Summary
Bu protokol, drosophila larvalarının sağlam canlı hayvanlarda 10 saatten daha uzun süre kesintisiz zaman atlamalı görüntüleme elde etmek için bir yöntem inşama yöntemini açıklamaktadır. Bu yöntem larva gövde duvarına yakın birçok biyolojik süreci görüntülemek için kullanılabilir.
Abstract
Canlı görüntüleme hücre biyolojisi sorularını araştırmak için değerli bir yaklaşımdır. Larva vücut duvarı ve iç organların çoğu saydam olduğu için Drosophila larvaözellikle in vivo canlı görüntüleme için uygundur. Ancak, 30 dakikadan uzun süre bozulmamış Drosophila larvalarının sürekli canlı görüntülemesi, invaziv olarak hareketsiz hale getirmek uzun süre larvaları hareketsiz hale getirmek zor olduğu için zor olmuştur. Burada larvaSPA adı verilen ve 10 saatten uzun süre yüksek temporal ve mekansal çözünürlüğe sahip canlı Drosophila larvalarının sürekli görüntülenmesine olanak tanıyan larvaspa adı verilen bir montaj yöntemi salıyoruz. Bu yöntem, uv-reaktif tutkal kullanarak coverslip'e kısmen larva takmayı ve ayrıca polidimethylsiloxane (PDMS) bloğu kullanarak larva hareketini kısıtlamayı içerir. Bu yöntem ikinci instar dan üçüncü instar wandering gelişim aşamalarında larvalar ile uyumludur. Drosophila somatosensoriyel nöronların dinamik süreçlerini incelerken bu yöntemin uygulamalarını gösteriyoruz, buna dendrit büyümesi ve yaralanmaya bağlı dendrit dejenerasyonu da dahil. Bu yöntem aynı zamanda larva gövde duvarı yakınında meydana gelen diğer birçok hücresel süreçleri incelemek için uygulanabilir.
Introduction
Hızlandırılmış canlı görüntüleme dinamik hücresel süreçleri incelemek için güçlü bir yöntemdir. Zaman atlamalı filmlerin sağladığı mekansal ve zamansal bilgiler hücre biyolojisi sorularını yanıtlamak için önemli ayrıntıları ortaya çıkarabilir. Şeffaf vücut duvarı iç yapıların noninvaziv görüntüleme için izin verir çünkü Drosophila larva canlı görüntüleme kullanarak araştırmalar için popüler bir in vivo modeli olmuştur1,2. Buna ek olarak, çok sayıda genetik araçlar Drosophila floresanca etiket anatomik yapılar ve makromoleküllermevcuttur 3. Ancak, Drosophila larvalarının uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesi zordur. Sabit erken embriyolar veya pupa aksine, Drosophila larvaları sürekli hareket, canlı görüntüleme için immobilizasyon gerektiren. Canlı Drosophila larvaları hareketsizleştirmenin etkili yolları arasında kloroform4ile halokarbon yağımontajı, izofluran veya Dichlorvos solüsyonukullanılarakanestezi 5 , ve kapak kaymave mikroskop slayt ı arasında sıkıştırma6. Bu yöntemlerden bazıları mikroskopi için kullanılmış olsa da, bunların hiçbiri uzun süreli canlı görüntüleme de etkili değildir. Konvansiyonel konfokal mikroskopi veya ışık sayfası mikroskobu7,8,9kullanılarak tarama larvalarında vücut duvarı nöronlarının görüntülenmesi için başka yöntemler geliştirilmiştir. Ancak, bu yöntemler larvaların hareketi nedeniyle hücresel dinamikleri izlemek için ideal değildir.
Drosophila larvalarının uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesini sağlamak için yeni yöntemler geliştirilmiştir. Bir polidimethylsiloxane kullanarak (PDMS) "larva çipi", Drosophila larva etkili anestezi olmadan özel bir mikrohazret vakum üretilen emme yoluyla immobilize edilebilir. Ancak, bu yöntem hücre biyolojisi çalışmaları için yüksek zamansal çözünürlük sunmuyor ve hayvan boyutu üzerinde sıkı sınırlamalar vardır10. Bir anestezi cihazı kullanarak başka bir yöntem birden fazla zaman noktalarında Drosophila larvacanlı görüntüleme elde ve nöromüsküler kavşaklar 11 çalışma için uygulanmıştır11,12,13,14,15,16. Ancak, bu yöntem aynı zamanda 30 dakikadan daha uzun süre sürekli görüntüleme için izin vermez ve tekrar tekrar desfluran kullanarak gerektirir, hangi nöral aktiviteyi inhibe edebilir ve biyolojik süreci etkileyebilir17,18. Son zamanlarda, mikroakışkan cihaz ve kriyoanestezi birleştiren yeni bir yöntem kısa süreler için çeşitli boyutlarda larvaları hareketsiz leştirmek için kullanılmıştır (dakika)19. Ancak, bu yöntem bir soğutma sistemi ve immobilizasyon uzun süre lervalar tekrarlanan soğutma gerektirir gibi özel cihazlar gerektirir.
Burada 10 saatten daha uzun süre kesintisiz zaman atlamalı görüntüleme ile uyumlu Drosophila larvaları hareketsiz hale getirmenin çok yönlü bir yöntemini salıyoruz. "Kısmi Bağlanmaya Göre Larva Stabilizasyonu" (LarvaSPA) dediğimiz bu yöntem, larva miğanınözel olarak yapılmış bir görüntüleme odasında görüntüleme için bir kapak kaymasına yapıştırılmasını içerir. Bu protokol, görüntüleme odasının nasıl yapılacağını ve larvaların çeşitli gelişim evrelerinde nasıl monte edilebildiğini açıklar. LarvaSPA yönteminde, istenilen gövde segmentleri UV-reaktif tutkal kullanılarak kapak kaymasına yapıştırılır. Bir PDMS kübik ayrıca larvalara basınç uygulayarak kaçışı önler. Görüntüleme odasındaki hava ve nem, görüntüleme sırasında kısmen hareketsiz olan larvaların hayatta kalmasını sağlar. LarvaSPA'nın diğer tekniklere göre avantajları şunlardır: (1) Yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip, bozulmamış Drosophila larvalarının saatlerce sürekli canlı görüntülenmesine olanak sağlayan ilk yöntemdir; (2) Yöntemin larva boyutu üzerinde daha az sınırlaması vardır; (3) Görüntüleme odası ve PDMS kübikler en az maliyetle imal edilebilir ve yeniden kullanılabilir.
Larva montaj yöntemini tanımlamanın yanı sıra, Drosophila dendritik arborization (da) nöronlarının dendritgelişimi ve dendriter dejenerasyonu için uygulamanın birkaç örneğini savuruyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Görüntüleme odasının yapılması
- Metal çerçeve tipik bir makine mağazasında bir alüminyum blok inşa edilebilir. Çerçevenin özellikleri Şekil 1A'dagösterilmiştir.
- Görüntüleme odasını oluşturmak için metal çerçevenin altını uzun bir kapak kayması (22 mm x 50 mm) ve UV tutkal(Şekil 1A)kullanarak kapatın. Uv tutkalını el yapımı uv lambası kullanarak tedavi edin.
2. PDMS kübik yapma
- PDMS kübikler için kalıp hazırlayın.
- Ambalaj bandı katmanlarını dikdörtgen (80 mm x 55 mm) Petri kabının veya yuvarlak hücre kültür plakasının iç yüzeyine takın. İkinci instar larvaları için bir tabaka (0,063 mm kalınlığında), erken üçüncü yıldız larvaları için 2 kat (0,126 mm kalınlığında) veya geç üçüncü yıldız larvaları için üç kat (0,189 mm kalınlığında) kullanın (Şekil 1B).
- Bandı jiletle belirli genişlikte şeritler halinde kesin: 1 katmanlı bant için 1,5 mm ve 2 katmanlı veya 3 katmanlı bant için 2 mm. Şeridin genişliği ve kalınlığı, son PDMS kübikinin tutabileceği larvaların boyutunu belirler. İki şerit arasında en az 5 mm boşluk bırakın. Alanı kaplayan bant katmanlarını çıkarın (Şekil 1B).
- Yapışkan bant kullanarak plakanın iç yüzeyindeki tozu çıkarın. Kalıp kullanıma hazırdır.
- PDMS karışımını hazırlayın.
- Küçük bir kapta 7 g PDMS tabanını ve 0,7 g kür leme maddesini (10:1 oranı) iyice karıştırın.
- Karışımdan havayı çıkarmak için kabı en az 15 dakika vakum lu bir kurutucuya yerleştirin.
- Yavaş yavaş 1-2 mm kalınlığı(Şekil 1B)ulaşmak için kalıp üzerine PDMS karışımı yaklaşık 5,5 g dökün.
- PdMS karışımını, karışımdan kalan hava kabarcıklarını temizlemek için en az 15 dakika boyunca tekrar vakum kurutucuya yerleştirin. Bir pipet ucu ile son birkaç kabarcıklar break.
- PDMS'yi 65 °C'de bir ısı kuluçka makinesinde düz bir yüzeyde 2 saat boyunca tedavi edin.
- Küfün kenarı boyunca kürlenmiş PDMS gevşetmek ve kalıptan ayırmak için bir jilet kullanın. PDMS'yi oda sıcaklığında iki parça büyük yapışkan bant arasında saklayın.
- Erken ve geç üçüncü instar larvaları için PDMS'yi küboidin uzun tarafının ortasına bant şeridi (adım 2.1.2) tarafından oluşturulan oluk konumlandırarak 8 mm x 2 mmx 1 mm kübik küboidler (Şekil 1B'dekinoktalı çizgiler boyunca) kesin. İkinci yıldız larvaları için küboidi 8 mm x 1 mm x 1 mm'ye kesin.
3. Uzun süreli hızlandırılmış görüntüleme için larva montajı
- Montaj için üst kapak kaymasını hazırlayın.
- Larvaların boyutlarına uyan oluklara sahip altı PDMS kübik seçin. 2.1.1, 2.1.2 ve 2.2.7 adımlarını temel alan önerilen PDMS ritmini ve boyutunu izleyin.
- PDMS'nin yüzeyindeki tozu yapışkan bantla çıkarın.
- Daha sonra PDMS kübiklerini sabitlemek için uzun bir kapak kaymasına (22 mm x 50 mm) dört adet çift taraflı bant (12 mm x 5 mm) takın. Çift taraflı teyp iki adet arasındaki boşluklar PDMS oluk genişliği ile aynı olmalıdır.
- Her PDMS cuboid oluk içine UV tutkal küçük bir damla (~ 1.2 μL) uygulayın ve coverslip üzerinde çift taraflı bant arasındaki boşluğa UV tutkal altı küçük damla ekleyin.
- Larvaları montaja hazırlayın.
- Bir çift forceps kullanarak, vücut yüzeyinden gıda kaldırmak için su daki larvaları temizleyin.
- Bir kapak olmadan küçük bir (35 mm) Petri çanak nemlendirilmiş kağıt küçük bir parça üzerinde temiz larvayerleştirin. Küçük Petri kabını kuru mendil kağıdı içeren büyük (60 mm) petri kabına yerleştirin. Kimyasal bir başlıkta, plastik transfer pipet kullanarak kuru mendil kağıdına 8-12 damla (160-240 μL) uygulayın ve büyük Petri kabının kapağını kapatın.
- Larvaları izlerken 2-3 dk bekleyin. Ağız kancaları hareket etmeyi bıraktıktan sonra büyük Petri kabından larvaları çıkar.
- Hayvanları dağın.
- Hayvanın sırt tarafındaki yapıları görüntülemek için, hareketsiz edilmiş larvaları kapak kaymasına bakan dorsal mite ile kapak taki çift taraflı bant arasındaki UV tutkalının üzerine yerleştirin.
- Her larvayı bir PDMS bloğuyla kapatın ve larvanın gövdesini PDMS'nin oluğuna sığdırın. Larvanın başını ve kuyruğunu PDMS oluğunun dışında bırakın. Larvanın spiracles'ini tutkalla engellemekten kaçının.
- PDMS bloğunun uçlarına, oluk üzerinde kuvvet uygulamadan çift taraflı banda bastırın. PDMS altında miğde düzleştirmek için larva kuyruğunu yavaşça çekin.
- Yüksek ayarda (yaklaşık 0,07 mW/mm2)bir el UV lambası kullanarak 4 dakika boyunca UV tutkal Cure.
DİkKAT: UV lambasını kullanırken gözleri güvenlik gözlükleri ile koruyun. - Kapağı ters çevirin ve 3.3.4 adımını tekrarlayın.
- 20 μL-30 μL su ile küçük bir mercek kağıdını (15 mm x 30 mm) nemlendirin. Nemlendirilmiş mercek kağıdını görüntüleme odasının altına yerleştirin(Şekil 1A,D).
- Larvalar odanın içine bakacak şekilde kapak fişini odaya yerleştirin. Kapağın her iki ucunu da UV tutkal kullanarak metal yüzeye yapıştırın(Şekil 1A,D). Larvaların dorsal tarafı konfokal mikroskop altında görüntülemeye hazırdır (Şekil 1E).
4. Görüntüleme
- Uygun bir mikroskop ile görüntü larvaları. Bu protokolde gösterilen tüm sonuçlar(Şekil 2, Şekil 3, Video S2, Video S3, ve Video S4) 40x (1.30 NA) yağ hedefine sahip bir konfokal sistem kullanılarak elde edildi.
5. Görüntüleme odası ve PDMS kübiklerinin iyileşmesi
- Görüntülemeden sonra, bir lens kağıdı kullanarak üst kapak üzerinde yağ çıkarın. Üst kapağı metal çerçeveden ayırarak kapak ve metal çerçeve arasındaki boşluğu bir jiletle ayırın. Görüntüleme odası yeniden kullanıma hazır.
- PDMS kübiklerini üst kapaktan forceps ile ayırın. Tutkal kalıntısı ve toz kaldırmak için yapışkan bant üzerinde PDMS cuboids rulo. PDMS kübikleri yeniden kullanıma hazır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Larva görüntüleme odası, özel yapım metal çerçeve ve iki kapak birbirine yapıştırılarak oluşturulur. Metal çerçevenin tasarımı Şekil 1A'dabelirtilmiştir. Oda içinde Drosophila larvaları UV tutkal ve PDMS kübikler yardımı ile üst coverslip yapıştırılır. PDMS kübik üzerindeki oluk ve kübik bant, larvaları tutmak için boşluk oluşturmak için bağlanır (Şekil 1B,C). PDMS ayrıca larva gövde duvarını düzleştirmek ve larva hareketini fiziksel olarak kısıtlamak için hafif basınç uygular. Son olarak, ıslak lens kağıt küçük bir parça nem sağlamak için odanın altına yerleştirilir. Bu kurulum drosophila larvaları sürekli görüntüleme için 10 saatten daha uzun süre hareketsiz hale getirebilir. Hayvanların çoğu 10 saat sonra canlı ve pupal aşamasına büyümek için kurtarılabilir. Görüntüleme odası aynı anda dokuz larvayı barındırabilir. Şekil 1D, odaya monte edilmiş altı geç üçüncü yıldız larvası gösteriyor. Larvaların gövdeleri, başları ve kuyrukları hareket etmek için serbestken sabitlenir (Şekil 1E ve Video S1). Bu yöntem, 15 saate kadar sürekli yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile üçüncü instar larvaları gezinmek için ikinci instar görüntü başarıyla kullanılmıştır. Oda dik mikroskoplar kullanarak görüntüleme için tasarlanmıştır, ama kurulum da sadece oda çevirerek ters mikroskoplar için çalışır.
Burada larvaSPA'nın nöronal dendrite dinamiği ve dendrite dejenerasyonu ile sınıf IV da (C4 da) nöronlarını bir model olarak incelemede uygulamalarını gösteriyoruz (Şekil 2, Şekil 3, Videolar S2–S4). C4 da nöronlar larva vücut duvarında bulunan somatosensoriyel nosiceptors vardır, olan dendritler larva epidermis innerve1,20,21,22. C4 da dendrites larva gelişimi boyunca son derece dinamik büyüme davranışları sergilemek, vücut yüzeyinin tam kapsama veya boşluk doldurma sonuçlanan23. C4 da nöronlarda başarıyla fiziksel yaralanma24,25,26,27sonra dendrite dejenerasyon ve rejenerasyon çalışması için kullanılmıştır.
Görüntüleme dendrit dinamiği için, ikinci instarda 48 saat ile ikinci instarda 120 saat AEL arasında değişen larvalar, nokta taramalı konfokal mikroskopi kullanılarak zaman atlamalı görüntüleme için görüntüleme odasına monte edildi. Zaman atlamalı filmler ppk-CD4-tdTom veya UAS-CD4-tdTom tarafından etiketlenen C4 da dendrites büyüme davranışlarını yakalamak için 3 dakika aralığı ile alınmıştır ppk-Gal46tahrik . Görüntüleme dönemi boyunca (12 saate kadar), C4 da nöronların yüksek sıralı dendrit dalları, uzatma, geri çekme, dal oluşumu ve dal eliminasyonu(Şekil 2A–2F)dahil olmak üzere, nöronların sağlığını gösteren karmaşık büyüme davranışları sergiledi. Filmlerimiz de diğer dendritlerle temasa geçtikten sonra dendrit uçlarının geri çekildiği homotipik dendro-dendrit itmeleri yakalamıştı (Şekil 2F). Genel olarak, bu sonuçlar LarvaSPA kullanarak zaman atlamalı görüntüleme nörogelişim çalışmada etkili olduğunu göstermektedir.
Dendrit dejenerasyonu görüntülemek için, C4 da nöronal hücre cisimlerinin yakınında birincil dendritleri ayırmak için Bir MaiTai lazeri kullandık. Larvalar kurtarıldı ve yaralanmadan sonra 1.5 saatten başlayarak görüntüleme odasına monte edildi (AI)(Şekil 3, Video S4). Filmler dendrite dejenerasyonu sırasında önemli olaylar kaydedildi, dendrite şişmesi de dahil olmak üzere, dendrite parçalanma, ve dendrite enkaz temizliği. Aynı deneyde, larva yağ gövdesi de Annexin V-GFP (AV-GFP), hücre yüzeyinde dışsalfosfatidilserin (PS) etiketleri bir sensör salgılamak için tasarlandı27. Biz AV-GFP tarafından dejeneratif dendritlerin özel etiketleme gözlendi (Şekil 3), PS fagositositler tarafından sonraki açıklık için bir yeme-me sinyali olarak hizmet vermek için dejeneratif dendritlerin yüzeyinde maruz olduğunu düşündüren27.
Şekil 1: LarvaSPA montajı için görüntüleme odası. (A) Görüntüleme odasının hem üst görünümü hem de yan görünümü gösteren ayrıntılı özelliklere sahip diyagramları. Üst görünümdeki açık mavi gölgeleme, nemlendirilmiş lens kağıdını gösterir. Oda bir üst kapak ve bir alt kapak kayma ile mühürlü. Monte edilmiş larvanın konumu gösterilmiştir. (B) PDMS kalıbının diyagramları (üst görünüm) ve PDMS karışımı (yan görünüm) ile dolduruldıktan sonra kalıp. Gri şeritler sırasıyla iki 1 katmanlı, iki 2 katmanlı ve iki 3 katmanlı bant şeritleri gösterir. Yan görünümdeki sarı gölgeleme, kalıptaki PDMS karışımını gösterir. Noktalı çizgiler, tedavi edilen PDMS'nin nerede kesilen nerede kesişeceklerini gösterir. Diyagramın yan görünümü ölçekle çizilmez. (C) PdMS kübik bir üst görünümü ve yan görünümünü gösteren fotoğraflar. Ölçek çubuğu = 1 mm. (D) Montajdan önce bir görüntüleme odasını gösteren fotoğraflar ve altı immobilize üçüncü instar Drosophila larvası ile bir görüntüleme odası dorsal tarafı yukarı monte edilmiştir. Ölçek çubuğu = 10 mm. (E) Bir larvanın daha yakın görünümü (D). Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Dendrit dinamiğinin hızlandırılmış görüntülemesi. (A-F) Görüntüleme başladıktan sonra belirli zaman noktalarında sınıf IV da nöron dendrites zaman atlamalı filmlerden seçilen kareler. Larvagörüntüleri 48 h AEL (A ve F), 72 h AEL (B), 96 h AEL (C), ve 120 h AEL (D) alınmıştır. Nöronlar ppk>CD4-tdTom (A, D, E, ve F) veya ppk >CD4-tdTom (B ve C) ile etiketlenir. Mavi oklar bir önceki zaman noktasına göre dendrite geri çekilmelerini gösterir. Sarı oklar önceki zaman noktasına göre dendrite uzantıları gösterir. (E) Görüntüleme 12 saat sonunda dendrit morfolojisi. (F) Bir filmde, ikinci bir instar larvasında bir dendrite dalının nasıl uzatıldığını (sarı oklar) ve daha sonra başka bir denditle temas ettikten sonra (mavi oklar) nasıl geri çekildiklerini gösteren ardışık kareler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Dendrit dejenerasyonunun hızlandırılmış görüntülemesi ve yeme-me sinyalinin maruz ilerlemesi. Lazer yaralanması sonrası bir sınıf IV da nöron dejeneratif dendritler bir zaman atlamalı film seçilen kareler. Dendritler ppk>CD4-tdTometiketiyle etiketlendi. Dejeneratif dendritler üzerinde eat-me sinyal PS Annexin-GFP (AV-GFP), hangi yağ vücut tarafından salgılanır tarafından tespit edildi. Sarı oklar AV-GFP etiketini gösteren dalları gösterir. Mavi oklar parçalanma geçiren dendritleri işaret eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video S1: Üçüncü bir yıldız larvası bir PDMS kübik çentik içinde hareketsiz. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Video S2: Dendritler ikinci bir yıldız larvasında dinamik olarak uzatır ve geri çekilir. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Video S3: Dendrites genişletmek ve bir gezgin üçüncü yıldız larva dinamik olarak geri çekmek. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Video S4: Dendritler dejenere ve üçüncü bir instar larva lazer yaralanması sonrası fosfatidilserin maruz. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada LarvaSPA, uzun süreli hızlandırılmış görüntüleme için canlı Drosophila larvamontaj çok yönlü bir yöntem açıklar. Bu yöntem, larvaların kurtarılmasını veya yeniden monte edilmesini gerektirmez ve kesintisiz görüntüleme sağlar. Bu nedenle, dendrite dejenerasyonu ve rejenerasyon gibi tamamlanması saatler alan biyolojik süreçleri izlemek için idealdir. Bu yöntem aynı zamanda hücre içi kalsiyum dinamikleri ve mikrotübül büyümesi gibi hücre altı olayları görüntüleme için kullanılabilir. Larva gövde duvarı görüntüleme sırasında kararlı olduğundan, mekansal ve zamansal çözünürlük eldeki görüntüleme uygulamasına uyacak şekilde ayarlanabilir (örn. hızlı hücre altı vezikül hareketini izlemek veya nöronal dal desenlerinin yavaş küresel değişimlerini izlemek için). Buna ek olarak, bu yöntem çeşitli gelişim aşamalarında larvaile uyumludur ve özel ekipman gerektirmez. Böylece, LarvaSPA potansiyel olarak çeşitli sorulara cevap birçok Drosophila laboratuvarları tarafından kullanılabilir.
PDMS kübikinin doğası ve larvaların gelişim evresi de dahil olmak üzere yöntemin başarısını etkileyen faktörler
PDMS kübik boyutu ve oluk derinliği larvaların boyutu maç gerekir. Larvalar için çok geniş bir PDMS kübik baş ve kuyruk kaplayabilir ve hipoksiye neden olabilir. Ancak, dar bir PDMS kübik larvaların hareket etmesini önlemede etkili olmayabilir. Benzer şekilde çok derin bir oluk larvaların hareketini dizginlemek için yeterli basınç oluşturmaz. Çok sığ bir oluk larvaları örtüye yapıştıracak kadar tutkal tutmaz. Deneyimlerimize dayanarak, pdms ve oluk aşağıdaki boyutları larvaların çeşitli aşamaları için tavsiye edilir: 8 mm x 1 mm x 1 mm PDMS kübik 1.5 mm x 1 mm x 0.063 mm oluklar ikinci yıldız larvaları için (~48 h AEL); Erken üçüncü yıldız larvaları için 8 mm x 2 mm x 1 mm PDMS kübikler 2 mm x 2 mm x 0,126 mm oluklar (~72 h AEL); 8 mm x 2 mm x 1 mm PDMS kübik 2 mm x 2 mm x 0,189 mm oluklar geç üçüncü yıldız larvaları için (~96 h AEL veya daha büyük).
Gezgin üçüncü instar larvaları (120 h AEL'de veya daha yaşlı) genç olanlara göre daha az hareket eder ve hazne monte edilip bir kez daha az nem gerektirir. Onlar da kalın bir mitikül var ve daha fazla fiziksel strese dayanabilir. Bu nedenle, üçüncü yıldız larvaları kullanarak yapılan deneyler en yüksek başarı oranına sahiptir. Ellerimizde, üçüncü instar larvalarının %80'inden fazlası hayatta kaldı ve montajdan sonra 12 saat hareketsiz kaldı. Görüntüleme sırasında larvaların yavrulanmasını önlemek için larvaların 96 h ile 120 h AEL arasında monte edilmesinizi öneririz. Genç üçüncü yıldız larvaları görüntüleme sırasında kaçma veya ölme şansı daha yüksek. Tipik olarak, aynı odaya monte edilen 6 genç üçüncü yıldız larvasının en az 2'si hayatta kalır ve monte ettikten sonra 10 saat hareketsiz kalır. İkinci yıldız larvaları ile deneyimimiz sınırlıdır ve hayatta kalma oranını tahmin etmek zordur. Yine de bu yöntemi kullanarak 7 saat boyunca ikinci instar larvalarını başarıyla görüntüledik.
Uzun süreli görüntülemenin potansiyel kaygıları
LarvaSPA dendrit büyüme dinamikleri ve dejenerasyon görüntüleme için çok yararlı olmasına rağmen, göz önünde bulundurulması gereken birkaç potansiyel uyarılar vardır. İlk olarak, mevcut yöntemimizde, larvalar görüntüleme nin tüm süresi boyunca gıdalardan mahrum bırakılırlar ve bu da birçok dokuda açlıkla bağlı tepkilere yol açabilir. Montajdan sonra epidermal hücrelerde granüler yapıların oluşumunu gözlemledik, bu da otofajiden kaynaklanabilir. Bu nedenle, görüntülemenin ilk birkaç saatinde elde edilen sonuçlar fizyolojik olarak daha alakalı olmalıdır. Daha uzun zaman ölçekleri üzerindeki sonuçlar daha dikkatli yorumgerektirir. Bu endişeyi en aza indirmek için, prosedürümüz larva beslemesine izin verecek şekilde uyarlanabilir. İkinci olarak, yöntemimiz fiziksel kısıtlama ve besin alımının eksikliği nedeniyle genç larvaların hızlı büyümesini engelleyebilir. Ancak, bu endişe yaşlı hayvanlar için geçerli olmayabilir. Örneğin, üçüncü instar larvaları gezinmek 12 saat sürekli görüntülemeden sonra bile pupaya dönüşebilir, bu yöntem erken metamorfoz araştırmaları için idealdir. Üçüncü olarak, yağ vücut ve bağırsak gibi derin yapıların görüntülenmesi bazı zorluklar sunar. Bunun temel nedeni, daha derin dokuların görüntüleme sırasında genellikle hareket ediyor olması ve bu nedenle postprocessing'de hareket düzeltmesi gerektirmesidir. Ayrıca, ışık yolundaki refraktif indekslerin uyumsuzlukları daha derin dokuları görüntülerken küresel sapmalara neden olabilir. Dendritleri vücut yüzeyinden 15 μm uzakta olduğu için yağ hedefleri görüntüleme da nöronların görüntülemesi için uygun olmakla birlikte, su daldırma hedefleri larvaların daha derinlerini görüntülemek için kırılma indeks uyuşmazlıklarını düzeltmek için daha iyi seçenekler olabilir. Dördüncü, C4 da nöronlar UV ışığı ile aktive edilebilir çünkü28, larva montaj sırasında UV ışığı kullanarak potansiyel C4 da nöron fizyolojisi değiştirebilir. Tavsiye ettiğimiz ışık yoğunluğu C4da nöronlarını sağlam bir şekilde aktive eden seviyelerin çok altında olmasına rağmen28,C4da nöronal aktivitesi ile ilgili sonuçların ihtiyatlı bir şekilde yorumlanması gerekir. UV tutkal biyolojikörnekleringeniş bir yelpazede görüntüleme için kullanılmıştır 29,30,31 ve elimizde larvalar için bariz toksisite neden olmaz. Son olarak, bir in vivo canlı görüntüleme için uygun mikroskop kurulumu düşünmelisiniz. Örneğin, rezonans tarayıcıları ve dönen disk konfokal mikroskopları daha az fototoksisite ve fotobeyazrlama neden çünkü uzun vadeli canlı görüntüleme için daha iyi seçeneklerdir; multi-foton mikroskopi larvalarda daha derin iç yapıların görüntülenmesinde daha etkilidir; uzun süreli görüntüleme, numune veya odak kaymasına yatkın olabilir ve bu da post-görüntüleme işlemi ile düzeltilebilir.
LarvaSPA için en sık karşılaşılan başarısızlık nedenleri ve bunları gidermek için önerilen çözümler
- Larvalar çok fazla hareket veya kaçış: İki yaygın neden bu soruna katkıda bulunabilir. Birincisi, PDMS oluğunun larvalar için çok sığ veya çok derin olabileceğidir. Farklı bir oluk derinliği ile başka bir PDMS cuboid çalışıyor sorunu çözebilir. İkinci neden, uv tutkal zayıflatma, odasında çok fazla nem olmasıdır. Haznedeki mercek kağıdına eklenen su hacminin azaltılması larvaların hareketsiz hale getirilene yardımcı olabilir. Buna ek olarak, baş ve kuyruk hareket etmek için ücretsiz olduğundan, pdms cuboid tarafından kapsanan sadece segmentleri görüntü deneyin.
- Larvalar görüntüleme sırasında ölür: Görüntülemeden hemen sonra bir larva ölürse, çok fazla anesteziye maruz kalmış olabilir. Düzgün anestezi larvalar montaj dan sonra uyanmak ve ağız kancası uzantısı ve geri çekme ve dorsal damar daralma dahil hareketleri göstermek gerekir. Bu sorunu çözmek için, daha az isofluranlar larvaları anestezik için kullanılabilir. Ağız kancası hareket etmeyi bıraktıktan hemen sonra anestezi petri kabından bir larva aktarın. Larva görüntülemeden yaklaşık bir saat sonra ölürse, genellikle dehidratasyon nedeniyle. Sızdırmazlık yapmadan önce görüntüleme odasına bir parça nemlendirilmiş lens kağıdı yerleştirmeyi unutmayın. Öldürücülük bir diğer yaygın nedeni UV tutkal blokları spiracles olmasıdır. Larva orta segmentleri UV tutkal sınırlamak ve baş ve kuyruk kapsayan kaçının deneyin. Bir aşırı geniş PDMS cuboid de kolayca spiracles engellemek için UV tutkal neden olabilir.
- Vücut duvarındaki kıvrımlar görüntülemeyi engellemez: Montaj sırasında kıvrım ların oluşmasını önlemek için anestezi adımında larvaları tamamen hareketsiz hale getirmek önemlidir. Bir larva felç olduğunda, vücudu düzeltmek ve germek daha kolaydır. 96 saat AEL'den büyük hayvanlar için, UV tutkalı kürlemeden önce kuyrukları hafifçe sürüklemek kat oluşumunu etkili bir şekilde azaltabilir. Vücut duvarları kırılgan olduğu için genç larvaların kuyruklarını sürüklemek önerilmez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip çıkarları beyan.
Acknowledgments
Biz LarvaSPA yönteminin önceki bir sürümünü kurmak için Lingfeng Tang teşekkür; Glenn Swan Cornell Olin Hall Machine mağazasında görüntüleme odasının önceki prototipleri yapmak için; Philipp Isermann metal çerçeveler inşa etmek ve PDMS kübik ler yapma konusunda öneriler sunmak için; Mikroskoplara erişim için Cornell BRC Görüntüleme tesisi (NIH hibe S10OD018516 tarafından finanse edilmektedir); Maria Sapar makalenin eleştirel okuması için. Bu çalışma, H.J.'e verilen Cornell Bursu ile desteklenmiştir; C.H.J. ve C.H.'ye verilen Bir Cornell başlangıç fonu ve NIH hibeleri (R01NS099125 ve R21OD023824) projeyi tasarladı ve deneyleri tasarladı. Deneyleri H.J. yaptı. Taslağı H.J. ve C.H. yazdı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
References
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Daniele, J. R., Baqri, R. M., Kunes, S. Analysis of axonal trafficking via a novel live-imaging technique reveals distinct hedgehog transport kinetics. Biology Open. 6 (5), 714-721 (2017).
- Csordas, G., et al. In vivo immunostaining of hemocyte compartments in Drosophila for live imaging. PLoS One. 9 (6), 98191 (2014).
- Han, C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Enhancer-driven membrane markers for analysis of nonautonomous mechanisms reveal neuron-glia interactions in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9673-9678 (2011).
- He, L., et al. Direction Selectivity in Drosophila Proprioceptors Requires the Mechanosensory Channel Tmc. Current Biology. 29 (6), 945-956 (2019).
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. The Journal of Neuroscience. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Vaadia, R. D., et al. Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy. Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 481-489 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 476-480 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).
- Zhang, Y., et al. In vivo imaging of intact Drosophila larvae at sub-cellular resolution. Journal of Visualized Experiments. (43), e2249 (2010).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 558, Pt 2 489-502 (2004).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).
- Chaudhury, A. R., et al. On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications. Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Poe, A. R., et al. Dendritic space-filling requires a neuronal type-specific extracellular permissive signal in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (38), 8062-8071 (2017).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).
- Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration. Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).
- Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Desjardins, M., et al. Awake Mouse Imaging: From Two-Photon Microscopy to Blood Oxygen Level-Dependent Functional Magnetic Resonance Imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Huang, C., et al. Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies. Nature Communications. 9 (1), 872 (2018).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).
