इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके टीएनबी-प्रेरित क्रोन रोग के साथ चूहों के कोलोन में एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स का दृश्य
Summary
प्रोटोकॉल क्रोन की बीमारी का एक पूर्ण मान्य टीएनबी-प्रेरित मूत्र मॉडल और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स के दृश्य के लिए तरीकों को प्रस्तुत करता है, जो पैराफिन में एम्बेडेड फॉर्मेलिन-फिक्स्ड कोलन वर्गों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करता है।
Abstract
क्रोन की बीमारी भड़काऊ आंत्र रोग का सबसे निदान प्रकार है। आंत में विकसित होने वाली पुरानी सूजन पेरिस्टैलसिस विकार और आंतों के म्यूकोसा के नुकसान की ओर ले जाती है और पेट के नियोप्लास्टिक परिवर्तन के बढ़ते जोखिम से जुड़ा हुआ प्रतीत होता है। साक्ष्य जमा करने से पता चलता है कि एस्ट्रोजन और एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स न केवल हार्मोन के प्रति संवेदनशील ऊतकों को प्रभावित करते हैं, बल्कि फेफड़ों या पेट जैसे एस्ट्रोजन से सीधे संबंधित अन्य ऊतक भी प्रभावित करते हैं। यहां, हम टीएनबीएस-प्रेरित क्रोन रोग के एक मूत्र मॉडल से प्राप्त कोलन में एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स के सफल इम्यूनोफ्लोरेंस धुंधला के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। चूहों और आंत की तैयारी में क्रोन की बीमारी को शामिल करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है और साथ ही फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड आंत वर्गों का उपयोग करके एक कदम-दर-कदम इम्यूनोहिस्टो रासायनिक प्रक्रिया प्रदान की जाती है। वर्णित तरीके न केवल वीवो में एस्ट्रोजन रिसेप्टर डिटेक्शन और एस्ट्रोजन सिग्नलिंग जांच के लिए उपयोगी हैं बल्कि अन्य प्रोटीन के लिए भी लागू किए जा सकते हैं जो कोलाइटिस के विकास में शामिल हो सकते हैं।
Introduction
क्रोन की बीमारी (सीडी) एक भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) है जो पुरानी आंत की सूजन के रूप में प्रकट होती है। सीडी के एटिजियोलॉजी को खराब समझा जाता है, लेकिन कुछ प्रमुख कारक हैं जो सीडी विकास के लिए जिम्मेदार दिखाई देते हैं, जिनमें आंतों के माइक्रोबायोटा, और आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारक शामिल हैं, जैसे आहार या तनाव1। क्रोन की बीमारी के रोगजनन की बेहतर समझ के लिए, आंतों की सूजन के कई मॉडलों का उपयोग2,,3,,4,,55,6,,7किया गया है। इस लेख में, हम सीडी के 2,4,4,6-ट्रिनिटरोबेंजीन सल्फोनिक एसिड (टीएनबी) प्रेरित मूत्र मॉडल से प्राप्त परिणाम प्रस्तुत करते हैं।
यह दस्तावेज दिया गया है कि एस्ट्रोजन पुरानी आंतों की सूजन8,9,,10,,11,12को कम करने में सक्षम हैं । एस्ट्रोजन की जैविक गतिविधि को कॉग्नेट रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता की जाती है, जिनमें से परमाणु एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स (ईआरएस), यानी, ईआरα (जीन ESR1)और ERο (जीन ESR2),साथ ही जी प्रोटीन-युग्मित एस्ट्रोजन रिसेप्टर, यानी, जीपीआर (जीन GPER1),झिल्ली-बाउंड ईआर13, 14,14के रूप में संदर्भित हैं। एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स के स्तर का निर्धारण करने के लिए कई तरीके हैं, लेकिन आंत में उन्हें कल्पना करने के लिए केवल कुछ ही उपयोग किया जा सकता है।
इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) फ्लोरोक्रोम-कंजुगेड एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं या ऊतकों में कुछ एंटीजन का पता लगाने के लिए नैदानिक और बुनियादी अध्ययनों में एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है। आईएचसी ऊतक संरचना दृश्य में एक महत्वपूर्ण तरीका लगता है, साथ ही विशिष्ट प्रोटीन की पहचान और स्थानीयकरण में, जो कोलाइटिस के विकास को समझने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है। यहां, हम इम्यूनोलुओरेसेंस का उपयोग करके आंत में एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विजुअलाइजेशन के लिए एक पूर्ण और मान्य प्रोटोकॉल पेश करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
आईबीडी रोगविज्ञान परीक्षा के लिए कई पशु मॉडल हैं, जिनमें आनुवंशिक, इम्यूनोलॉजिकल या सहज मॉडल, साथ ही रासायनिक रूप से प्रेरित मॉडलशामिलहैं। कोलाइटिस के कई प्रकार के पशु मॉडलों में, इस प्रोटोक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम लॉड्ज़ प्राधिकरणों के विश्वविद्यालय की वित्तीय सहायता के लिए धन्यवाद प्रकाशित किया गया था: वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए वाइस-रेक्टर, राष्ट्रीय और अंतरराष्ट्रीय सहयोग के लिए वाइस-रेक्टर और जीव विज्ञान और पर्यावरण संरक्षण संकाय के डीन। डैमियन जैसेनिक को राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र, पोलैंड से अनुदान (2017/24/T/NZ5/00045 और 2015/17/N/NZ5/00336) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Animals | |||
| BALB/C mice | University of Lodz | NA | |
| Equipment | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| Cardboard block | NA | NA | |
| Confocal microscope – TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Fully automated rotary microtome – RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Glass slide | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Heated Paraffin Embedding Module – EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Histological box | Marfour | LN.138747 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Laboratory balance | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X software | Leica Biosystems | NA | |
| Metal mold | Marfour | CP.5105 | |
| Sterile gauze | NA | NA | |
| Sterile scissor | NA | NA | |
| Sterile tweezer | NA | NA | |
| Tissue processor – TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 secondary antibody | Abcam | ab96886 | |
| ERα primary antibody | Abcam | ab75635 | |
| ERβ primary antibody | Abcam | ab3576 | |
| Ethanol | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| Formaldehyde | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER primary antibody | Abcam | ab39742 | |
| Hydrochloric acid | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
| Hydrogen peroxidase | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
| isoflurane (forane) | Baxter | 1001936040 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrie dish | Nest Scientific | 705001 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Physiological saline | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiotic) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| Sodium chloride | Chempur | WE/231-598-3 | |
| Sodium citrate | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |
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