Method Article

冷冻组织部分多光谱荧光成像的快速方法

DOI:

10.3791/60806

⸱

March 30th, 2020

 ,  ,  , 
1Robert Lurie Comprehensive Cancer Center and Department of Dermatology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, 3Department of Microbiology and Immunology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

In This Article

Summary

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我们描述了一种快速染色方法，用于对冷冻组织进行多光谱成像。

Abstract

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在正式固定石蜡嵌入 （FFPE） 组织中进行多光谱荧光成像，能够检测单个组织样本中的多个标记，从而提供有关标记的抗原共表达和空间分布的信息。然而，缺乏适合正式固定组织的抗体可能会限制可检测到的标记的性质。此外，染色方法非常耗时。在这里，我们描述了一种在冷冻组织中执行多光谱荧光成像的快速方法。该方法包括所使用的荧光波组合、小鼠和人类冷冻组织染色的详细步骤，以及扫描、采集和分析程序。对于染色分析，使用了商用半自动多光谱荧光成像系统。通过这种方法，在单个冷冻组织部分中，多达六个不同的标记被染色和检测。机器学习分析软件可以表型细胞，可用于定量分析。此处描述的冷冻组织方法可用于检测在 FFPE 组织中无法检测到的标记或 FFPE 组织不能针对的抗体。

Introduction

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最近显微成像技术的进步大大增进了我们对生物过程和疾病状态的了解和理解。通过致色免疫组织化学（IHC）对组织中的蛋白质进行原位检测，在病理学中进行。然而，使用色谱IHC染色检测多个标记是具有挑战性的1，使用多路免疫荧光（mIF）染色方法的较新的方法，其中多个生物标记标记在单个组织样本上，正在开发中。多个生物标记的检测是有用的，因为有关组织结构、细胞空间分布和抗原共表达的信息都捕获在单个组织样本2中。多光谱荧光成像技术的使用使得检测多种生物标记成为可能。在这项技术中，使用特定的光学元件可以分离或"不混合"每个荧光波的荧光光谱，从而在没有任何光谱串扰3的情况下检测多个标记。多光谱荧光成像正在成为细胞生物学、临床前药物开发、临床病理学和肿瘤免疫功能44、5、65,6的关键方法。重要的是，免疫细胞（特别是CD8 T细胞）的分量可以作为现有肿瘤患者的预后因子7。

已经开发了多种荧光染色的各种方法，可以同时或按顺序执行。在同时染色的方法中，所有抗体在一个步骤中作为鸡尾酒一起加入，以标记组织。UltraPlex 技术使....

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Protocol

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小鼠脾脏和HLF16小鼠肿瘤组织23是从我们的实验室获得的。人扁桃体组织是从一家商业供应商那里购买的。详情载于资料表。

1. 组织嵌入

  1. 将新鲜组织嵌入 OCT（最佳切割温度）溶液中，并使用干冰或液氮进行卡扣冻结。
  2. 将组织储存在-80°C。

2. 冷冻切除

  1. 在低温器中切割 8 μm 部分，温度设定为 -25 °C。
    注:可以调整首选截面厚度以生成更清晰的图像。
  2. 将部分放置在带电的玻璃幻灯片上。
  3. 在室温 （RT） 下将部分干燥 1 小时，在组织学级冰冷的丙酮中固定 10 分钟。
    注:丙酮导致水溶性蛋白质的凝固，并提取脂质，但不影响含碳水化合物成分。相反，正式在保存大多数脂质，对碳水化合物的影响很小24。固定性选择很重要，具体取决于检测到的标记的选择。
  4. 将幻灯片存放在 -20 °C。

3. 抗体和氟波拉的选型

注:在组织染色之前，必须验证抗....

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Results

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检测冷冻脾脏部分的单染色标记
由于半自动成像系统使用液晶可调滤波器（LCTF）系统，允许更广泛的波长检测25，并且由于这里没有执行信号放大步骤，我们首先优化了显微镜上每个标记的初级结合抗体的检测。如图 1所示，其中每个单染色标记均为伪彩色红色。此处使用的Alexa Fluor偶联抗体已通过公司验证为免疫荧光和流细胞测定。但是，Per-CP-Cy5.5 荧光波只经过流量细胞测定验证。我们能够在我们的单染色幻灯片中检测到这种颜色，支持流细胞测量验证抗体是否适合用于多光谱成像，并提供了使用这种抗体使用两种不同技术（即流细胞学和多光谱成像）验证观测结果的好处。然后，我们继续对冷冻组织进行多光谱成像。

冷冻小鼠脾脏的多色荧光检测
为了测试多路染色方法和光谱成像，我们使用小鼠冷冻脾组织，具有丰富的免疫细胞。图 2显示了冷冻小鼠脾脏部分中不同标记的光谱.......

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Discussion

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冷冻组织已广泛用于mIF成像，传统上使用直接和间接方法32检测组织上的3到4个标记31。在直接方法中，抗体与荧光染料或量子点33结合以标记组织，而在间接方法中，非结合原抗体用于标记组织，然后由专门识别原抗体的氟磷结合二次抗体标记。前面讨论的一些最近同时使用的多路复用染色方法也可用于染色冷冻组织和检测四个以上的标记。但是，根据检测到的标记数量，试剂的成本和染色时间会变得密集。冷冻组织的另一种多路复用技术是多上皮-配体制图（MELC）34。该技术涉及用荧光球结合抗体染色样品，成像和荧光球的光漂白。这项技术的一个主要警告是，只有一个场或区域的组织可以多路复用。为了多路复用其他字段或区域，需要手动执行技术，这非常耗时，或者需要自动化，这非常昂贵。一组35能够检测冷冻组织上的六种颜色，使用直接、间接和TSA染色的组合。然而，组织染色花了2天。相比之下，我们的方法采用同时多路染色的方法，涉及在90分钟内应用五种直.......

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Disclosures

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提交人没有利益冲突可披露。

Acknowledgements

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成像和分析指导由研究资源中心提供——芝加哥伊利诺伊大学研究组织学和组织成像核心，该中心由研究副校长办公室提供支持。这项工作得到了NIH/NCI RO1CA191317对中电的支持，国家卫生研究院/NIAMS（SBDRC向A.Paller博士授予1P30AR075049-01），以及罗伯特·卢里综合癌症中心对西北大学免疫治疗评估核心的支持。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
丙酮（组织学级）Fisher ScientificA16F-1GAL固定组织
Alexa Fluor 488 抗小鼠 CD3BioLegend100212克隆 - 17A2;一抗偶联抗体
Alexa Fluor 488，eBioscience 抗人 CD20ThermoFisher Scientific53-0202-82克隆 - L26;一抗偶联抗体
Alexa Fluor 555 小鼠抗 Ki-67BD生物科学 558617一
Alexa Fluor 594 抗人 CD3BioLegend300446克隆 - UCHT1;一
Alexa Fluor 594 抗小鼠 CD8aBioLegend100758克隆 - 53-6.7;一
Alexa Fluor 647 抗人 CD8aBioLegend372906克隆 - C8/144B;一抗偶联抗体
Alexa Fluor 647 抗小鼠 CD206 （MMR）BioLegend141711克隆 - C068C2;一抗偶联抗体
Alexa Fluor 647 抗小鼠 CD4 抗体BioLegend100426克隆 - GK1.5;一抗偶联抗体
C57BL/6 小鼠Charles River Laboratories27用于多光谱训练的小鼠冷冻组织
Coplin JarSigma AldrichS6016-6EA再水化和洗涤玻片
DAPI解决方案BD Biosciences 564907核酸染色
钻石白色 玻璃带电玻片DOT ScientificDW7590W粘附组织切片
Dulbecco磷酸盐缓冲盐水 1x（不含钙和镁）Fisher ScientificMT21031CV洗涤和稀释剂
金密封盖玻片ThermoFisher Scientific3306保护染色组织
人正常扁桃体 OCT 冷冻组织块AMSBioAMS6023用于多光谱染色的人冷冻组织
人血清 1xGemini Bio-Products100-512人体组织的封闭剂和稀释剂
in告知Akoya Biosciences版本 2.4.1机器学习软件
PerCP/Cyanine5.5 抗人 CD4BioLegend300529克隆 - RPA-T4;一抗偶联抗体
PerCP-Cy 5.5 大鼠抗 CD11bBD Biosciences550993克隆 - M1/70;一抗偶联抗体
PhenochartAkoya Biosciences版本 1.0.8全玻片扫描软件
ProLong Diamond 抗淬灭封片剂ThermoFisher ScientificP36965封固剂
研究 低温恒温器Leica BiosystemsCM3050 S切片组织
Superblock 1xThermoFisher Scientific37515封闭小鼠组织
Tissue-Tek OCT 解决方案Sakura Finetek4583包埋组织
Vectra 3.0 自动定量病理成像系统，6 张载玻片Akoya Biosciences CLS142568半自动多光谱成像系统
Vectra SoftwareAkoya BiosciencesVersion 3.0.5作显微镜的软件
抗 抗 抗

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
  2. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C.

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