Summary
Este protocolo describe un método para el montaje de larvas de Drosophila para lograr más de 10 h de imágenes de lapso de tiempo ininterrumpidas en animales vivos intactos. Este método se puede utilizar para tomar imágenes de muchos procesos biológicos cerca de la pared del cuerpo larvario.
Abstract
Las imágenes en vivo son un enfoque valioso para investigar las preguntas sobre biología celular. La larva de Drosophila es particularmente adecuada para la toma de imágenes en vivo in vivo porque la pared del cuerpo larvario y la mayoría de los órganos internos son transparentes. Sin embargo, la imagen viva continua de larvas de Drosophila intactas durante más de 30 minutos ha sido un reto porque es difícil inmovilizar las larvas durante mucho tiempo. Aquí presentamos un método de montaje larvario llamado LarvaSPA que permite la toma de imágenes continuas de larvas droofílicas vivas con alta resolución temporal y espacial durante más de 10 horas. Este método consiste en unir parcialmente las larvas al cubreobjetos utilizando un pegamento reactivo uv-uv y, además, restringir el movimiento larvariado utilizando un bloque de polidimetilsiloxano (PDMS). Este método es compatible con larvas en etapas de desarrollo desde la segunda instar hasta la tercera estrella errante. Demostramos aplicaciones de este método en el estudio de procesos dinámicos de las neuronas Drosophila somatosensorial, incluyendo el crecimiento de dendrita y la degeneración inducida por lesiones. Este método también se puede aplicar para estudiar muchos otros procesos celulares que ocurren cerca de la pared del cuerpo larvario.
Introduction
Las imágenes en vivo de lapso de tiempo son un método potente para estudiar los procesos celulares dinámicos. La información espacial y temporal proporcionada por las películas de lapso de tiempo puede revelar detalles importantes para responder preguntas de biología celular. La larva Drosophila ha sido un modelo popular in vivo para las investigaciones utilizando imágenes en vivo porque su pared corporal transparente permite imágenes no invasivas de estructuras internas1,2. Además, numerosas herramientas genéticas están disponibles en Drosophila para etiquetar fluorescentemente estructuras anatómicas y macromoléculas3. Sin embargo, las imágenes de lapso de tiempo a largo plazo de las larvas de Drosophila son desafiantes. A diferencia de los embriones tempranos estacionarios o pusias, las larvas de Drosophila se mueven constantemente, lo que requiere inmovilización para obtener imágenes en vivo. Las formas efectivas de inmovilizar larvas de Drosophila vivas incluyen el montaje en aceite de halocarbono con cloroformo4,anestesiando utilizando isoflurano o solución de Dichlorvos5,y comprimiendo entre el cubreobjetos y el portaobjetos del microscopio6. Aunque algunos de estos métodos se han utilizado para la microscopía, ninguno de ellos es eficaz para imágenes en vivo a largo plazo. Se desarrollaron otros métodos para la toma de imágenes de neuronas de pared corporal en larvas rastreras utilizando microscopía confocal convencional o microscopía de láminas ligeras7,8,9. Sin embargo, estos métodos no son ideales para monitorear la dinámica celular debido al movimiento de las larvas.
Se han desarrollado nuevos métodos para lograr imágenes de lapso de tiempo a largo plazo de larvas de Drosophila. Utilizando un "chip larva" de polidimetilsiloxano (PDMS), las larvas de Drosophila pueden ser inmovilizadas eficazmente a través de la succión generada por vacío en una microcámara especializada sin anestesia. Sin embargo, este método no ofrece alta resolución temporal para estudios de biología celular y tiene estrictas limitaciones en el tamaño animal10. Otro método que utiliza un dispositivo de anestesia logró imágenes en vivo de larvas de Drosophila en múltiples momentos y se ha aplicado para estudiar las uniones neuromusculares11,12,13,14,15,16. Sin embargo, este método tampoco permite la toma de imágenes continuas durante más de 30 min y requiere el uso de desflurano repetidamente, lo que puede inhibir la actividad neuronal y afectar al proceso biológico estudiado17,18. Recientemente, se ha utilizado un nuevo método que combina dispositivo microfluídico y crioanestesia para inmovilizar larvas de varios tamaños durante cortos períodos de tiempo (minutos)19. Sin embargo, este método requiere dispositivos especializados como un sistema de enfriamiento y períodos más largos de inmovilización requieren enfriamiento repetido de las larvas.
Aquí presentamos un método versátil de inmovilización de larvas de Drosophila que es compatible con imágenes de lapso de tiempo ininterrumpidas durante más de 10 h. Este método, que llamamos "Estabilización de larvas por apego parcial" (LarvaSPA), implica adherir la cutícula larval a un cubreobjetos para obtener imágenes en una cámara de imágenes personalizada. Este protocolo describe cómo hacer la cámara de imágenes y cómo montar larvas en una variedad de etapas de desarrollo. En el método LarvaSPA, los segmentos de cuerpo deseados se fijan a la capa con un pegamento reactivo UV. Un cuboide PDMS aplica además presión a las larvas, evitando el escape. El aire y la humedad en la cámara de imágenes aseguran la supervivencia de las larvas parcialmente inmovilizadas durante la toma de imágenes. Las ventajas de LarvaSPA sobre otras técnicas incluyen las siguientes: (1) Es el primer método que permite la toma continua de imágenes en vivo de larvas de Drosophila intactas durante horas con alta resolución temporal y espacial; (2) El método tiene menos limitaciones en el tamaño larvario; (3) La cámara de imágenes y los cuboides PDMS se pueden fabricar a un costo mínimo y son reutilizables.
Además de describir el método de montaje larvario, proporcionamos varios ejemplos de su aplicación para el estudio del desarrollo de dendrita y degeneración dendrita de las neuronas Drosophila dendrítica (da).
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Protocol
1. Hacer que la cámara de imágenes
- El marco de metal se puede construir a partir de un bloque de aluminio en un taller de máquinas típico. Las especificaciones de la trama se ilustran en la Figura 1A.
- Para construir la cámara de imágenes, selle la parte inferior del marco metálico con un cubreobjetos largos (22 mm x 50 mm) y pegamento UV(Figura 1A). Curar el pegamento UV con una lámpara UV de mano.
2. Fabricación de cuboides PDMS
- Prepare el molde para cuboides PDMS.
- Fije las capas de cinta de embalaje a la superficie interior de una placa rectangular (80 mm x 55 mm) de placa de cultivo de celda redonda o placa de cultivo de celda redonda. Utilice una capa (0,063 mm de espesor) para larvas de segunda estrella, 2 capas (0,126 mm de espesor) para larvas de tercera estrella tempranas o tres capas (0,189 mm de espesor) para larvas de tercera estrella tardías(Figura 1B).
- Corte la cinta en tiras de anchura específica con una cuchilla de afeitar: 1,5 mm para la cinta de 1 capa y 2 mm para cinta de 2 o 3 capas. El ancho y el grosor de la tira determinarán el tamaño de las larvas que el cuboide final PDMS puede contener. Deje al menos un espacio de 5 mm entre las dos tiras. Quite las capas de cinta que cubren el espacio(Figura 1B).
- Retire el polvo de la superficie interior de la placa con cinta adhesiva. El molde está listo para su uso.
- Prepare la combinación de PDMS.
- Mezclar 7 g de base PDMS y 0,7 g de agente de curado (relación 10:1) a fondo en un recipiente pequeño.
- Coloque el recipiente en un desecador al vacío durante al menos 15 minutos para eliminar el aire de la mezcla.
- Vierta lentamente alrededor de 5,5 g de mezcla PDMS sobre el molde para alcanzar un espesor de 1-2 mm(Figura 1B).
- Coloque de nuevo la mezcla PDMS en el desecador al vacío durante al menos 15 minutos para eliminar las burbujas de aire restantes de la mezcla. Rompe las últimas burbujas con una punta de pipeta.
- Curar el PDMS sobre una superficie plana en una incubadora de calor a 65oC durante 2 h.
- Utilice una cuchilla de afeitar para aflojar el PDMS curado a lo largo del borde del molde y separarlo del molde. Almacene el PDMS entre dos piezas de cinta adhesiva grande a temperatura ambiente.
- Para larvas de tercera instar tempranas y tardías, corte el PDMS en cuboides de 8 mm x 2 mm x 1 mm (a lo largo de las líneas punteadas de la Figura 1B)colocando la ranura creada por la tira de cinta (paso 2.1.2) en el centro del lado largo del cuboide(Figura 1B,C). Para larvas de segunda estrella, corte el cuboide a 8 mm x 1 mm x 1 mm.
3. Montaje de larvas para imágenes de lapso de tiempo a largo plazo
- Prepare la cubierta superior para el montaje.
- Elija seis cuboides PDMS con ranuras que coincidan con los tamaños de las larvas. Siga la ranura y el tamaño recomendados de PDMS en función de los pasos 2.1.1, 2.1.2 y 2.2.7.
- Retire el polvo de la superficie del PDMS con cinta adhesiva.
- Coloque cuatro piezas de cinta de doble cara (12 mm x 5 mm) en un tapón largo (22 mm x 50 mm) para fijar más adelante cuboides PDMS. Los espacios entre las dos piezas de cinta de doble cara deben ser los mismos que la anchura de la ranura PDMS.
- Aplique una pequeña gota (-1,2 l) de pegamento UV en la ranura de cada cuboide PDMS y agregue seis pequeñas gotas de pegamento UV en el espacio entre la cinta de doble cara en el cubreobjetos.
- Preparen las larvas para el montaje.
- Con un par de fórceps, limpie las larvas en agua para eliminar los alimentos de la superficie del cuerpo.
- Coloque las larvas limpias sobre un pequeño trozo de papel tisú humedecido en un plato Petri pequeño (35 mm) sin tapa. Coloque el pequeño plato Petri en un plato Petri grande (60 mm) que contenga un pedazo de papel de tejido seco. En una campana química, aplique de 8 a 12 gotas (160–240 l) de isoflurano sobre el papel de tejido seco utilizando una pipeta de transferencia de plástico y cierre la tapa de la gran placa Petri.
- Espere de 2 a 3 minutos mientras monitorea las larvas. Saca las larvas del plato grande de Petri una vez que sus ganchos bucales dejen de moverse.
- Monte los animales.
- Para crear imágenes de estructuras en el lado dorsal del animal, coloque las larvas inmovilizadas en el pegamento UV entre la cinta de doble cara en el cubreobjetos con la cutícula dorsal mirando hacia el cubreobjetos.
- Cubra cada larva con un bloque PDMS y ajuste el tronco de la larva en la ranura del PDMS. Deje la cabeza y la cola de la larva fuera de la ranura pdmS. Evite bloquear los espiráculos de la larva por el pegamento.
- Presione hacia abajo en los extremos del bloque PDMS sobre la cinta de doble cara sin aplicar fuerza en la ranura. Tire suavemente de la cola de la larva para aplanar la cutícula debajo del PDMS.
- Curar el pegamento UV durante 4 minutos con una lámpara UV de mano en el ajuste alto (a aproximadamente 0,07 mW/mm2).
ADVERTENCIA: Proteja los ojos con gafas de seguridad mientras utiliza la lámpara UV. - Voltee el cubreobjetos hacia abajo y repita el paso 3.3.4.
- Humedezca un pequeño trozo de papel de lente (15 mm x 30 mm) con 20 s–30 l de agua. Coloque el papel de lente humedecido en la parte inferior de la cámara de imágenes(Figura 1A,D).
- Coloque el cubreobjetos en la cámara para que las larvas estén orientadas hacia el interior de la cámara. Adherir ambos extremos de la cubierta a la superficie metálica usando pegamento UV(Figura 1A,D). El lado dorsal de las larvas está listo para la toma de imágenes bajo microscopio confocal(Figura 1E).
4. Imágenes
- Imagen de larvas con un microscopio apropiado. Todos los resultados mostrados en este protocolo(Figura 2, Figura 3, Video S2, Video S3y Video S4)se adquirieron utilizando un sistema confocal con un objetivo de aceite de 40x (1.30 NA).
5. Recuperación de cámara de imágenes y cuboides PDMS
- Después de la toma de imágenes, retire el aceite de la cubierta superior con un papel de lente. Separe el cubreobjetos superiores de la estructura metálica cortando en el espacio entre el cubreobjetos y el marco de metal con una cuchilla de afeitar. La cámara de imágenes está lista para su reutilización.
- Separe los cuboides PDMS de la cubierta superior con fórceps. Enrolle los cuboides PDMS en cinta adhesiva para eliminar los residuos de pegamento y el polvo. Los cuboides de PDMS están listos para su reutilización.
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Representative Results
La cámara de imágenes de larvas se construye pegando un marco de metal hecho a medida y dos tapas juntas. El diseño del marco metálico se especifica en la Figura 1A. Las larvas de Drosophila dentro de la cámara se adhieren a la cubierta superior con la ayuda de pegamento UV y cuboides PDMS. La ranura en el cuboide PDMS y la cinta de doble cara que el cuboide se une para crear el espacio para sostener las larvas(Figura 1B,C). El PDMS también aplica una presión suave para aplanar la pared del cuerpo larvario y restringir físicamente el movimiento larvario. Por último, un pequeño trozo de papel de lente húmeda se coloca en la parte inferior de la cámara para proporcionar humedad. Esta configuración puede inmovilizar larvas de Drosophila durante más de 10 horas para obtener imágenes continuas. La mayoría de los animales están vivos después de 10 h y se pueden recuperar para crecer en la etapa pupal. La cámara de imágenes puede acomodar hasta nueve larvas a la vez. La Figura 1D muestra seis larvas de estrella tercera de finales montadas en la cámara. Los troncos de las larvas se fijan mientras sus cabezas y colas son libres de moverse(Figura 1E y Video S1). Este método se ha utilizado con éxito para imaginar la segunda instar a vagar por larvas de tercera estrella con imágenes continuas de alta resolución de hasta 15 h. La cámara está diseñada para la toma de imágenes mediante microscopios verticales, pero la configuración también funciona para microscopios invertidos simplemente volteando la cámara.
Aquí demostramos la aplicación de LarvaSPA en el estudio de la dinámica de dendrita neuronal y la degeneración de la dendrita utilizando las neuronas de clase IV da (C4 da) como modelo(Figura 2, Figura 3, Videos S2–S4). Las neuronas C4 da son nociceptores somatosensoriales ubicados en la pared del cuerpo larvario, cuyas dendritas inerditas inervan la epidermis larval1,20,21,22. Las dendritas C4 presentan comportamientos de crecimiento altamente dinámicos a lo largo del desarrollo larvaria, lo que resulta en una cobertura completa de la superficie corporal o en el espacio de llenado23. Las neuronas C4 da también se han utilizado con éxito para estudiar la degeneración y regeneración de dendrita después de una lesión física24,25,26,27.
Para la dinámica de dendrita por imágenes, las larvas que van desde 48 h después de la puesta de huevos (AEL) en la segunda estrella hasta las 120 h AEL en la tercera estrella errante se montaron en la cámara de imágenes para obtener imágenes de lapso de tiempo mediante microscopía de exploración puntual. Las películas de lapso de tiempo se tomaron con un intervalo de 3 minutos para capturar los comportamientos de crecimiento de Las dendritas C4 etiquetadas por ppk-CD4-tdTom o UAS-CD4-tdTom impulsados por ppk-Gal46. A lo largo del período de diagnóstico por imágenes (hasta 12 h), las ramas de dendrita de alto orden de las neuronas C4 da mostraron comportamientos complejos de crecimiento, incluyendo extensión, retracción, formación de ramas y eliminación de ramas(Figura 2A–2F),lo que indica la salud de las neuronas. Nuestras películas también capturaron repulsiones homotípicas dend-dendritas en las que las puntas de dendrita se retractaron después de contactar con otras dendritas(Figura 2F). En general, estos resultados demuestran que la toma de imágenes de lapso de tiempo utilizando LarvaSPA es eficaz para estudiar el neurodesarrollo.
Para la degeneración de la dendrita de imagen, usamos un láser MaiTai para cortar las dendritas primarias cerca de los cuerpos celulares neuronales C4 da. Las larvas fueron recuperadas y montadas en la cámara para la toma de imágenes a partir de 1,5 h después de una lesión (AI)(Figura 3, Video S4). Las películas registraron eventos clave durante la degeneración de la dendrita, incluyendo hinchazón de dendrita, fragmentación de dendrita y aclaramiento de escombros de dendrita. En el mismo experimento, el cuerpo de grasa larval también fue diseñado para secretar Annexin V-GFP (AV-GFP), un sensor que etiqueta fosfatidilserina externa (PS) en la superficie celular27. Observamos el etiquetado específico de las dendritas degenerativas por AV-GFP(Figura 3), sugiriendo que PS fue expuesto en la superficie de dendritas degenerativas para servir como una señal de comer para el aclaramiento posterior por fagocitosis27.
Figura 1: La cámara de imágenes para el montaje de LarvaSPA. (A) Diagramas de la cámara de imágenes con especificaciones detalladas, que muestran tanto la vista superior como la vista lateral. El sombreado azul claro en la vista superior indica el papel de lente humedecido. La cámara está sellada por un cubreobjetos superior y una cubierta inferior. Se ilustra la posición de una larva montada. (B) Diagramas del molde PDMS (la vista superior) y del molde después de rellenar con la mezcla PDMS (vista lateral). Las tiras en gris indican dos tiras de cinta de 1 capa, dos de 2 capas y dos de 3 capas, respectivamente. El sombreado amarillo en la vista lateral indica la mezcla PDMS en el molde. Las líneas punteadas indican dónde cortar el PDMS curado. La vista lateral del diagrama no se dibuja a escala. (C) Fotografías que muestran una vista superior y una vista lateral de un cuboide PDMS. Barra de escala de 1 mm (D) Fotografías que muestran una cámara de imágenes antes del montaje, y una cámara de imágenes con seis larvas dorsales de última tercera estrella inmovilizadas montadas en el lado dorsal hacia arriba. Barra de escala a 10 mm. (E) Una vista más cercana de una larva en (D). Barra de escala 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imagen de lapso de tiempo de la dinámica de dendrita. (A-F) Fotogramas seleccionados de películas de lapso de tiempo de dendritas de neuronas de clase IV da en puntos de tiempo específicos después del inicio de la toma de imágenes. Las imágenes de las larvas se tomaron 48 h AEL (A y F), 72 h AEL (B), 96 h AEL (C) y 120 h AEL (D). Las neuronas están etiquetadas por ppk>CD4-tdTom (A, D, Ey F) o ppk >CD4-tdTom (B y C). Las flechas azules indican retracciones de dendrita en comparación con el punto de tiempo anterior. Las flechas amarillas indican extensiones de dendrita en comparación con el punto de tiempo anterior. (E) Morfología de la dendrita al final de 12 h de imágenes. (F) Fotogramas consecutivos con intervalos de 3 minutos en una película que ilustran cómo una rama de dendrita en una segunda larva instar extendida (flechas amarillas) y posteriormente retraída (flechas azules) después de que hizo contacto con otra dendrita. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imagen de lapso de tiempo de degeneración de dendrita y exposición de una señal eat-me. Fotogramas seleccionados de una película de lapso de tiempo de dendritas degenerativas de una neurona de clase IV da después de una lesión láser. Los dendritas fueron etiquetados por ppk>CD4-tdTom. La señal de comer PS en dendritas degenerativas fue detectada por Annexin-GFP (AV-GFP), que es secretado por el cuerpo gordo. Las flechas amarillas apuntan a las ramas que muestran el etiquetado AV-GFP. Las flechas azules apuntan a dendritas sometidas a fragmentación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video S1: Una tercera larva instar se inmoviliza en la muesca de un cuboide PDMS. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
Video S2: Las dendritas se extienden y se retraen dinámicamente en una segunda larva instar. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
Video S3: Las dendritas se extienden y se retraen dinámicamente en una tercera larva instar errante. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
Video S4: Las dendritas degeneran y exponen la fosfatidilserina después de una lesión láser en una tercera larva instar. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
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Discussion
Aquí describimos LarvaSPA, un método versátil de montaje de larvas Drosophila vivas para imágenes de lapso de tiempo a largo plazo. Este método no requiere recuperar o volver a montar larvas, lo que permite imágenes ininterrumpidas. Por lo tanto, es ideal para el seguimiento de procesos biológicos que tardan horas en completarse, como la degeneración y regeneración de dendrita. Este método también se puede utilizar para la creación de imágenes de la dinámica de calcio intracelular y eventos subcelulares como el crecimiento de microtúbulos. Como la pared del cuerpo larvario es estable durante la toma de imágenes, la resolución espacial y temporal se puede ajustar para adaptarse a la aplicación de imágenes a mano (por ejemplo, para rastrear el movimiento rápido de la vesícula subcelular o para monitorear los cambios globales lentos de los patrones de las ramas neuronales). Además, este método es compatible con larvas en varias etapas de desarrollo y no requiere equipo especial. Por lo tanto, LarvaSPA puede ser utilizado potencialmente por muchos laboratorios drosófilos para abordar diversas preguntas.
Factores que afectan el éxito del método, incluyendo la naturaleza del cuboide PDMS y la etapa de desarrollo de las larvas
El tamaño del cuboide PDMS y la profundidad de la ranura deben coincidir con el tamaño de las larvas. Un cuboide PDMS demasiado ancho para las larvas puede cubrir la cabeza y la cola y causar hipoxia. Sin embargo, un cuboide PDMS estrecho puede no ser eficaz para evitar que las larvas se muevan. Una ranura demasiado profunda de manera similar no generaría suficiente presión para restringir el movimiento de las larvas. Una ranura demasiado poco profunda no contendría suficiente pegamento para adherir las larvas a la cubierta. Según nuestra experiencia, se recomiendan las siguientes dimensiones del PDMS y la ranura para varias etapas de larvas: cuboides PDMS de 8 mm x 1 mm x 1 mm con ranuras PDMS de 1,5 mm x 1 mm x 0,063 mm para larvas de segunda estrella (48 h AEL); Cuboides PDMS de 8 mm x 2 mm x 1 mm con ranuras de 2 mm x 2 mm x 0,126 mm para larvas de tercera estrella tempranas (aEL de 72 h); Cuboides PDMS de 8 mm x 2 mm x 1 mm con ranuras de 2 mm x 2 mm x 0,189 mm para larvas de tercera estrella tardías (96 h AEL o más).
Las larvas de tercera estrella errantes (a o mayores de 120 h AEL) se mueven menos en comparación con las más jóvenes y requieren menos humedad para sobrevivir una vez montadas en la cámara. También tienen una cutícula más gruesa y pueden soportar más estrés físico. Por lo tanto, los experimentos que utilizan larvas vagando de tercera estrella tienen la mayor tasa de éxito. En nuestras manos, más del 80% de las larvas vagando por tercera estrella sobrevivieron y permanecieron inmóviles 12 h después del montaje. Para evitar que las larvas puparian durante la toma de imágenes, recomendamos montar las larvas entre 96 h y 120 h AEL. Las larvas más jóvenes de tercera estrella tienen una mayor probabilidad de escape o muerte durante la toma de imágenes. Típicamente, al menos 2 de cada 6 larvas jóvenes de tercera estrella montadas en la misma cámara sobrevivirían y permanecerían inmóviles 10 h después del montaje. Nuestra experiencia con larvas de segunda estrella es limitada y la tasa de supervivencia es difícil de estimar. Sin embargo, hemos estado inspeccionando con éxito las larvas de segunda estrella durante 7 h utilizando este método.
Posibles preocupaciones de las imágenes a largo plazo
Aunque LarvaSPA ha sido muy útil para la dinámica de crecimiento de dendrita de imágenes y la degeneración, hay algunas advertencias potenciales a considerar. En primer lugar, en nuestro método actual, las larvas se ven privadas de alimentos durante toda la duración de la toma de imágenes, lo que puede conducir a respuestas inducidas por el hambre en muchos tejidos. Hemos observado la formación de estructuras granulares en células epidérmicas alrededor de 10 h después del montaje, que pueden resultar de la autofagia. Por lo tanto, los resultados obtenidos en las primeras horas de imagen deben ser más relevantes fisiológicamente. Los resultados en escalas de tiempo más largas requieren una interpretación más cautelosa. Para minimizar esta preocupación, nuestro procedimiento podría adaptarse potencialmente para permitir la alimentación larvaria. En segundo lugar, nuestro método puede interferir con el rápido crecimiento de las larvas más jóvenes debido a la restricción física y la falta de ingesta de nutrientes. Sin embargo, esta preocupación puede no aplicarse a los animales mayores. Por ejemplo, las larvas de tercera estrella errante pueden convertirse en pusias incluso después de 12 h de imágenes continuas, por lo que este método es ideal para investigaciones de metamorfosis temprana. En tercer lugar, la toma de imágenes de estructuras más profundas como el cuerpo graso y el intestino presenta algunos desafíos. Una razón principal es que los tejidos más profundos a menudo se mueven durante la toma de imágenes y, por lo tanto, requieren corrección de movimiento en el postprocesamiento. Además, las desajustes de los índices de refracción en la trayectoria de la luz pueden causar aberración esférica al tomar imágenes de tejidos más profundos. Mientras que los objetivos de aceite son apropiados para la toma de imágenes da neuronas porque sus dendritas están dentro de 15 m de la superficie del cuerpo, los objetivos de inmersión en agua podrían ser mejores opciones para corregir las discordancias de índice de refracción para la toma de imágenes más profundas dentro de las larvas. Cuarto, porque las neuronas C4 da pueden ser activadas por la luz UV28, usando luz UV durante el montaje larvario potencialmente puede alterar La fisiología de la neurona C4 da. Aunque la intensidad de la luz que recomendamos está muy por debajo de los niveles que activan robustamente las neuronas C4da28, los resultados relacionados con la actividad neuronal C4da deben ser interpretados con cautela. El pegamento UV se ha utilizado para tomar imágenes de una amplia variedad de muestras biológicas29,30,31 y no causa toxicidad evidente a las larvas en nuestras manos. Por último, se debe considerar la configuración adecuada del microscopio para la toma de imágenes en vivo in vivo. Por ejemplo, los escáneres de resonancia y los microscopios confocales de disco giratorio son mejores opciones para la toma de imágenes en vivo a largo plazo porque causan menos fototoxicidad y fotoblanqueo; la microscopía multifotón es más eficaz para tomar imágenes de estructuras internas más profundas en las larvas; las imágenes a largo plazo podrían ser propensas a la deriva de muestras o enfoque, lo que podría corregirse mediante el procesamiento posterior a la toma de imágenes.
Las causas más comunes de falla para LarvaSPA y las soluciones recomendadas para abordarlas
- Las larvas se mueven demasiado o escapan: Dos razones comunes podrían contribuir a este problema. La primera es que la ranura PDMS puede ser demasiado superficial o demasiado profunda para las larvas. Probar otro cuboide PDMS con una profundidad de ranura diferente puede resolver el problema. La segunda razón es que hay demasiada humedad en la cámara, debilitando el pegamento UV. Reducir el volumen de agua añadido al papel de la lente en la cámara puede ayudar a inmovilizar las larvas. Además, intente crear una imagen solo de los segmentos cubiertos por el cuboide PDMS, ya que la cabeza y la cola son libres de moverse.
- Las larvas mueren durante la toma de imágenes: Si una larva muere poco después de la toma de imágenes, es probable que haya estado expuesta a demasiado anestésico. Las larvas correctamente anestesiadas deben despertarse después del montaje y mostrar movimientos, incluyendo la extensión y retracción del gancho bucal y la contracción de los vasos dorsales. Para resolver este problema, se podría utilizar menos isoflurano para anestesiar las larvas. Transfiera una larva fuera de la placa de anestesia Petri inmediatamente después de que el gancho de la boca deje de moverse. Si la larva muere aproximadamente una hora después de la toma de imágenes, generalmente es debido a la deshidratación. Recuerde colocar un pedazo de papel de lente humedecido en la cámara de imágenes antes de sellar. Otra razón común de la letalidad es que el pegamento UV bloquea los espiráculos. Trate de limitar el pegamento UV a los segmentos medios de la larva y evite cubrir la cabeza y la cola. Un cuboide PDMS demasiado amplio también puede hacer que el pegamento UV bloquee fácilmente los espiráculos.
- Los pliegues en la pared del cuerpo interfieren con las imágenes: Para evitar la generación de pliegues durante el montaje, es importante inmovilizar completamente las larvas durante el paso de anestesia. Cuando una larva está paralizada, es más fácil enderezar y estirar el cuerpo. Para animales mayores de 96 h AEL, arrastrar suavemente las colas antes de curar el pegamento UV puede reducir eficazmente la formación de pliegues. Arrastrar las colas de larvas jóvenes no es recomendable porque sus paredes corporales son frágiles.
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Disclosures
Los autores no declaran intereses en competencia.
Acknowledgments
Agradecemos a Lingfeng Tang por establecer una versión anterior del método LarvaSPA; Glenn Swan en Cornell Olin Hall Machine comprar para hacer prototipos anteriores de la cámara de imágenes; Philipp Isermann para la construcción de marcos metálicos y proporcionar sugerencias sobre la fabricación de cuboides PDMS; Instalación de imágenes BRC de Cornell para el acceso a microscopios (financiada por la subvención S10OD018516 de NIH); Maria Sapar para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por una Beca Cornell otorgada a H.J.; un fondo de start-up de Cornell y subvenciones DE NIH (R01NS099125 y R21OD023824) otorgados a C.H. H.J. y C.H. concibieron el proyecto y diseñaron los experimentos. H.J. llevó a cabo los experimentos. H.J y C.H. escribieron el manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
References
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