता है और एक नियंत्रित रिलीज उर्वरक (15-9-12 के एन-पी-के) के साथ निषेचित किया जाता है, जिसे या तो मिट्टी के मिश्रण में शामिल किया जा सकता है या रोपण के बाद सतह पर जोड़ा जा सकता है।
  3. कान ों के उभरने के लिए बीज अंकुरण के लगभग 70-90 दिनों का समय लगता है। जैसे ही कान की शूटिंग निकलती है, उन्हें अनियंत्रित परागण को होने से रोकने के लिए शूट बैग से ढक दें।
  4. रेशम के उभरने के लगभग 2-3 दिन बाद और यदि पराग अगले दिन उपलब्ध होंगे, तो 70% इथेनॉल में निष्फल किए गए कैंची का उपयोग करके रेशम काट लें। रेशम और भूसी को भूसी के पत्तों के अंत के नीचे लगभग 2.5 सेमी काट लें, जहां रेशम निकलते हैं। परागण अगले दिन किया जा सकता है। प्रत्येक कान के बीच कैंची को फिर से अशांत करना सुनिश्चित करें।
  5. एक बार एंथर्स एक लटकन से निकलते हैं, तो डंठल के चारों ओर बैग के आधार पर लटकन बैग और गैर-स्किड पेपर क्लिप के साथ लटकन को कवर करें।
  6. अगली सुबह, धीरे से पौधे को मोड़ें और पराग को रिहा करने के लिए प्रोत्साहित करने के लिए बैग को टैप करें।
  7. लटकन बैग निकालें और बचने से पराग को रोकने के लिए बैग के ऊपर गुना। यह आम तौर पर सबसे अच्छा है 1 दिन पहले यह इस्तेमाल किया जाएगा लटकन बैग (मृत पराग और शेड एंथरके के निर्माण से बचने के लिए) । ताजा पराग को लगभग 3-5 दिनों तक लटकन से एकत्र किया जा सकता है। जब एंथर्स लटकन के आधार पर आंतरिक फूलों से निकलते हैं, तो वह लटकन अगले दिन व्यवहार्य पराग का उत्पादन नहीं करेगा।
  8. एक ही पौधे (सेल्फिंग) से या उसी इंब्रीड (सिबिंग) के किसी अन्य पौधे से पराग का उपयोग करें।
  9. कान बैग निकालें या रेशम का पर्दाफाश करने के लिए बैग के अंत में कटौती करें, फिर जल्दी से चमकक बैग से रेशम पर पराग डालें।
  10. तुरंत लटकन बैग के साथ कान को कवर करें और इसे सुरक्षित करने के लिए डंठल के चारों ओर बैग के आधार को स्टेपल करें। परागण के दौरान विभिन्न जीनोटाइप के फूल ों के पौधों से पौधे को शारीरिक रूप से अलग करने में मदद मिल सकती है ताकि क्रॉस-परागण को रोकने में मदद मिल सके। लटकन बैग को कान पर तब तक छोड़ दें जब तक कि अपरिपक्व कान फसल के लिए तैयार न हो जाए।
  11. परागण के 9-12 दिन बाद भ्रूण के आकार के लिए कान ों पर स्क्रीन करें। कान का पर्दाफाश करने के लिए डंठल ऊपर परागण बैग स्लाइड। धीरे से कान की परिधि के बारे में एक तिहाई से एक चौथाई और कान के नीचे दूरी के बारे में एक तिहाई पर गुठली का पर्दाफाश करने के लिए नीचे भूसी खींचो । टिप के पास गुठली औसत भ्रूण आकार का प्रतिनिधि नहीं होगा ।
  12. एक स्केलपेल का उपयोग करना, एक गिरी की टोपी को काट लें जो आकार और रंग में अन्य गुठली के बहुमत के समान दिखाई देता है।
  13. चरण 4.6 में वर्णित भ्रूण को हटाने के लिए एक स्पैटुला (एक शासक के साथ) का उपयोग करें। स्पैटुला या डिजिटल कैलिपर पर बिल्ट-इन रूलर का उपयोग करके भ्रूण की लंबाई को मापें। यदि भ्रूण 1.5-2.0 मिमी के बीच है, तो कान की कटाई करें। यदि यह ~ 1.3 मिमी है, तो कान दिन में बाद में फसल के लिए तैयार हो सकता है और लगभग 7-8 घंटे में फिर से जांच की जा सकती है।

3. संक्रमण के लिए एग्रोबैक्टीरियम निलंबन संस्कृति तैयार करना

नोट: एग्रोबैक्टीरियम तनाव LBA4404 (तेरा-) जिसमें पीएचपी81430(चित्रा 1)और पीएचपी7153912 को -80 डिग्री सेल्सियस पर ग्लाइसेरोल स्टॉक के रूप में संग्रहित किया जाता है। इन सामग्रियों को एक सामग्री हस्तांतरण समझौते के माध्यम से Corteva कृषि विज्ञान से प्राप्त किया जा सकता है। LBA4404 (तेरा-) एक ऑक्सोट्रोफिक तनाव है जिसे विकास मीडिया में आपूर्ति की जाने वाली थाइमिडीन की आवश्यकता है। ऑक्सोट्रोफ एग्रो स्ट्रेन की प्राथमिक उपयोगिता बायोएलोमेंट उद्देश्यों के लिए है। इसमें एग्रो ओवरग्रोथ को कम करने का अतिरिक्त लाभ है। ऑक्सोट्रोफिक एग्रो स्ट्रेन पूरक थाइमिडीन के बिना नहीं बढ़ता है। फिर भी, थाइमिडिन (संभवतः) संस्कृति में पौधे के ऊतकों को मरकर आपूर्ति की जा सकती है। इसलिए, ऑक्सोट्रोफिक एग्रो को पूरी तरह से नियंत्रित करने के लिए अभी भी माध्यम में एंटीबायोटिक प्रदान करने की आवश्यकता है। हालांकि, थाइमिडिन की अनुपस्थिति में ऑक्सोट्रोफिक तनाव की समझौता वृद्धि के कारण इसे नियंत्रित करना आसान हो जाएगा।

  1. संक्रमण की तारीख से चार दिन पहले, ग्लाइसेरोल स्टॉक से 50 मिलीग्राम/एल थाइमिडीन, 50 मिलीग्राम/एल जेंटामिसिन, और 50 मिलीग्राम/एल स्पेक्ट्नोमाइसिन(टेबल 1)के साथ बैक्टीरिया को लकीर देकर ग्लाइसेरोल स्टॉक से "मदर" प्लेट शुरू करें। 3 दिनों के लिए 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में "मां" प्लेट इनक्यूबेट करें।
  2. संक्रमण प्रयोग से एक दिन पहले, "मां" प्लेट से एक से पांच उपनिवेशों का चयन करके एक "काम" प्लेट तैयार करें और "मां" प्लेट से बैक्टीरिया को एक नई वाईपी प्लेट (थाइमिडीन, जेंटामाइसिन और स्पेक्ट्मिसिन के साथ) में लकीर दें; तालिका 1)।
  3. अनुक्रमिक क्वाड्रंट्स में दैनिक "काम" प्लेट लकीर और लगातार चतुर्भुज में बस लकीर क्षेत्र के माध्यम से पाश 1x चलाने के लिए, क्वाड्रंटहै कि क्रमिक रूप से पतला किया गया है फार्म दोहरा । 27 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रात भर "काम" प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  4. भ्रूण विच्छेदन (चरण 4.8) को पूरा करने के बाद, "कामकाजी" प्लेट के एक क्षेत्र से एग्रोबैक्टीरियम एकत्र करने के लिए लूप या समान उपकरण का उपयोग करें जहां बैक्टीरियल विकास उपनिवेशों की पतली धारियाँ के रूप में दिखाई देता है।
    नोट: बैक्टीरियल विकास के घने लॉन के साथ थाली के क्षेत्रों से बचें। एग्रोबैक्टीरियम वृद्धि की संभावना पहले से ही घने क्षेत्रों में गिरावट शुरू कर दिया है, जबकि दृश्यमान कालोनियों के साथ क्षेत्रों में बैक्टीरिया संक्रमण के लिए उचित विकास चरण में हैं ।
  5. एकत्र किए गए बैक्टीरिया को 50 मिलील ट्यूब में निलंबित करें जिसमें 700A तरल माध्यम(तालिका 1)का 10 मिलील हो। भंवर बैक्टीरिया संस्कृति को पूरी तरह से निलंबित करने के लिए।
  6. ऑप्टिकल घनत्व को 550 एनएम की तरंगदैर्ध्य पर मापें। मात्रा को तब तक समायोजित न किया जाए जब तक कि ओडी 0.35-0.45 के बीच न हो, जिसमें 0.4 इष्टतम मूल्य है।
    नोट: यदि ओडी 0.45 से अधिक है, तो अधिक 700A तरल माध्यम जोड़ें। यदि ओडी 0.35 से कम है, तो निलंबन संस्कृति में अधिक एग्रो कॉलोनियों का टीका लगाएं।

4. भ्रूण विच्छेदन, संक्रमण, और सह खेती

  1. परिवर्तन प्रयोगों के लिए उपयुक्त कानों का चयन करें; इनमें एक अच्छा बीज सेट होना चाहिए और भ्रूण होना चाहिए जो आकार में 1.5-2.0 मिमी से होता है। वे आम तौर पर परागण के बाद 9-12 दिनों के बीच काटा जाता है । काटे गए कानों का उपयोग 4 डिग्री सेल्सियस पर 1-4 दिनों के लिए ताजा या संग्रहीत किया जा सकता है, हालांकि प्रतिक्रिया की गुणवत्ता पहले दिन से परे लंबे समय तक भंडारण के साथ उत्तरोत्तर नीचा दिखाएगी।
  2. भूसी और रेशम निकालें। या तो आधार या कान के शीर्ष में एक संभाल डालें। हैंडल संदंश, पेचकश आदि की एक जोड़ी हो सकती है।
  3. कानों को एक बड़े कंटेनर में रखें (उदाहरण के लिए, 2 एल बीकर हैंडल के साथ ऊपर की ओर, कंटेनर को डिइंफेक्शन समाधान से भरें। डिइंफेक्शन समाधान 20% वाणिज्यिक ब्लीच (1.65% सोडियम हाइपोक्लोराइट) का 1.8 एल और सर्फेक्टेंट ट्वीन 20 की कुछ बूंदें हैं।
  4. एक लैमिनार प्रवाह पीठ के अंदर कानों को स्टरलाइज करें। 20 मिन के बाद, ब्लीच समाधान खाली करें और बाँझ आसुत पानी की उदार मात्रा का उपयोग करके कान 3x (5 मिन प्रत्येक) को कुल्ला करें। पानी निकालें और कान ों को कई मिनट तक सूखने दें।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि कान पूरी तरह से 20 मिनट के लिए ब्लीच समाधान में जलमग्न हो । हवा के बुलबुले को उखाड़ फेंकने के लिए कभी-कभी ब्लीच समाधान में कानों को ध्यान से इधर-उधर ले जाएं ।
  5. 700A तरल माध्यम से भरा एक 2 mL माइक्रोसेंट्रोफ्यूज ट्यूब तैयार करें। इस ट्यूब का इस्तेमाल अपरिपक्व भ्रूण को इकट्ठा करने के लिए किया जाएगा।
  6. कान लें और बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके, एंडोस्पर्म को बेनकाब करने के लिए गिरी मुकुट के शीर्ष 1-2 मिमी को हटा दें। अपरिपक्व जाइगोटिक भ्रूण (IZE) को हटाने के लिए माइक्रो स्पैटुला का उपयोग करें। इज़ गिरी के भीतर स्थित होगा, कान की नोक का सामना कर रहे पक्ष पर, और कोख के लिए लगाव के पास। स्पैटुला का उपयोग करके, इसे भ्रूण से दूर पेरिकार्प में एंडोस्पर्म में डालें, फिर एंडोस्पर्म को उखाड़ फेंकने के लिए धीरे-धीरे ऊपर की ओर मोड़ें और भ्रूण को हटाने की अनुमति दें(चित्रा 2)।
  7. स्पैटुला का उपयोग करके, भ्रूण को 700A तरल माध्यम वाली ट्यूब में स्थानांतरित करें। जब तक 100 भ्रूण एकत्र नहीं हो जाते तब तक ऐसा करना जारी रखें। अगले कदम पर आगे बढ़ने से पहले कई ट्यूब (~ १०० भ्रूण/ट्यूब) भरे जा सकते हैं । इस बिंदु पर, एग्रोबैक्टीरियम निलंबन तैयार किया जाना चाहिए (चरण 3.5 देखें)।
  8. भ्रूण ट्यूब से 700A तरल माध्यम को 1 मिलील पिपेट के साथ निकालें। भ्रूण धोने के लिए ताजा 700A माध्यम जोड़ें, तो उस मीडिया के रूप में अच्छी तरह से हटा दें ।
  9. 30 एस या इनवर्ट ट्यूब 12x-15x मिश्रण करने के लिए एक कम सेटिंग (3/10) पर एग्रोबैक्टीरियम निलंबन और भंवर के 1 एमएल जोड़ें । इस ट्यूब को 5 मिन के लिए बेंच पर क्षैतिज रूप से आराम करने की अनुमति दें।
  10. 5 मिन के बाद, भ्रूण और एग्रोबैक्टीरियम निलंबन की पूरी ट्यूब को 562V सह-खेती माध्यम(तालिका 1)की एक प्लेट पर स्थानांतरित करें। यह बेंच पर थाली रखकर और जल्दी से थाली पर ट्यूब सामग्री डालने से प्राप्त किया जा सकता है । धीरे-धीरे भ्रूण वितरित करने के लिए प्लेट को भंवर करें और 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके एग्रोबैक्टीरियम निलंबन को हटा दें।
  11. सुनिश्चित करें कि भ्रूण को ऊपर की ओर सामना करने वाले स्कूटेलम (गोल) साइड के साथ रखा गया है। यदि आवश्यक हो तो आवर्धक ग्लास या विच्छेदन के दायरे का उपयोग करें। प्लास्टिक के बक्से (19 सेमी x 28 सेमी x 5.1 सेमी) में प्लेटें रखें और रात भर प्लेटों को अंधेरे में 21 डिग्री सेल्सियस पर 16-18 घंटे में इनक्यूबेट करें। पैराफिन फिल्म या वेंट टेप का उपयोग करके कोई व्यक्तिगत प्लेट लपेटना आवश्यक नहीं है।
  12. रात भर सह-खेती के बाद, संक्रमित भ्रूण, स्कूटेलम साइड को ऊपर ले जाएं, मध्यम 605T(टेबल 1)आराम करने पर। प्रति प्लेट 30 भ्रूण के आसपास रखें। प्लेटों को अंधेरे में 26-28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  13. 4-10 दिनों के लिए इनक्यूबेट (7 दिन पसंद किया जाता है)। इस समय, दैहिक भ्रूण के विकास को जाइगोटिक स्कूटेलम(चित्रा 3)की सतह पर देखा जा सकता है।

5. चयन, गर्मी उपचार, और उत्थान

  1. आराम की अवधि के बाद, गर्मी भ्रूण को झटका देता है। 2 घंटे के लिए 70% सापेक्ष आर्द्रता के साथ 45 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में भ्रूण की प्लेटों वाले बॉक्स को रखें। इसके बाद बॉक्स को 45 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से निकालकर 26-28 डिग्री सेल्सियस डार्क इनक्यूबेटर में 1-2 घंटे के लिए रखें।
    नोट: यदि एक इनक्यूबेटर में 70% आर्द्रता प्राप्त करने में असमर्थ है, तो प्लेट बॉक्स के नीचे ऑटोक्लेव पेपर तौलिए की एक डबल लेयर जोड़ें और बॉक्स के भीतर आर्द्रता बनाए रखने के लिए ऑटोक्लेव पानी से भिगोएं। कागज तौलिए के ऊपर बॉक्स में प्लेटें वापस करें और 45 डिग्री सेल्सियस पर रखने से पहले ढक्कन को सील करें। तापमान और आर्द्रता की निगरानी के लिए एक छोटे से डिजिटल हाइग्रोमीटर/थर्मामीटर का उपयोग करें।
  2. गर्मी से इलाज IZEs आराम माध्यम से शूट गठन माध्यम (13329A) जिसमें 0.05 मिलीग्राम/एल इमाज्पीर को चयनात्मक एजेंट(तालिका 1)के रूप में स्थानांतरित करें। स्थानांतरित करते समय, कोलोपटाइल्स को हटा दें, यदि मौजूद हैं, तो ठीक टिप संदंश या सर्जिकल कैंची का उपयोग करके।
  3. भीड़ से बचने के लिए प्रति प्लेट 10-15 भ्रूण रखें। भ्रूण को 26 डिग्री सेल्सियस डार्क इनक्यूबेटर में 2 हफ्ते तक इस माध्यम में रखें।
  4. भ्रूण को पक्ष मध्यम (13158) में स्थानांतरित करें; तालिका 1) 1-2 सप्ताह के लिए। एक प्रकाश कक्ष या प्रकाश कक्ष (16 दिन/8 रात, 20-150 μmol/m2/s)में प्रति प्लेट आठ टुकड़े रखें और 27 डिग्री सेल्सियस पर।
  5. जैसे-जैसे प्लांटलेट विकसित होते हैं, दोनों शूटिंग और जोरदार जड़ों वाले मजबूत पौधे मध्यम पक्ष की नई प्लेटों पर रखें, प्रति प्लेट एक पौधा रखें। यह मजबूत प्लांटलेट विकास के लिए अनुमति देगा । प्लेटों को दूसरे 7-14 दिनों के लिए लाइट रूम या लाइट चैंबर में रखें।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि यह माध्यम के साथ अच्छे संपर्क में है, प्लांटलेट से जुड़े किसी भी कॉलस टुकड़ों को सावधानी से हटा दें।
  6. जैसे-जैसे पौधा अधिक जोरदार हो जाता है, पौधे को पक्ष माध्यम से हटा दें और आगर को हटाने के लिए नल के पानी से जड़ों को कुल्ला एं।
  7. 2में 3 में व्यक्तिगत पौधों प्रत्यारोपण (~ 19 सेमी2)एक पूर्व गीला मिट्टी रहित सब्सट्रेट युक्त बर्तन । बर्तनों को एक ट्रे (27 सेमी x 54 सेमी) में नाली छेद के साथ रखें और फ्लैट को प्लास्टिक आर्द्रता गुंबद के साथ कवर करें। इस अनुकूलन कदम को या तो विकास कक्ष में या ग्रीनहाउस में प्राप्त किया जा सकता है जिसमें ऊपर धारा 2 (चरण 2.1) में वर्णित विकास स्थितियों के साथ।

6. ग्रीनहाउस के लिए प्रत्यारोपण और T1 बीज के उत्पादन

  1. प्रतिदिन 2x पौधों की जांच करें। जरूरत के अनुसार पानी। सुनिश्चित करें कि पौधों को न तो सूख रहे हैं और न ही पानी में पानी भर रहे हैं। थोड़ा सूखा सब्सट्रेट बनाए रखना रूट ग्रोथ को प्रोत्साहित करता है ।
    नोट: आर्द्रता गुंबद प्रत्यारोपण के 4-7 दिनों के बाद हटाया जा सकता है। पौधों को इन छोटे बर्तनों में तब तक उगाया जाना चाहिए जब तक कि वे प्रत्यारोपण के तनाव से मिट्टी तक नहीं वसूल े। इसमें लगभग 9-14 दिन का समय लगना चाहिए।
  2. पूरे मिट्टी के प्लग और प्लांटलेट को 1.5 लड़की (5.9 एल) पॉट में ट्रांसप्लांट करें। ग्रीनहाउस और पानी में बनाए रखें जब मिट्टी स्पर्श करने के लिए सूखी महसूस करता है।
  3. बर्तन में 15-9-12 के एन-पी-के के साथ एक नियंत्रित रिलीज उर्वरक जोड़ें, जिसे या तो सब्सट्रेट मिश्रण में शामिल किया जा सकता है या सतह पर लागू किया जा सकता है।
  4. जब पौधे से कान की शूटिंग निकलने लगती है, तो कान की शूटिंग को कवर करने के लिए शूट बैग का उपयोग करें। एक बैग का उपयोग करना सुनिश्चित करें जो अर्ध-पारदर्शी हो ताकि उभरते रेशम बैग को हटाए बिना देखे जा सकें। शूट बैग नियंत्रित परागण होने की अनुमति देता है। यह हमेशा बैग ट्रांसजेनिक लटकन के लिए महत्वपूर्ण है।
  5. रेशम निकलने के बाद (1-2 दिन), उभरा रेशम को एक समान लंबाई तक ट्रिम करें। यह भूसी के पत्तों के ऊपर से लगभग 2.5 सेमी नीचे होगा। साफ कैंची की एक जोड़ी है कि 70% इथेनॉल में निष्फल किया गया है का प्रयोग करें। रेशम की ट्रिमिंग करके, परागण होने के लिए अगले दिन एक समान टफ्ट विकसित होता है।
  6. मक्का जीनोटाइप के बहुमत के लिए, परागण के लिए इष्टतम समय लटकन या रेशम उद्भव के 2-3 दिनों के बाद है।
  7. पराग को या तो उसी पौधे (यदि स्वयं परागण किया जा रहा है) से या एक ही नस्ल के जंगली प्रकार से (यदि आउटक्रॉसिंग या क्रॉसिंग) से एकत्र करें।
  8. एक लटकन बैग में पराग को इकट्ठा करें और इसे टी0 पौधे के रेशम के गुच्छे पर लगाएं। यदि पराग जंगली प्रकार (नॉन-ट्रांसजेनिक) पौधे से है, तो पराग को एक सादे भूरे रंग के लटकन बैग में रखें। यदि पराग ट्रांसजेनिक पौधे से है, तो पराग को हरे धारीदार बैग में रखें ताकि यह इंगित किया जा सके कि पराग ट्रांसजेनिक है।
  9. परागण विवरण के लिए चरण 2.5-2.10 का पालन करें।
  10. परागण के लगभग 2 सप्ताह बाद, कानों से लटकन बैग निकालें, और सूखी-नीचे शुरू करने की अनुमति दें। सूखने में मदद करने के लिए, परागण के 21-25 दिनों बाद पौधे को पानी देना बंद करें। बीज को बेनकाब करने के लिए आप भूसी के पत्तों को भी वापस खींच सकते हैं। यह अभ्यास मोल्ड को रोकने में भी मदद करता है।
  11. परागण के करीब 45 दिन बाद फसल के बीज और कोल्ड स्टोरेज में 4-12 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

Representative Results

यहां प्रदर्शन किया गया है एग्रोबैक्टीरियमके लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल-तीन सार्वजनिक मक्का inbred लाइनों (B73, Mo17, और W22) के आनुवंशिक परिवर्तन है कि मक्का आनुवंशिकी के क्षेत्र में महत्वपूर्ण रहा है । पारंपरिक मक्का परिवर्तन प्रोटोकॉल5का उपयोग करके तीनों इननस्ल लाइनों का परिवर्तन प्राप्त नहीं किया जा सका । चित्रा 1 और चित्रा 2 क्रमशः निर्माण और शुरू सामग्री, यहां इस्तेमाल दिखाते हैं । कान आम तौर पर परागण के बाद 9-12 दिन काटा जाता है। 1.5-2.0 मिमी के बीच की लंबाई वाले आईजेडइस प्रोटोकॉल(चित्र ा 2)के लिए परिवर्तन के लिए सबसे अच्छे एक्सप्लांट हैं।

संक्रमण के आठ दिन बाद, ZsGreen-दैहिकभ्रूण व्यक्त एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप(चित्रा 3)के GFP चैनल के तहत कल्पना की गई । संक्रमित IZEs संक्रमण के 8 दिन बाद गर्मी उपचार के अधीन थे (कदम ५.१ और ५.२) । इस उपचार ने सीआरई पुनर्संयोजन की अभिव्यक्ति को प्रेरित किया जो बीबीएम, वु2, क्रेऔर जेडएसग्रीन अभिव्यक्ति कैसेट को दो लोक्सपी साइटों(चित्र ा 1)के बीच घिरा हुआ था। गर्मी का इलाज ऊतकों तो गोली मार गठन मध्यम पर सुसंस्कृत थे जिसमें मॉर्फोजेनिक जीन हटाने के बाद परिवर्तित ऊतकों के चयन के लिए शाकनाशी इमाजापाइर शामिल थे ।

परिपक्व भ्रूण या गोली मार कलियों कि imazapyr के लिए प्रतिरोधी थे के साथ ऊतकों का प्रसार संक्रमण के बाद 3-4 सप्ताह के आसपास मनाया गया(चित्रा 4)। कुछ imazapyr प्रतिरोधी ऊतकों ZsGreen के लिए नकारात्मक थे, सुझाव है कि सीआरईमध्यस्थता एक्सिजन की संभावना इन ऊतकों में हुई(चित्रा 4)। ऊतकों को मध्यम और हल्के ऊष्मायन को पक्ष में ले जाने के बाद, शूटिंग विकसित होना शुरू हो गई(चित्रा 5)। अच्छी तरह से विकसित जड़ों के साथ स्वस्थ और जोरदार बढ़ती शूटिंग काटा गया(चित्रा 5)। कुछ ऊतकों में कई शूट(चित्रा 5ई, एफ, जी)दिखाई दिए। इस प्रकार के "घास" रेजेंयंट समान ट्रांसजीन एकीकरण पैटर्न वाले क्लोनल पौधों के कारण हो सकते हैं। इन पौधों को जीनोटाइप करने के लिए आणविक जैविक विश्लेषण की आवश्यकता होती है।

सभी तीन सार्वजनिक inbred लाइनों अच्छी तरह से इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इस काम में इस्तेमाल निर्माण का जवाब दिया । W22 ने लगभग 14% (प्रति 100 संक्रमित अपरिपक्व भ्रूण ों की आवृत्ति के साथ, imazapyr-प्रतिरोधी शूटिंग की उच्चतम आवृत्ति का उत्पादन किया)। B73 और Mo17 दोनों ने लगभग 4% ट्रांसजेनिक शूट का उत्पादन किया। ये आवृत्तियां सभी ट्रांसजेनिक शूट का संकेत देती हैं, जिनमें सीआरई-मध्यस्थता वाले एक्सिजन द्वारा हटाए गए मॉर्फोजेनिक जीन और पौधों के साथ मॉर्फोजेनिक जीन और पौधों को ले जाने वाले दोनों पौधे शामिल हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: बाइनरी प्लाज्मिड PHP81430 के टी-डीएनए क्षेत्र का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। आरबी = सही टी डीएनए सीमा; लोक्सपी = सीआरई लक्ष्य साइट को फिर से जोड़ना; एक्सीजी1प्रो:Wus2 = मक्का ऑक्सिन-प्रेरक प्रमोटर(Zm-Axig1)+ Zm-Wus2 + मक्का In2-1 टर्मिनेटर; पीएलटीपीप्रो:Zm-Bbm = मक्का फॉस्फोलिपिड ट्रांसफरेज प्रोटीन(Zm-Pltp)प्रमोटर + Zm-Bbm + चावल T28 टर्मिनेटर(ओएस-टी-28); एचएसपीप्रो:क्रे = मक्का हीट शॉक प्रोटीन 17.7 प्रमोटर(जेडएम-एचएसपी17.7)+ क्रे रिकॉम्बिनेज जीन + आलू प्रोटीनेज अवरोधक II(pinII)टर्मिनेटर; यूबीआईप्रो:ZsGreen = ज्वार सर्वव्यापी प्रमोटर/intron(एसबी-Ubi)+ ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन ZsGreen जीन + चावल सर्वव्यापी टर्मिनेटर(ओएस-Ubi); एचआरए कैसेट = ज्वार एसीटोलेक्टाज़ सिंथासे(एसबी-अल्स)प्रमोटर + मक्का एचआरए(जेडएम-एचआरए)जीन + पिनी टर्मिनेटर; पौंड = बाएं टी डीएनए सीमा; colE1, प्लाज्मिड ColE125की प्रतिकृति मूल ; स्पेक्ट्नोमाइसिन प्रतिरोधी जीन aadA1 से Tn21 से जीवाणु चयन26के लिए; एग्रोबैक्टीरियम राइजोजीन27के pRiA4 से प्रतिनिधि ए, बी, सी = प्रतिकृति मूल । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: सामग्री शुरू करना। B73 कान काटा 12 दिन के बाद परागण(ए)। B73(B),Mo17(C),और W22(डी)के अपरिपक्व भ्रूण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: आराम मध्यम 1 सप्ताह के बाद संक्रमण पर ऊतक विकास । भ्रूण (8 दिन के बाद संक्रमण) एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप (GFP फिल्टर) के तहत GFP Mo17(ए)और W22(बी)के दैहिक भ्रूण व्यक्त दिखा । उज्ज्वल क्षेत्र(सी)और जीएफपी फिल्टर(डी)के तहत ऊतक (B73) का विकास करना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: चयन के साथ परिपक्वता माध्यम पर ऊतक विकास। एक W22 परिपक्वता प्लेट(ए)। उज्ज्वल क्षेत्र(बी)और जीएफपी फिल्टर(सी)के तहत ऊतक (Mo17, 15 दिन के बाद संक्रमण) का विकास करना। उज्ज्वल क्षेत्र(डी)और जीएफपी फिल्टर(ई)के तहत ऊतक (Mo17, 28 दिनों के बाद संक्रमण) का विकास करना। तीर उन ऊतकों को पुनर्जीवित करने की ओर इशारा करते हैं जिनमें जीएफपी अभिव्यक्ति की कमी है, जो गर्मी से प्रेरित सीआरई प्रोटीन गतिविधि के बाद लोक्सपी साइटों के बीच जेडग्रीन जीन के एक्सिजन का सुझाव देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: पक्ष मीडिया पर ऊतक विकास । W22(A),B73(B),और Mo17(सी, डी)की शूटिंग । B73(ई)और W22(एफ, जी)के कई शूट (घास के रेजेनेरेंट) के साथ घटना। B73(एच)और W22(I)की जड़ों के साथ गोली मारता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 1: मक्का परिवर्तन के लिए मीडिया रचनाएं। कृपया इस तालिका को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

Discussion

मक्का परिवर्तन के लिए पारंपरिक प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक कॉलस ऊतक का उत्पादन करने के लिए अपरिपक्व जाइगोटिक भ्रूण को अलग करने के प्रतिमान का पालन करते हैं, जो उपजाऊ पौधों में पुनर्जीवित होता है4,6। हालांकि यह प्रभावी है, कॉलस आधारित प्रोटोकॉल समय लेने वाला हो सकता है, और अक्सर ऊतक संस्कृति प्रक्रिया के लिए पौधों का उत्पादन करने में 3 महीने तक का समय लगता है। क्या यहां प्रस्तुत विधि महत्वपूर्ण बनाता है कि यह callus मुक्त, कुशल, जल्दी है, और लगभग आधी समय सीमा में T0 पौधों के उत्थान के लिए अनुमति देता है । यह भी कम जीनोटाइप पर निर्भर प्रतीत होता है और इस प्रकार सबसे सार्वजनिक रूप से उपलब्ध inbreds8,11के लिए प्रभावी हो सकता है ।

हालांकि सभी कदमों का प्रभावी ढंग से पालन किया जाना चाहिए, सही विकास मीडिया की तैयारी जरूरी है । विकास मीडिया घटकों को सही चरणों में जोड़ने की जरूरत है, दोनों पूर्व और बाद ऑटोक्लेव, यह सुनिश्चित करने के लिए कि संयंत्र सामग्री रसायनों की उचित एकाग्रता प्राप्त करता है । इससे यह सुनिश्चित होगा कि एंटीबायोटिक ्स जैसे संवेदनशील यौगिक टूट न ें। यह भी महत्वपूर्ण है कि पौधे की सामग्री को प्रत्येक चरण में सही विकास माध्यम पर रखा जाता है, जैसा कि प्रोटोकॉल में संकेत दिया गया है। उचित विकास माध्यम पर सामग्री नहीं रखने से भौतिक मृत्यु हो सकती है। इसके अलावा, बहुत सारे भ्रूण रखने या प्लेटों पर ऊतकों को विकसित करने से बचा जाना चाहिए। जबकि दो बार के रूप में कई ऊतक टुकड़े रखने रसायनों और पेट्री व्यंजन (और यहां तक कि इनक्यूबेटर अंतरिक्ष) की लागत को बचा सकता है, भीड़ प्लेटों में ऊतक के विकास को गंभीरता से बाधित किया जा सकता है । संक्रमण को अंजाम देते समय यह सुनिश्चित किया जाना चाहिए कि एग्रोबैक्टीरियम निलंबन का ऑप्टिकल घनत्व उपयुक्त हो। यदि बैक्टीरियल निलंबन घनत्व बहुत कम है, तो उचित संक्रमण नहीं हो सकता है।

परिवर्तन प्रोटोकॉल में सफलता के लिए सामग्री शुरू करने की गुणवत्ता आवश्यक है। भ्रूण विच्छेदन के लिए उपयोग किए जाने वाले कान स्वस्थ होने चाहिए, जिसका अर्थ है कि उन्हें पैदा करने वाला पौधा स्वस्थ है। उनके पास पर्याप्त बीज सेट होना चाहिए और कीट-और रोग मुक्त होना चाहिए। साथ ही पुराने एग्रोबैक्टीरियम का भी इस्तेमाल नहीं करना चाहिए। "मां" थाली 2 सप्ताह से अधिक पुरानी नहीं होनी चाहिए। इस बिंदु के बाद, एक नई "मां" थाली नए प्रयोगों को शुरू करने के लिए लकीर होनी चाहिए ।

हालांकि इस विधि को जीनोटाइप पर निर्भर कम दिखाया गया है, लेकिन यह नहीं माना जा सकता कि सभी लाइनें समान रूप से सफल होंगी। अभी भी लाइनों के बीच भिन्नता के साथ-साथ उपयोग किए जा रहे निर्माण के आधार पर सफलता में अंतर हो सकता है। अपरिपक्व भ्रूण के साथ काम करते समय कान से कान परिवर्तनशीलता भी अपरिहार्य है, इसलिए आदर्श प्रयोगों को इसके लिए कई कानों का उपयोग करना चाहिए। इस काम में, inbred W22 ने ~ 14% से अधिक परिवर्तन आवृत्ति के साथ सबसे अच्छा प्रदर्शन किया, इसके बाद B73 और Mo17 (~ 4% प्रत्येक) । लोव एट अल8 B73 और Mo17 परिवर्तन के लिए QuickCorn प्रोटोकॉल का उपयोग कर की सूचना दी । इस काम में, परिवर्तन आवृत्तियों B73 के लिए 9%-50% से लेकर और Mo17 के लिए 15%-35% ।

इस काम में मनाए गए B73 और Mo17 के लिए कम परिवर्तन आवृत्तियों के लिए एक संभावना मौसमी कान की गुणवत्ता में उतार-चढ़ाव के लिए जिम्मेदार हो सकती है। इस काम और लोव एट अल के बीच एक और अंतरयह है कि यहां विभिन्न वेक्टर निर्माण का उपयोग किया गया था। लोव के काम में, रूपांतरित पौधों से मॉर्फोजेनिक जीन नहीं हटाए गए बल्कि बाद के चरणों में विकासपूर्वक खामोश हो गए । इस काम में संक्रमण के 8 दिन बाद मॉर्फोजेनिक जीन को हटा दिया गया। यह संभव है कि B73 और Mo17 दैहिक भ्रूण के विकास के लिए Bbm/Wus2 की एक लंबी उपस्थिति की आवश्यकता हो सकती है ।

इस विधि का उपयोग करके, गैर-ट्रांसजेनिक एस्केप प्लांट, मल्टीमेरिक सम्मिलन और अनएक्साइज्ड ट्रांसजीन प्राप्त करने की संभावना है। इन पौधों में एक काफ़ी अलग फेनोटाइप नहीं होगा, इसलिए पीसीआर द्वारा पता लगाने के लिए यह निर्धारित करना आवश्यक है कि कोई संयंत्र ट्रांसजेनिक है या नहीं। इसे पूरा करने के लिए, उत्पादित क्षेत्र के भीतर पीसीआर प्राइमर और उत्पादित क्षेत्र को फ्लैंक करने वाले प्राइमर को नियोजित किया जा सकता है। कई स्वतंत्र परिवर्तनों को भी एक ही अपरिपक्व भ्रूण से पौधों का उत्पादन कर सकते हैं, कुल स्वतंत्र परिवर्तनीय वसूली दर का निर्धारण मुश्किल बना रही है । हमारा मानक प्रत्येक अपरिपक्व भ्रूण से एक पौधे के नमूने के आधार पर एक परिवर्तन दर की गणना करने के लिए किया गया है जो पौधों का उत्पादन करता है और संक्रमित भ्रूण की संख्या से इसे विभाजित करता है। यह विधि लगभग निश्चित रूप से पौधों के रूप में बरामद स्वतंत्र घटनाओं की वास्तविक संख्या को कम आंकती है। एक ही भ्रूण से स्वतंत्र घटनाओं के बीच भेदभाव ट्रांसजीन के आसपास सीमावर्ती क्षेत्रों अनुक्रमण की आवश्यकता है, और यह निषेधात्मक महंगा है और सबसे अनुप्रयोगों के लिए समय लेने वाला होगा; हालांकि, ऐसे मामले हो सकते हैं जिनमें ये डेटा उपयोगी होते हैं।

ऊतक संस्कृति परिवर्तन की यह विधि बहुत प्रभावी साबित हुई है, लेकिन समस्याएं अभी भी हो सकती हैं। यदि पौधे की सामग्री का जवाब नहीं दे रहा है, तो यह संभव है कि विशेष रूप से नस्ल रेखा के साथ एक मुद्दा हो, सुझाव है कि विकास मीडिया संरचना और सबकुलाइजिंग के समय जैसे चरों को समायोजन की आवश्यकता होती है। यदि मूल वेक्टर को बदल दिया जाता है, तो एक अन्य चर उचित वेक्टर डिजाइन और सटीक वेक्टर निर्माण है। imazapyr संवेदनशीलता के साथ मुद्दे भी हो सकते हैं, क्योंकि कुछ लाइनें दूसरों की तुलना में अधिक संवेदनशील हैं, और सफलतापूर्वक रूपांतरित पौधों को प्राप्त करने के लिए imazapyr की एकाग्रता को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।

पिछले 30 वर्षों में, मक्का ऊतक संस्कृति और परिवर्तन प्रोटोकॉल बदल गया है और प्रगति की है; और यह माना जाता है कि इस छोटा प्रोटोकॉल आगे इस प्रगति होगा। यह विधि अकादमिक सेटिंग्स के लिए प्रभावी है क्योंकि यह पारंपरिक तरीकों की तुलना में कम समय लेने वाली है। इसके अलावा, यह उच्च प्रशिक्षित ऑपरेटरों की मांग नहीं करता है, जिससे पारंपरिक तरीकों की तुलना में व्यापक वितरण के लिए इसे अधिक उत्तरदायी बना दिया जाता है। भविष्य में, इस विधि को जीनोम इंजीनियरिंग जैसी नई प्रौद्योगिकियों के साथ जोड़ा जा सकता है।

Disclosures

एलिसिया मास्टर्स, विलियम गॉर्डन-काम, और टोड जोंस Corteva कृषि विज्ञान के कर्मचारी है कि प्रोटोकॉल और B73, Mo17, और W22 इस लेख में इस्तेमाल के मक्का कान की आपूर्ति कर रहे हैं । लेखक मिंजेंग कांग, मॉर्गन मैककै, जैकब जोब्रिस्ट और कान वांग के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम मक्का अपरिपक्व कान प्रदान करने के लिए Corteva ग्रीनहाउस टीम का शुक्रिया अदा करते हैं, मीडिया बनाने में सहायता प्रदान करने के लिए Corteva मीडिया तैयारी प्रयोगशाला, एग्रोबैक्टीरियम निर्माण के साथ मदद के लिए Corteva से निंग वांग, और सहायता के लिए आयोवा राज्य विश्वविद्यालय से Keunsub ली । इस परियोजना को आंशिक रूप से राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन संयंत्र जीनोम अनुसंधान कार्यक्रम अनुदान 1725122 और 1917138 द्वारा केडब्ल्यू को, भविष्य कहनेवाला संयंत्र फेनोमिक्स रिसर्च ट्रेनीशिप प्रोग्राम (नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रांट डीजेई-1545453) द्वारा जेजेड को, यूएसडीए एनआईएफए हैच परियोजना द्वारा #IOW04341, आयोवा फंड के राज्य द्वारा, और आयोवा राज्य विश्वविद्यालय के क्रॉप बायोइंजीनियरिंग सेंटर द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,4-D Millipore Sigma D7299
6-Benzylaminopurine (BAP) Millipore Sigma B3408
Acetosyringone Millipore Sigma D134406
Agar Millipore Sigma A7921
Aluminum foil To cover the flask
Ammonium Sulfate Millipore Sigma A4418
Analytical balance To weigh small quantities of chemicals
Autocalve Primus (Omaha, NE) PSS5-K To autoclave media and tools
Bacterial culture loop (10 µl) Fisher scientific 22-363-597 Collects Agrobacterium from plate to transfer to liquid
Bactoagar BD bioscience 214030
Beakers (1 L, 2 L, 4 L) To mix the chemicals for media
Benomyl Millipore Sigma #45339
Bleach (8.25% Sodium Hypochlorite) Clorox For seed sterilization
Boric Acid Millipore Sigma B6768
Calcium Chloride Dihydrate Millipore Sigma C7902
Carbenicillin Millipore Sigma C3416
Casein Hydrolysate Phytotech C184
Cefotaxime Phytotech C380
Conical tube (50 mL) Fisher scientific 06-443-19 Contain liquid medium and Agro suspension
Cuvette (Semi-micro) Fisher scientific 14955127 To hold liquid for measuring OD
Dicamba Phytotech D159
Digital hygrometer Checking temperature and humidity for heat treatment
EDTA, Disodium Salt, Dihydrate Millipore Sigma 324503
Eppendorf tube (2.0 mL) ThermoFischer Scientific AM12475
Eriksson's Vitamins Phytotech E330 1000x in liquid
Ethanol (70%) Sterilizing tools and surfaces
Ferrous Sulfate Heptahydrate Millipore Sigma F8263
Fertilizer, Osmocote Plus 15-9-12 ICL Specialty Fertilizers (Dublin, OH) A903206 Fertilizer
Flask (2 L) Pyrex 10-090E To autoclave media and tools
Flats (Standard 1020, open w/holes, 11"W x 21.37"L x 2.44"D) Hummert International (Earth City, Mo) 11300000 Tray to hold soil and pot insert, fits Humidome
Forceps (fine-tipped and large) Fine for handling embryos; larger for large plant materials and use as ear holders
Gentamicin Gold Biotechnologies G-400
Glass bottle (1 L) Pyrex 06-414-1D To autoclave medium
Graduated cylinder To adjust volume of media
Imazapyr Millipore Sigma 37877
Incubator, 20 °C Percival Scientific Model I-36NL To grow mother plate and incubate embryos during Agro infection
Incubator, 27 °C Percival Scientific Model I-36NL To grow co-cultivation plate and maize embryo culture
Incubator, 45 °C Heat shock treatment
Insert TO Standard, pots Hummert International (Earth City, Mo) 11030000 For transplanting plants from rooting to soil, fits flat and Humidome
Laminar flow hood Maintains sterile conditions
L-proline Phytotech P698
Magnesium Sulfate Heptahydrate Millipore Sigma M1880
Maize inbred seed B73 U.S National Plant Germplasm id=47638
Maize inbred seed Mo17 U.S National Plant Germplasm id=15785
Maize inbred seed W22 U.S National Plant Germplasm id=61755
Manganese Sulfate Monohydrate Millipore Sigma M7899
Milli-Q Water purification systems Millipore sigma MILLIQ For tissue culture grade water
MS Basal Medium Millipore Sigma M5519
MS Basal Salt Mixture Millipore Sigma M5524
N6 Basal Salt Mixture Millipore Sigma C1416
Paperclips, non-skid Holding on tassel bags
Peptone BD bioscience 211677
Petri dish (100x15 mm) Fisher scientific FB0875713 For bacteria culture medium
Petri dish (100x25 mm) Fisher scientific FB0875711 For the plant tissue culture medium
pH meter Fisher scientific AB150 To adjust pH of media
Pipette (1 mL) ThermoFischer Scientific 4641100N
Plastic Boxes The Container Store 10048430 For tissue culture storage and incubation
Plastic humidy dome (Humi-Dome) Hummert International (Earth City, Mo) 14385100 Plastic cover for soil flat
Potassium Iodide Millipore Sigma 793582
Potassium Nitrate Millipore Sigma P8291
Potassium Phosphate Monobasic Millipore Sigma P5655
Scale To weigh chemicals for media
Scalpel Blade (No. 11, 4 cm) Thermo Scientific 3120030 remove the top of the kernel crowns for embryo dissection
Scalpel handle Holding scalpel blades
Schenk & Hildebrandt Vitamin (S&H vitamin) Phytotech S826 100x powder
Scissors Cutting ear shoots
Shoot bag (Canvasback- semi-transparent) Seedburo (Des Plaines, IL) S26 Semi-transparent bag to cover ear shoots
Silver Nitrate Millipore Sigma S7276
Sodium Molybdate Dihydrate Millipore Sigma M1651
Soiless substrate LC1 SunGro Horticulture (Agawam, Ma) #521 For growing maize plants
Spatula (Double Ended Micro-Tapered) Fischer Scientific 2140110 Dissecting embryos from kernels
Spatula (with spoon) Fisher scientific 14-375-10 To measure chemicals for media
Spectinomycin Millipore Sigma S4014
Spectrophotometer (Genesys 10S UV-Vis) Thermo Scientific 840-300000 Measure OD of Agro suspension
Stirring bar Fisher scientific 14-513-67 To mix media
Stirring hotplates To mix media
Syringe (without needle, 60 mL) Fisher scientific 14-823-43 For filter sterilization
Syringe filter (0.22 µm) Fisher scientific 09-720-004 For filter sterilization
Tassel bag (Canvasback- brown) Seedburo (Des Plaines, IL) T514 Bag to cover tassels of non-transgenic plants
Tassel bag (Canvasback-green stripe) Seedburo (Des Plaines, IL) T514G Bag to cover tassels of transgenic plants
Thiamine HCl Phytotech T390
Thidiazuron Phytotech T888
Thymidine Millipore Sigma T1895
Timentin Phytotech T869
Tween 20 Fisher Scientific Cas #9005-64-5 surfactant
Vortex Genie 2 Scientific Industries SI0236 Homogenizes liquids (Agro suspension)
Water bath (large - Precision model 186) Fisher scientific any that can fit 4+ 2L flasks and reach 55 °C Keeps autoclaved media at optimal temperature
Weigh dish Fisher scientific 08-732-112 To measure chemicals for media
Weighing paper Fisher scientific 09-898-12A To measure chemicals for media
Yeast Extract Fisher Scientific BP14222
Zeatin Millipore Sigma Z0164

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References

  1. Zhao, Z. Y., et al. High throughput genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens in maize. Molecular Breeding. 8 (4), 323-333 (2002).
  2. Green, C. E., Phillips, R. L. Plant regeneration from tissue cultures of maize. Crop Science. 15 (3), 417-421 (1975).
  3. Ji, Q., Xu, X., Wang, K. Genetic transformation of major cereal crops. International Journal of Developmental Biology. 57, 495-508 (2013).
  4. Frame, B., Warnberg, K., Main, M., Wang, K. Maize (Zea mays, L). Agrobacterium Protocols. Wang, K. , 3rd edition, Springer, USA. 101-117 (2015).
  5. Frame, B., et al. Improved Agrobacterium-mediated transformation of three maize inbred lines using MS salts. Plant Cell Reports. 25 (1), 1024-1034 (2006).
  6. Que, Q., et al. Maize transformation technology development for commercial event generation. Frontiers in Plant Science. 5 (379), (2014).
  7. Lowe, K. S., et al. Morphogenic regulators Baby boom and Wuschel improve monocot transformation. The Plant Cell. 28 (9), 1998-2015 (2016).
  8. Lowe, K. S., et al. Rapid genotypes independent maize transformation via direct somatic embryogenesis. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 54 (3), 240-252 (2018).
  9. Boutilier, K., et al. Ectopic expression of BABY BOOM triggers a conversion from vegetative to embryonic growth. The Plant Cell. 14 (8), 1737-1749 (2002).
  10. Zuo, J., Niu, Q. W., Frugis, G., Chua, N. H. The WUSCHEL gene promotes vegetative-to-embryonic transition in Arabidopsis. The Plant Journal. 30 (3), 349-359 (2002).
  11. Jones, T. J., et al. Maize transformation using the morphogenic genes Baby Boom and Wuschel2. Transgenic Plants. Kumar, S., Barone, P., Smith, M. , 81-93 (2019).
  12. Anand, A., et al. An improved ternary vector system for Agrobacterium-mediated rapid maize transformation. Plant Molecular Biology. 97 (1-2), 187-200 (2018).
  13. Ray, K., et al. Mutant acetolactate synthase gene is an efficient in vitro selectable marker for the genetic transformation of Brassica juncea (Oilseed Mustard). Journal of Plant Physiology. 161 (9), 1079-1083 (2004).
  14. Green, J. M., Hale, T., Pagano, M. A., Andreassi, J. L. II, Gutteridge, S. A. Response of 98140 corn with gat4621 and hra transgenes to glyphosate and ALS-inhibiting herbicides. Weed Science. 57 (2), 142-148 (2009).
  15. An, G., et al. Functional analysis of the 3' control region of the potato wound-inducible proteinase inhibitor II gene. The Plant Cell. 1 (1), 115-122 (1989).
  16. Matz, M. V., et al. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nature Biotechnology. 17 (10), 969-973 (1999).
  17. Passarinho, P., et al. Target Genes Provide Diverse Entry Points into Cell Proliferation and Cell Growth Pathways. Plant Molecular Biology. 68 (3), 225-237 (2008).
  18. Bhyri, P., Khrishnamurthy, N., Narayanan, E., Nott, A., Sarangi, R. R. Novel plant terminator sequences. Patent Number US2014/0130205. , (2014).
  19. Laux, T., Mayer, K. F., Berger, J., Jürgens, G. The WUSCHEL gene is required for shoot and floral meristem integrity in Arabidopsis. Development. 122 (1), 87-96 (1996).
  20. Garnaat, C., Lowe, K., Roth, B. Zm-AXIG1-specific polynucleotides and methods of use. Patent Number WO2002006499. , (2002).
  21. Hershey, H. P., Stoner, T. D. Isolation and characterization of cDNA clones for RNA species induced by substituted benzenesulfonamides in corn. Plant Molecular Biology. 17 (4), 679-690 (1991).
  22. Abremski, K., Hoess, R. Bacteriophage P1 site-specific recombination. Purification and properties of the Cre recombinase protein. Journal of Biological Chemistry. 259 (3), 1509-1514 (1984).
  23. Sun, A. Q., et al. Cloning and Function Analysis of Small Heat Shock Protein Gene ZmHSP17.7 from Maize. ACTA Agronomica Sinica. 41 (3), 414 (2015).
  24. Sauer, B., Henderson, N. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (14), 5166-5170 (1988).
  25. Hershfield, V., Boyer, H. W., Yanofsky, C., Lovett, M. A., Helinski, D. R. Plasmid ColEl as a molecular vehicle for cloning and amplification of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3455-3459 (1974).
  26. Liebert, C. A., Hall, R. M., Summers, A. O. Transposon Tn21, flagship of the floating genome. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 63 (3), 507-522 (1999).
  27. Nishiguchi, R., Takanami, M., Oka, A. Characterization and sequence determination of the replicator region in the hairy-root-inducing plasmid pRiA 4b. Molecular and General Genetics. 206 (1), 1-8 (1987).

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JoVE में इस महीने अंक १५६ एग्रोबैक्टीरियम tumeफंस,B73 Bbm,आनुवंशिक परिवर्तन Mo17 QuickCorn ट्रांसजेनिक W22 Wus2, Zea Mays
<em>एग्रोबैक्टीरियम</em>-मध्यस्थ मक्का इंनस्ल लाइनों के एग्रोबैक्टीरियम -मध्यस्थता अपरिपक्व भ्रूण परिवर्तन मॉर्फोजेनिक जीन का उपयोग कर
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Masters, A., Kang, M., McCaw, M.,… More

Masters, A., Kang, M., McCaw, M., Zobrist, J. D., Gordon-Kamm, W., Jones, T., Wang, K. Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes. J. Vis. Exp. (156), e60782, doi:10.3791/60782 (2020).

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