Summary
该协议描述了一种在完整的活体动物中安装果蝇幼虫以实现超过10小时的不间断延时成像的方法。该方法可用于成像许多靠近幼虫体壁的生物过程。
Abstract
活成像是研究细胞生物学问题的宝贵方法。果蝇幼虫特别适合体内活体成像，因为幼虫体壁和大多数内部器官是透明的。然而，对完整果蝇幼虫进行超过30分钟的连续活成像一直具有挑战性，因为长期以来很难非侵入性的防活动幼虫。在这里，我们提出了一种称为LarvaSPA的幼虫安装方法，它允许对具有高时空分辨率的活果蝇幼虫进行连续成像，时间及空间分辨率超过10小时。此方法涉及使用紫外线反应胶将幼虫部分附着在盖玻片上，并使用聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 块额外限制幼虫运动。该方法与处于发育阶段的幼虫相容，从第二星到游荡第三星。我们演示了这种方法在研究果蝇体细胞感觉神经元的动态过程中的应用，包括树突生长和损伤引起的树突退化。该方法还可用于研究在幼虫体壁附近发生的许多其他细胞过程。
Introduction
延时实时成像是研究动态细胞过程的有力方法。延时电影提供的空间和时间信息可以揭示回答细胞生物学问题的重要细节。果蝇幼虫一直是一个流行的体内模型，用于使用活成像研究，因为它透明的体壁允许对内部结构1，2进行非侵入性成像。此外，在果蝇中，有许多遗传工具可用于荧光标记解剖结构和大分子3。然而，对果蝇幼虫进行长期延时成像具有挑战性。与静止的早期胚胎或幼虫不同，果蝇幼虫不断移动，需要固定进行活体成像。固定活果蝇幼虫的有效方法包括：用氯仿4安装在卤化碳油中，使用胶原素或二氯沃斯溶液5进行麻醉，以及压缩盖玻片和显微镜幻灯片6。虽然其中一些方法已用于显微镜，但没有一个对长期活成像有效。其他方法被开发成像身体壁神经元在爬行幼虫使用传统的共聚焦显微镜或光片显微镜7，8，9。然而，由于幼虫的运动，这些方法不是监测细胞动力学的理想方法。
开发了新的方法，以实现果蝇幼虫的长期延时成像。使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）"幼虫芯片"，果蝇幼虫可以通过真空产生的吸力在专用微室中有效固定，无需麻醉。然而，这种方法没有为细胞生物学研究提供高时间分辨率，对动物大小10有严格的限制。另一种使用麻醉装置的方法在多个时间点实现了果蝇幼虫的活成像，并已应用于研究神经肌肉结11、12、13、14、15、16。然而，这种方法也不允许连续成像超过30分钟，并要求反复使用去氟化物，这可以抑制神经活动，影响研究17，18的生物过程。最近，一种将微流体装置和冷冻麻醉相结合的新方法被用于短时间（分钟）19固定各种大小的幼虫。然而，这种方法需要专门的设备，如冷却系统，长时间的固定需要反复冷却幼虫。
在这里，我们提出了一种多功能的固定果蝇幼虫的方法，与不间断的延时成像相容，时间超过10小时。这种方法，我们称之为"拉瓦稳定部分附件"（LarvaSPA），涉及将幼虫角膜粘附在一个覆盖玻片上，用于在定制的成像室进行成像。该协议描述了如何使成像室，以及如何在各种发育阶段安装幼虫。在 LarvaSPA 方法中，所需的车身段使用紫外线反应胶贴在盖玻片上。PDMS 立体体另外对幼虫施加压力，防止逃生。成像室中的空气和水分可确保在成像过程中部分固定的幼虫存活。LarvaSPA 比其他技术的优点包括：（1） 它是允许对完整的果蝇幼虫进行连续活成像的第一种方法，其时间和空间分辨率较高;（2）该方法对幼虫大小的限制较少;（3） 成像室和PDMS立体体可以以最低的成本制造，并且可重复使用。
除了描述幼虫安装方法外，我们还提供了几个用于研究树突发育和树突变性的树突树种树突化（da）神经元的例子。
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Protocol
1. 制作成像室
- 金属框架可以从典型机器车间的铝块中构造。图1A说明了框架的规格。
- 要构建成像室，请使用长盖玻片（22 mm x 50 mm）和 UV 胶水（图 1A） 密封金属框架的底部。使用手持紫外线灯固化 UV 胶水。
2. 制作 PDMS 立体体
- 为 PDMS 立体体准备模具。
- 将包装胶带层连接到矩形（80 mm x 55 mm）培养盘或圆形细胞培养板的内表面。使用一层（0.063 毫米厚）用于第二星幼虫，2 层（0.126 毫米厚）用于早期第三星幼虫，或为后三星幼虫使用三层（0.189 毫米厚）（图 1B）。
- 使用剃刀刀片将胶带切成特定宽度的条状：1 层胶带为 1.5 mm，2 mm 用于 2 层或 3 层胶带。条带的宽度和厚度将决定最终 PDMS 立体体可以容纳的幼虫的大小。在两条条之间留出至少 5 mm 的空间。拆下覆盖空间的胶带层 （图 1B）。
- 使用胶带清除板内表面的灰尘。模具已准备就绪，可供使用。
- 准备 PDMS 组合。
- 将 7 g 的 PDMS 底座和 0.7 g 的固化剂（10：1 比例）彻底混合在小容器中。
- 将容器置于真空干燥器中至少 15 分钟，以清除混合物中的空气。
- 缓慢将约 5.5 g 的 PDMS 混合物倒入模具中，达到 1⁄2 mm 厚度（图 1B）。
- 将 PDMS 混合物再次放入真空干燥器至少 15 分钟，以清除混合物中剩余的气泡。用移液器尖端打破最后几个气泡。
- 在65°C的热培养箱中将PDMS固化在平坦的表面上2小时。
- 使用剃刀刀片沿模具边缘松开固化的 PDMS 并将其从模具上拆下。在室温下将 PDMS 存放在两块大型胶带之间。
- 对于早期和晚期的第三星幼虫，通过将胶带条（步骤 2.1.2）创建的凹槽放置在长方的中侧中心（图 1B，C）将 PDMS 切成 8 mm x 2 mm x 1 mm 立体体（沿图1BB中的虚线）。对于第二个星幼虫，将小方体切割为 8 mm x 1 mm x 1 mm。
3. 安装幼虫，进行长期延时成像
- 准备顶盖玻片进行安装。
- 选择六个与幼虫大小相匹配的凹槽的PDMS立体体。根据步骤 2.1.1、2.1.2 和 2.2.7 遵循建议的 PDMS 槽和尺寸。
- 用胶带清除 PDMS 表面的灰尘。
- 在长盖玻上（22 毫米 x 50 毫米）上连接四块双面胶带（12 mm x 5 mm），以便以后固定 PDMS 立体体。两块双面胶带之间的空间应与 PDMS 凹槽的宽度相同。
- 将一小滴（±1.2 μL）UV胶水涂入每个PDMS立方体的凹槽中，并在盖玻上双面胶带之间的空间中加入六小滴UV胶。
- 准备幼虫进行安装。
- 使用一对钳子，清洁水中的幼虫，从身体表面去除食物。
- 将干净的幼虫放在一小块湿润纸巾上，放入一个没有盖子的小（35毫米）培养皿中。将小培养皿放入一个大（60毫米）培养皿中，里面装着一块干纸巾。在化学罩中，使用塑料转移移液器将 8⁄12 滴（160–240 μL） 的烟胶涂抹在干纸巾上，并合上大型培养皿的盖子。
- 在监测幼虫时等待 2-3 分钟。一旦它们的嘴钩停止移动，从大培养皿中拿出幼虫。
- 安装动物。
- 要对动物背端的结构进行成像，将固定的幼虫放在覆盖唇上的双面胶带之间的UV胶水上，背角质朝向盖玻片。
- 用PDMS块覆盖每个幼虫，并将幼虫的躯干放入PDMS的凹槽中。将幼虫的头部和尾部留在 PDMS 凹槽外。避免用胶水堵住幼虫的尖刺。
- 将 PDMS 块的两端向下压到双面胶带上，而不对凹槽施加力。轻轻拉上幼虫的尾巴，将 PDMS 下的角质层压平。
- 在高设置（约 0.07 mW/mm2）使用手持紫外线灯固化 UV 胶水 4 分钟。
注意：使用紫外线灯时，用安全眼镜保护眼睛。 - 倒置盖玻片并重复步骤 3.3.4。
- 用 20 μL×30 μL 的水润湿一小片透镜纸（15 毫米 x 30 毫米）。将湿透镜纸放在成像室底部（图1A，D）。
- 将盖玻片放在造型室上，使幼虫朝向造型室内部。使用 UV 胶水将盖玻片的两端粘附在金属表面（图 1A，D）。幼虫的背侧已准备好在共聚焦显微镜下成像（图1E）。
4. 成像
- 使用适当的显微镜成像幼虫。该协议中显示的所有结果（图2，图3，视频S2，视频S3和视频S4）都是使用具有40倍（1.30 NA）油目标的共聚焦系统获得的。
5. 成像室和PDMS立体体的恢复
- 成像后，使用透镜纸去除顶盖玻片上的机油。使用剃刀刀片切入盖玻片和金属框架之间的空间，将顶盖玻片从金属框架上拆下。成像室已准备好重复使用。
- 用钳子将 PDMS 立体体从顶盖滑上拆下。将 PDMS 立体体卷在胶带上，以去除胶水残留物和灰尘。PDMS 立体体已准备好重复使用。
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Representative Results
幼虫成像室通过将定制的金属框架和两个盖玻片一起胶合而成。金属框架的设计在图1A中指定。在紫外线胶水和PDMS立体体的帮助下，室内的果蝇幼虫粘附在顶盖玻片上。PDMS 立体体上的凹槽和立方体的双面胶带连接，以创建容纳幼虫的空间（图 1B，C）。PDMS 还施加轻柔压力以压平幼虫体壁，并实际限制幼虫运动。最后，将一小块湿透镜纸放在造型室的底部，以提供水分。此设置可以固定果蝇幼虫超过10小时，用于连续成像。大多数动物在10小时后存活，可以恢复生长到脓性阶段。成像室可同时容纳多达九只幼虫。图1D显示了安装在腔室中的六只晚期第三星幼虫。幼虫的躯干是固定的，而它们的头和尾巴可以自由移动（图1E和视频S1）。该方法已成功用于成像第二星至游荡的第三星幼虫，连续高分辨率成像长达15小时。腔室设计用于使用直立显微镜进行成像，但该设置也适用于倒置显微镜，只需翻转腔室即可。
在这里，我们演示了LarvaSPA在研究神经元树突动力学和树突变性中的应用，使用IV类da（C4 da）神经元作为模型（图2，图3，视频S2_S4）。C4 da神经元是位于幼虫体壁上的躯体感觉受体，其树突内生幼虫表皮1，20，21，22。C4 da 树突在整个幼虫发育过程中表现出高度动态的生长行为，从而完全覆盖身体表面或空间填充23。C4 da神经元也成功地用于研究树突退化和再生后物理损伤24，25，26，27。
对于树突动力学成像，在第二星产卵后48小时（AEL）到徘徊第三instar的120 h AEL的幼虫被安装在成像室中，使用点扫描共聚焦显微镜进行延时成像。延时电影以3分钟的间隔拍摄，以捕捉由ppk-CD4-tdTom或UAS-CD4-tdTom驱动由ppk-Gal46驱动的C4 da树突的生长行为。在整个成像周期（长达12小时），C4 da神经元的高阶树突状分支表现出复杂的生长行为，包括延伸、收缩、分支形成和分支消除（图2A+2F），表明神经元的健康。我们的电影还捕捉到了同质的树突-树突排斥，其中树突提示在接触其他树突后缩回（图2F）。总体而言，这些结果表明，使用LarvaSPA进行延时成像对神经发育的研究是有效的。
为了成像树突退化，我们使用MaiTai激光在C4 da神经元细胞体附近切断原生树突。幼虫被恢复并安装在腔室中进行成像，从受伤后1.5小时开始（AI）（图3，视频S4）。电影记录了树突退化过程中的关键事件，包括树突膨胀、树突碎片破碎和树突碎片的清除。在同一实验中，幼虫脂肪体也被设计为分泌附件V-GFP（AV-GFP），一种在细胞表面27上标注外化磷脂素（PS）的传感器。我们观察到AV-GFP对退化的树突的特定标记（图3），表明PS在退化的树突表面被暴露，作为吞噬细胞生成27后续清除的食美信号。
图1：用于拉瓦SPA安装的成像室。（A） 成像室的图表，具有详细的规格，显示顶部视图和侧面视图。顶部视图中的浅蓝色阴影表示润湿的透镜纸。腔室由顶盖玻片和底盖玻片密封。说明了一个安装幼虫的位置。（B） 使用 PDMS 混合物填充后的 PDMS 模具（顶视图）和模具的示意图（侧视图）。灰色条状分别表示两个 1 层、两个 2 层和两个 3 层胶带条。侧视图中的黄色底色表示模具中的 PDMS 混合物。虚线指示在哪里切割固化的 PDMS。图表的侧视图未绘制为缩放。（C） 显示 PDMS 立方体的顶视图和侧面视图的照片。比例尺 = 1 mm. （D） 照片显示安装前的成像室，以及一个成像室，其中六个固定的晚期第三星果蝇幼虫安装背侧向上。刻度条 = 10 mm . （E） 更近距离地观察 （D） 中的幼虫。比例尺 = 1 毫米。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：树突动力学的延时成像。（A-F）在成像开始后的特定时间点，从 IV 类 da 神经元树突的延时电影中所选帧。幼虫的图像拍摄于48 h AEL（A和F）、72 h AEL（B）、96h AEL（C） 和 120 h AEL（D）。神经元由ppk>CD4-tdTom （A、 D、 E和F）或ppk >CD4-tdTom （B和C） 标记。与上一个时间点相比，蓝色箭头表示树突收缩。黄色箭头表示与前一个时间点相比的树突扩展。（E） 在12小时成像结束时的丹德石形态。（F） 连续帧与3分钟间隔的电影，说明树突分支在第二个星幼虫延伸（黄色箭头），然后缩回（蓝色箭头）后，它与另一个树突接触。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：树突退化和食用美信号暴露的延时成像。激光损伤后IV类d神经元退化树突的延时电影中选定的帧。树突被ppk>CD4-tdTom标记。脂肪体分泌的附件-GFP（AV-GFP）检测到退化树突上的进食-me信号PS。黄色箭头指向显示 AV-GFP 标签的分支。蓝色箭头指向正在碎片的树突。请点击此处查看此图的较大版本。
视频 S1：第三只星幼虫固定在 PDMS 立体体的凹槽中。请点击此处观看此视频。（右键单击下载。
视频 S2： 树突在第二个星幼虫中动态扩展和缩回。请点击此处观看此视频。（右键单击下载。
视频 S3： 在流浪的第三星幼虫中动态扩展和缩回。请点击此处观看此视频。（右键单击下载。
视频 S4： 第三个星幼虫激光受伤后，丹德瑞德退化并暴露磷脂酰丝氨酸。请点击此处观看此视频。（右键单击下载。
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Discussion
在这里，我们描述了LarvaSPA，一种用于长期延时成像的多功能安装活果蝇幼虫的方法。此方法不需要恢复或重新安装幼虫，可实现不间断的成像。因此，它是跟踪需要数小时才能完成的生物过程的理想选择，例如树突退化和再生。该方法还可用于成像细胞内钙动力学和亚细胞事件，如微管生长。由于幼虫体壁在成像过程中是稳定的，因此可以调整空间和时间分辨率以适应手头的成像应用（例如，跟踪快速亚细胞囊泡运动或监测神经元分支模式的缓慢全球变化）。此外，该方法与处于不同发育阶段的幼虫兼容，不需要特殊设备。因此，拉瓦SPA可能被许多果蝇实验室用于解决各种问题。
影响该方法成功的因素，包括PDMS立体体的性质和幼虫的发育阶段
PDMS 立体体的大小和凹槽的深度需要与幼虫的大小相匹配。PDMS幼体对于幼虫来说太宽，可以覆盖头部和尾巴，导致缺氧。然而，一个狭窄的PDMS立方体可能无法有效地防止幼虫移动。同样，太深的凹槽也不会产生足够的压力来抑制幼虫的运动。太浅的凹槽不能容纳足够的胶水，使幼虫粘附在盖玻片上。根据我们的经验，PDMS 和凹槽的以下尺寸建议用于幼虫的不同阶段：8 mm x 1 mm x 1 mm PDMS 立体体，带 1.5 mm x 1 mm x 0.063 mm 凹槽用于第二星幼虫（+48 h AEL）;8 毫米 x 2 毫米 x 1 毫米 PDMS 立体体，带 2 毫米 x 2 毫米 x 0.126 mm 凹槽，用于早期第三星幼虫（+72 h AEL）;8 毫米 x 2 毫米 x 1 毫米 PDMS 立体体，带 2 毫米 x 2 毫米 x 0.189 mm 凹槽，适用于晚期第三只星幼虫（+96 h AEL 或更老）。
与年轻幼虫相比，游荡的第三颗星幼虫（在或超过 120 h AEL 时）移动较少，一旦安装在腔室中，需要较少的水分才能存活。它们也有较厚的角质层，可以承受更多的身体压力。因此，利用游荡的三星幼虫进行实验的成功率最高。在我们手中，超过80%的流浪第三星幼虫存活下来，在安装后12小时保持不动。为了防止幼虫在成像过程中幼虫，我们建议在96小时至120小时AEL之间安装幼虫。年轻的第三星幼虫在成像过程中有更大的逃生或死亡的机会。通常，安装在同一腔室中的6只年轻的第三只恒星幼虫中，至少有2只会存活下来，安装后10小时保持不动。我们的经验与第二星幼虫是有限的，生存率是很难估计的。然而，我们已经成功地用这种方法在7小时中成像了第二个星幼虫。
长期成像的潜在顾虑
虽然LarvaSPA在成像树突生长动力学和退化方面非常有用，但有一些潜在的注意事项需要考虑。首先，在我们目前的方法中，幼虫在整个成像期间都缺乏食物，这可能导致许多组织出现饥饿引起的反应。我们已经观察到表皮细胞在安装后10小时左右形成颗粒状结构，这可能是自噬的结果。因此，在成像的最初几个小时内获得的结果应该在生理上更相关。较长的时间尺度的结果需要更谨慎的解释。为了尽量减少这种担忧，我们的程序可能会加以调整，以便进行幼虫喂养。其次，由于身体的限制和营养摄入的缺乏，我们的方法可能会干扰幼虫的快速生长。然而，这种担心可能不适用于老年动物。例如，游荡的第三星幼虫即使在连续成像12小时后也能变成幼虫，这使得这种方法非常适合早期蜕变的研究。第三，对脂肪体和肠道等深层结构的成像带来了一些挑战。一个主要原因是，较深的组织经常在成像过程中移动，因此在后处理过程中需要运动校正。此外，光线路径中折射率不匹配可能导致对深层组织进行成像时出现球面像差。虽然油物位适合成像 da 神经元，因为它们的树突距离身体表面在 15 μm 内，但浸入物目标可能是纠正折射率不匹配以更好地在幼虫体内进行成像的。第四，由于C4 da神经元可以被紫外线28激活，在幼虫安装过程中使用紫外线可能会改变C4 da神经元的生理。尽管我们建议的光强度远低于强效激活C4da神经元28的水平，但与C4da神经元活动相关的结果需要谨慎解释。UV胶水已用于成像各种生物样品29，30，31，并没有造成明显的毒性，在我们手中的幼虫。最后，人们应该考虑为体内活成像设置适当的显微镜。例如，共振扫描仪和旋转盘共聚焦显微镜是长期实时成像的更好选择，因为它们能减少光毒性和光漂白;多光子显微镜对幼虫深层内部结构成像更为有效;长期成像可能容易发生采样或焦点漂移，这可以通过成像后处理进行纠正。
LarvaSPA 最常见的故障原因以及解决这些问题的建议解决方案
- 拉瓦移动太多或逃避：两个常见的原因可能导致这个问题。首先，PDMS 凹槽对于幼虫来说可能太浅或太深。尝试另一个具有不同凹槽深度的 PDMS 立体体可能会解决此问题。第二个原因是室内水分过多，削弱了紫外线胶水。减少在腔室中添加到透镜纸中的水量可能有助于固定幼虫。此外，尝试仅图像 PDMS 立体体覆盖的段，因为头部和尾部可以自由移动。
- 幼虫在成像过程中死亡：如果幼虫在成像后很快死亡，则很可能它暴露于过多的麻醉剂中。正确麻醉的幼虫应在安装后醒来，并显示运动，包括口钩延伸和回缩和背血管收缩。为了解决这个问题，少用的胶质可用于麻醉幼虫。在口钩停止移动后，立即将幼虫从麻醉培养皿中转移出来。如果幼虫在成像后约一小时死亡，通常是因为脱水。在密封前，请记得将一块湿润的透镜纸放在成像室中。另一个常见的致命性原因是紫外线胶水阻挡了螺旋体。尽量将紫外线胶水限制在幼虫的中间部分，避免覆盖头部和尾部。过宽的 PDMS 立体体也很容易导致紫外线胶水阻塞尖刺。
- 身体壁上的褶皱会干扰成像：为了避免在安装过程中产生褶皱，在麻醉步骤中完全固定幼虫非常重要。当幼虫瘫痪时，更容易拉直和伸展身体。对于年龄超过96 h AEL的动物，在固化UV胶水之前轻轻拖拽尾巴可以有效减少褶皱形成。不建议拖着幼虫的尾巴，因为它们的身体壁是脆弱的。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
我们感谢唐灵峰建立了早期版本的拉瓦SPA方法;格伦·斯旺在康奈尔奥林霍尔机器商店制造早期原型的成像室;菲利普·伊瑟曼用于构建金属框架，并提供PDMS立体体制作建议;康奈尔BRC成像设备用于显微镜（由NIH赠款S10OD018516资助）;玛丽亚·萨帕尔对手稿进行批判性阅读。这项工作得到了康奈尔大学奖学金授予H.J.的支持;康奈尔大学启动基金和NIH赠款（R01NS099125和R21OD023824）授予C.H.H.J.和C.H.构思该项目并设计了实验。H.J.进行了实验。H.J.和C.H.写了手稿。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
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