Summary
Protokollen presenterer en fullstendig validert TNBS-indusert murine modell av Crohns sykdom og metoder for visualisering av østrogenreseptorer ved immunhistokjemi ved hjelp av immunofluorescens av formalin-faste kolon seksjoner innebygd i parafin.
Abstract
Crohns sykdom er den mest diagnostiserte typen inflammatorisk tarmsykdom. Kronisk betennelse i tarmen fører til peristaltikklidelse og skade på tarmslimhinnen og synes å være forbundet med økt risiko for kolonneoplastisk transformasjon. Akkumulerende bevis indikerer at østrogener og østrogenreseptorer påvirker ikke bare hormonfølsomme vev, men også andre vev som ikke er direkte relatert til østrogener, som lungene eller tykktarmen. Her beskriver vi protokollen for vellykket immunfluorescensfarging av østrogenreseptorer i tykktarm hentet fra en murinemodell av TNBS-indusert Crohns sykdom. En detaljert protokoll for induksjon av Crohns sykdom hos mus og tarmforberedelse er gitt, samt en trinnvis immunohistokjemisk prosedyre ved hjelp av formalin-faste parafin-innebygde tarmseksjoner. De beskrevne metodene er ikke bare nyttige for østrogen reseptor deteksjon og østrogen signalering undersøkelse in vivo men kan også brukes på andre proteiner som kan være involvert i utviklingen av kolitt.
Introduction
Crohns sykdom (CD) er en inflammatorisk tarmsykdom (IBD) manifestert som kronisk tarmbetennelse. Etiologien til CD er dårlig forstått, men det er noen viktige faktorer som synes å være ansvarlig for CD-utvikling, inkludert intestinal mikrobiota, og genetiske og miljømessige faktorer, som kosthold eller stress1. For en bedre forståelse av patogenesen av Crohns sykdom, har flere modeller av tarmbetennelse blitt brukt2,3,4,5,6,7. I denne artikkelen presenterer vi resultater hentet fra en 2,4,6-trinitrobenzen sulfonsyre (TNBS)-indusert murine modell av CD.
Det har blitt dokumentert at østrogener er i stand til å modulere kronisk tarmbetennelse8,9,10,11,12. Den biologiske aktiviteten til østrogener formidles av cognate reseptorer, blant annet er kjernefysiskøstrogen reseptorer (ERs),13,14dvs. ESR1 ESR2 GPER1 Det finnes flere metoder for å bestemme nivået av østrogenreseptorer, men bare noen få kan brukes til å visualisere dem i tarmen.
Immunohistochemistry (IHC) er en mye brukt metode i kliniske og grunnleggende studier for påvisning av visse antigener i celler eller vev med fluorokrom-konjugerte antistoffer. IHC synes å være en viktig metode i vevstruktur visualisering, samt i identifisering og lokalisering av spesifikke proteiner, som kan være avgjørende for å forstå utviklingen av kolitt. Her presenterer vi en komplett og validert protokoll for immunohistokjemisk visualisering av østrogenreseptorer i tarmen ved hjelp av immunofluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrestudier ble utført med samtykke fra den lokale etiske komiteen (28/ŁB29/2016) i samsvar med eu-parlamentets direktiv 2010/63/EU og rådet 22.
1. TNBS-indusert murine modell av Crohns sykdom
MERK: Denne protokollen bruker mannlige BALB/C-mus som veier 25-28 g. Dyr er plassert ved konstant temperatur (22-24 °C) og relativ fuktighet 55 ± 5%, og vedlikeholdes i en 12 timer lys /mørk syklus med fri tilgang til standard chow pellets og vannalibitumfra springen .
- Plasser musen i induksjonskammeret og lukk lokket tett. Bedøve musen kort med isofluran (25% O2 med O2 strømningshastighet på 1,5-2 L / min).
MERK: Respirasjonshastigheten skal forbli rytmisk og langsommere enn normalt, og bør ikke endres som svar på en skadelig stimulans. - Innpode 4 mg TNBS i 0,1 ml 30% etanol i 0,9% NaCl eller 0,1 ml 30% etanol i 0,9% NaCl som kjøretøykontroll inn i distal kolon gjennom et kateter.
MERK: Kateteret skal forsiktig innføres ca. 3 cm inn i anusen. - Overvåk musen daglig fra dag to til åtte for kliniske parametere, inkludert kroppsvekt, rektal blødning, avføringkonsistens og dødelighet.
- På dag åtte, euthanize musen ved cervical forvridning.
Figur 1: Tidslinje for TNBS-indusert murinemodell av Crohns sykdom. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Separasjon og makroskopisk evaluering av kolon
MERK: En dag før kolonseparasjon fortynner du 100 μL antibiotika i 1 ml fosfatbuffersaltin (PBS) og la den stå ved 4 °C over natten.
- Rengjør huden over magen ved hjelp av 75% etanol og steril gasbind.
- Skjær bukveggen fra brystbein til anus ved hjelp av steril saks og pinsett.
- Klipp av tykktarmen så nært som mulig til anus og cecum.
- Plasser tykktarmen på Petri-fatet. Skjær tykktarmen sammen fra anus etden. Rengjør og vask tykktarmen 2-4 ganger i kald antibiotika-PBS-løsning.
- Utfør makroskopisk evaluering ved hjelp av en caliper i henhold til tabell 1.
MERK: Vevsvedheft* og erytem/blødning#, fekal blod# og diaré# er gjenstand for visuell vurdering. * Vevvedhesjon evaluere ved hjelp av en tre-punkts skala (0: kolon uten vev vedheft, 1: kolon med moderat vev vedheft, 2: kolon med omfattende vev vedheft); #basert på fravær (0) eller tilstedeværelse (1) av erytem /blødning, fekal blod og diaré.
| Vedhesjon* | Erythema/ blødning# | Fekalblod | Diaré# | Lengden på sår | Tykktarmtykkelse | Tykktarmlengde |
| poeng (0 – 2) | poeng (0 – 1) | poeng (0 – 1) | poeng (0 – 1) | cm/punkter | mm/punkter | cm/punkter |
| 0 – fraværende | 0 – fraværende | 0 – fraværende | 0 – fraværende | 0,5 cm = 0,5 poeng | n mm = n poeng | 0 – <10 % kortere enn kontrollen |
| 1 – moderat | 1 – nå | 1 – nå | 0.5 – liten/løs avføring | 1 – fra 10 til 20 % kortere enn kontrollen | ||
| 2 – nå | 1 – nå | 2 – over 20 % kortere enn kontrollen |
Tabell 1: Makroskopisk skåring av tarmen av mus med TNBS-indusert modell av Crohns sykdom.
- Konverter lengden på såret i centimeter til en punktskala, det vil si at hver 0,5 cm sår regnes som 0,5 poeng. Konverter tykkelsen på tykktarmen i millimeter til en punktskala, det vil si at hver n mm tilsvarer n punkter.
- Konverter lengden på tykktarmen i centimeter på en trepunktsskala. Lengden på tykktarmen oppnådd fra hver mus med TNBS-indusert Crohns sykdom evalueres i forhold til gjennomsnittlig kolonlengde for kontrollgruppen (0: <10% kortere enn kontrollen, 1: fra 10 til 20% kortere enn kontrollen, 2: over 20% kortere enn kontroll).
- Beregn den totale makroskopiske poengsummen i henhold til ligningen: Total makroskopisk poengsum = vedheft (poeng) + erytem /blødning (poeng) + fekal blod (poeng) + diaré (poeng) + lengde på sår (poeng) + kolontykkelse (poeng) + kolonlengde (poeng).
3. Kolon prøve forberedelse
- Skjær tykktarmen i 1-2 cm fragmenter og legg hver på svamp i en passende merket histologisk kassett.
MERK: Svamper for histologiske kassetter forhindrer kolonfolding under dehydrering og inkubasjon i flytende parafin. - Plasser kolonfragmentet i 4% formaldehyd og inkuber i minst 24 timer ved 4 °C.
- Forbered og programmer vevprosessoren for 1 h inkubasjon i 50%, 70%, 90%, 95%, 100% etanol, xylen/100% etanol (1:1; v/v), og xylen bare, samt i minst 3 h inkubasjon i flytende paraffin.
MERK: Dehydrering må utføres i økende konsentrasjoner av etanol og xylen, men konsentrasjonen av etanol kan endres. Xylen/etanolblandingen anbefales, men ikke nødvendig. - Overfør kolonfragmentet til en histologisk boks og plasser i den forhåndsprogrammerte vevsprosessoren.
- Kjør vevsprosessoren.
- Etter inkubasjonstrinn plasserer du kolonfragmentet i en metallform slik at de to endene av tykktarmen er i oppreist stilling og fyller en tredjedel av formen med flytende parafin.
- Plasser formen i kjøleområdet (-5 °C) i noen sekunder, og flytt deretter formen til varmeområdet (70 °C). Plasser i den nederste delen av den histologiske boksen og dekk hele kolonfragmentet med flytende parafin.
- La metallformen stå med kolonfragmentet i parafin i noen minutter i kjøleområdet. Fjern metallformen fra parafinblokken og inkuber i minst 24 timer ved 4 °C.
- Fjern overflødig parafin fra blokken og sett den inn i en helautomatisk roterende mikrotom.
MERK: Parafinblokken kan oppbevares ved -20 °C i noen minutter før dette trinnet. - Skjær kolonfragmentet i 5 μm seksjoner.
- Overfør kolondelen til et vannbad forvarmet til 40 °C.
- Bruk det merkede glasslysbildet til å fjerne kolondelen fra vannbadet.
MERK: Kolonseksjonene flyter på vannet. Sett den merkede glasssklien i vannet under kolondelen og trekk glasssklien forsiktig ut. - La glasssklien stå i 24 timer ved romtemperatur. For langtidslagring, hold glasssklien ved 4 °C etter 24 timer inkubasjon ved romtemperatur.
4. Immunhistokjemi med immunfluorescensfarging
MERK: Ikke la kolondelen tørke på noe trinn under prosedyren.
- Fjern parafin ved å inkubere glasssklien i xylen i 5 min. Gjenta dette trinnet tre ganger.
- Plasser glasssklien i xylen/100 % etanol (1:1; v/v) i 5 min. Gjenta dette trinnet tre ganger.
- Rehydrer ef-delen av tykktarmen i en rekke avtagende etanolkonsentrasjoner, det vil si 70%, 50%, 30% og 10% etanol i 5 min. Gjenta hvert trinn tre ganger.
- Skyll glasssklien under rennende vann i 5 min.
- Forvarm antigengjenfinningsbufferen (10 mM natriumsitrat; 0,05 % Tween 20, pH 6,0) til 95-98 °C og varm glasssklien i kokende antigengjenfinningsløsning i 10 min.
MERK: Antigengjenfinningstrinnet er valgfritt, men anbefales. Den avdekkende løsningen bør optimaliseres avhengig av antistoffet som brukes i eksperimentet. - Tegn en sirkel rundt kolondelen ved hjelp av en hydrofobe penn.
MERK: Dette trinnet er valgfritt, men anbefales. Den hydrofobe pennen forhindrer avfall av reagenser ved å holde væsken samlet i et lite volum inne merket sirkelen. - Inkuber seksjonen i 3% vannløsning av hydrogenperoksidase i 10 min.
- Vask i vaskeløsning (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0,05% Tween 20) i 5 min.
- Inkuber i blokkeringsløsning (5% normalt geitserum; 50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0,05% Triton X-100) for 1 t ved romtemperatur.
MERK: I blokkeringsløsningen må det normale serumet være fra samme art som det sekundære antistoffet. I etapper der inkubasjon er nødvendig, plasser glasssklien i et fuktighetskammer for å forhindre overdreven fordampning. - Fjern blokkeringsløsningen og tilsett 20-50 μL primær antistoff mot ERα, ERβ eller GPER fortynnet i 1% storfe serum albumin med 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100.
MERK: Anbefalte fortynninger av primære antistoffer er vist i tabell 2.
| Antistoff type | Antistoff mot | Klonalitet | Vertsarter | Arter reaktivitet | Fortynning |
| Primære | ERα (andre er i sin pris) | Polyklonal | Kanin | Menneskelige | 1:100 |
| Mus (mus) | |||||
| Skilpadde | |||||
| Capybara (andre er i Lueligger) | |||||
| ERβ (andre er i sin pris) | Polyklonal | Kanin | Menneskelige | ||
| Monkey | |||||
| Rotte | |||||
| Mus (mus) | |||||
| Sau | |||||
| Gris og gris | |||||
| GPER (andre) | Polyklonal | Kanin | Menneskelige | ||
| Rotte | |||||
| Mus (mus) | |||||
| Sekundær | DyLight 650 (andre kan være på denne siden) | Polyklonal | Geit | Kanin | 1:250 |
Tabell 2: Egenskaper av antistoffer.
- Inkuber med primær antistoff over natten ved 4 °C i mørket.
- Fjern antistoffoppløsningen og vask i vaskeoppløsning (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0,05 % Tween 20) i 5 min. Gjenta dette trinnet tre ganger.
- Tilsett 20-50 μL DyLight 650 sekundært antistoff fortynnet i 1% storfe serum albumin (inneholder 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100). Inkuber med sekundært antistoff konjugert med farge i 1 h ved romtemperatur i mørket.
MERK: Anbefalt fortynning av det sekundære antistoffet er vist i tabell 2. - Fjern antistoffoppløsningen og vask i vaskeoppløsning (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05 % Tween 20) i 5 min. Gjenta dette trinnet tre ganger.
- Tilsett 2% DiOC6 (3) fortynnet i 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl og inkuber i 10 min ved romtemperatur i mørket.
- Fjern oppløsningen og vask i vaskeoppløsning (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05 % Tween 20) i 5 min. Gjenta dette trinnet tre ganger.
- Tilsett noen dråper glyserolbasert væske med DAPI direkte på kolondelen og dekk forsiktig med et deksellysbilde. Inkuber kolonseksjonen i minst 24 timer ved 4 °C.
MERK: Unngå luftbobler når du dekker vevet med dekselet. - Analyser kolonseksjonen under konfokalmikroskop med 20x eller 63x mål og oljenedsenking ved hjelp av dedikert programvare.
MERK: Tabell 3 viser egenskapene til fluorokromene som brukes i denne studien.
| Fluorochome type | Bølgelengde (nm) | Fargestoff | |
| Eksitasjon | Utslipp | ||
| DAPI (ANDRE) | 405 | 460 – 480 | Blå |
| DiOC6 (3) | 485 | 538 – 595 | Grønn |
| DyLight 650 (andre kan være på denne siden) | 654 | 660 – 680 | Rød |
Tabell 3: Egenskaper av fluorokrom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Makroskopiske egenskaper av kolon hos mus med TNBS-indusert Crohns sykdom
Representative bilder av kolon tatt fra kontroll og TNBS-behandlede mus er vist i figur 2. Hos mus med en TNBS-indusert modell av Crohns sykdom reduseres lengden på tykktarmen mens tykktarmens bredde økes.
Figur 2: Representativ kolon hentet fra kontrollmusene (kontroll) og TNBS-behandlede mus (TNBS). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
De evaluerte makroskopiske parametrene er gitt i tabell 1. Administrering av TNBS til mus fører til en økning i den totale kolonmakroskopisk score (Figur 3A)og betennelseslengde (Figur 3B) i forhold til kontrollmusene.
Figur 3: Total makroskopisk skår av tykktarmen (A) og total kolonbetennelseslengde (B) i kontrollmus (kontroll) og TNBS-behandlede mus (TNBS). Ti mus per gruppe. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Enveis ANOVA etterfulgt av Newman-Keuls post-hoc test. Data presenteres som midler ± SEM; ***p < 0,001 TNBS vs. kontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Østrogen reseptor antistoff validering
Validering av spesifisiteten av østrogen reseptor antistoffer som brukes i studien ble utført ved hjelp av MCF-7 celler. MCF-7 celler ble valgt basert på tidligere studier der flere uavhengige forskere fant at østrogen reseptorer er til stede på mRNA og proteinnivåer. Som vist i figur 4, antistoffene som brukes i studien tillater påvisning av både kjernefysiskøstrogen reseptorer, dvs. ERα (Figur 4A) og ERβ (Figure 4CFigur 4B), samt membran-bundet østrogen reseptor, dvs. Kjernefysiske østrogenreseptorer er lokalisert i cytoplasma og kjerner, og signalet fra GPER farging er bare til stede i cytoplasma av MCF-7 celler.
Figur 4: Representative bilder av immunfluorescensfarging av ERα (A), ERβ (B) og GPER (C) i MCF-7-cellene. Detaljert beskrivelse øverst på bildene. Skala barer: 10 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
I tillegg til den positive kontrollen ble det også utført en negativ kontroll, der bare det sekundære antistoffet ble brukt. Figur 5 viser et bilde av MCF-7-celler som bare er farget med sekundært antistoff konjugert med fluorokrom og glyserolbasert væske med DAPI.
Figur 5: Representativt bilde av immunfluorescensfarging av DyLight 650 i MCF-7-cellene. Ytterligere beskrivelse er tilgjengelig over bildet. Skala barer: 20 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Østrogen reseptor lokalisering i TNBS-indusert murine modell av Crohns sykdom
Et sterkt cytoplasmatisk signal av ERα ble funnet i kolonseksjonen hentet fra kontrollmus og mus med TNBS-indusert Crohns sykdom (figur 6A). Det ser imidlertid ut til at bare i tarmen oppnådd fra kontrollmus hadde ERα lokalisert i begeibletcellen cytoplasma. Konfokal mikroskopi viste også cytoplasmatisk lokalisering av ERβ i kolondelen av både kontroll og TNBS-behandlede mus (figur 6B). På samme måte ble cytoplasmatisk lokalisering av GPER dokumentert i kolonseksjonen hentet fra kontrollmus og TNBS-behandlede mus (figur 6C).
Figur 6: Representative bilder av immunfluorescensfarging av ERα (A), ERβ (B) og GPER (C) i kolonseksjonen hentet fra kontrollmus (kontroll) og TNBS-behandlede mus (TNBS). Ytterligere beskrivelse er tilgjengelig over hvert bilde. Skala barer: 50 μm; zoom skala barer: 25 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finnes mange dyremodeller for IBD pathofphysiology undersøkelse, inkludert genetiske, immunologiske eller spontane modeller, samt kjemisk indusert modeller15. Blant de flere typer dyremodeller av kolitt er kjemisk induserte modeller som TNBS-indusert modell beskrevet i denne protokollen relativt billig og lett å få tak i. TNBS-indusert murinemodell av kolitt har flere kliniske symptomer relatert til den patologiske grunnlaget for CD. Dyr med indusert kolitt er preget av inkonsekvent avføringdannelse, blodig diaré og tap av kroppsvekt. Dette betyr imidlertid ikke at denne modellen kan brukes til å studere CD etiopathogenesis utelukkende. TNBS-indusert modell anbefales og brukes for eksempel for potensiell terapeutisk screening. I tilfelle av kjemisk indusert kolitt må noen kritiske punkter fremheves. TNBS må fortynnes i etanol, noe som forstyrrer slimhinnebarrieren og gjør det mulig for TNBS å trenge gjennom tarmveggen og samhandle med proteiner med høy molekylvekt, noe som fører til en cellulær mediert immunrespons2,16,17. Både TNBS-dosen og etanolkonsentrasjonen bør optimaliseres for musebelastningen og vekten. For høy TNBS dose og etanolkonsentrasjon kan forårsake overdreven dødelighet, noe som forhindrer videre analyse. På den annen side kan for lav TNBS-dose og etanolkonsentrasjon forårsake dårlig respons og unødvendig forlenge eksperimentet.
Tarmen hentet fra mus med TNBS-indusert kolitt kan undersøkes ikke bare på makroskopisk nivå, som beskrevet i denne protokollen, men kan også brukes til biokjemisk og molekylær analyse. En nyttig tilnærming for å studere både uttrykk og lokalisering er en immunohistokjemisk teknikk ved bruk av immunofluorescens. Imidlertid må noen kritiske skritt inkluderes i utarbeidelsen og implementeringen av IHC for formalin-faste parafin-innebygde murine kolon seksjoner. Det første pivotale trinnet, det vil si at fremstilling av tykktarmen bestemmer kvaliteten på resultatene. Fikseringstiden, som avhenger av vevtykkelsen må optimaliseres. Et annet avgjørende stadium er dehydrering, som bør utføres forsiktig av flere inkubasjoner i økende konsentrasjoner av etanol. Til slutt er riktig posisjonering av tykktarmen i formen avgjørende for å generere de riktige tverrsnittene. Vevforberedelse er ikke det eneste viktige problemet i immunhistokjemi. Selv om antigenhenting er et valgfritt trinn, ser det ut til å være nødvendig i formalin-faste parafininnebygde seksjoner. Under fiksering med formaldehyd genereres metylenbroer mellom proteiner og proteinkrysskoblingmasker antigennettsteder18. Det er to hovedmetoder, basert på varme- eller enzymatisk-indusert (trypsin, pepsin eller proteinase K) antigen gjenfinning. Varmeindusert antigengjenfinning, utført i natriumsitratbuffer, etylendiaminetalacetatsyre (EDTA) buffer eller Tris-EDTA-buffer, brukes mer fordi den ikke påvirker cellemorfologi. Typen antigenopptak og forholdene bør justeres eksperimentelt. Det bør bemerkes at noen ganger antigen gjenfinningmetoden bestemmes av antistoffet som brukes i forsøkene. Permeabilization er en tilstand avhengig av det undersøkte antigenet, og er spesielt nødvendig for intracellulære proteiner. Det er flere tilnærminger som bruker løsemidler (aceton eller metanol) og harde (Triton X-100 eller NP-40) samt milde (Tween 20 eller saponin) vaskemidler. I den nåværende protokollen ble to vaskemidler, brukt samtidig, det vil si Triton X-100 og Tween 20 avhengig av trinnet. Det bør understrekes at permeabilization må optimaliseres avhengig av antistoffet som brukes. Blokkering av ikke-spesifikke bindingssteder er spesielt viktig under immunohistokjemisk analyse. Blokkeringsløsningene inkluderer normale serum-, storfeserumalbumin eller til og med klare til bruksblokkerende løsninger. Den nåværende protokollen anbefaler bruk av både vanlig serum og storfe serum albumin. Som allerede nevnt i protokollen, bør blokkeringsløsningen inneholde normalt serum fra samme art som det sekundære antistoffet.
Til slutt kan IHC-deteksjon ved immunofluorescens som beskrevet i denne protokollen utvides til farging av andre proteiner i proteinproteininteraksjonsstudier. Når du ser etter samlokalisering av utvalgte proteiner, må visse forhold oppfylles. Fluorokrom bør velges basert på eksitasjon og utslippspektra. Dette trinnet er avgjørende for å eliminere spektrale overlappinger og må utføres på planleggingsstadiet av eksperimentet. I denne protokollen brukes tre fluorokrom, det vil si DyLight 650 sekundært antistoff, DAPI og DiOC6(3). Som vist i tabell 3,dylight 650 brukes for østrogen reseptor deteksjon observeres som en rød farge med 654 nm eksitasjon og utslipp på 660-680 nm. For å flekke cellekjerner og den indre membranen, brukes DyLight 650 sammen med DAPI kjernefysisk markør og DiOC6 (3) membranmarkør. DAPI observeres som et blått fargemed 405 nm eksitasjon og utslipp på 460-480 nm. I sin tur observeres DiOC6(3) som et grønt farger med 485 nm eksitasjon og utslipp ved 538-595 nm. Farging av neste protein bør utføres etter trinn 4.14., som begynner med blokkeringstrinnet (se trinn 4.9.). For to proteiner anbefales det å bruke flekker antistoffer fra forskjellige arter. Denne tilnærmingen gjør det mulig å utelukke binding av det fargede sekundære antistoffet mot det tidligere beisede proteinet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Arbeidet ble publisert takket være økonomisk støtte fra Universitetet i Lodz myndigheter: Vice-Rektor for vitenskapelig forskning, vice-rektor for nasjonalt og internasjonalt samarbeid og dekanved fakultet for biologi og miljøvern. Damian Jacenik ble støttet av tilskudd (2017/24/T/NZ5/00045 og 2015/17/N/NZ5/00336) fra National Science Centre, Polen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| BALB/C mice | University of Lodz | NA | |
| Equipment | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| Cardboard block | NA | NA | |
| Confocal microscope - TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Fully automated rotary microtome - RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Glass slide | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Histological box | Marfour | LN.138747 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Laboratory balance | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X software | Leica Biosystems | NA | |
| Metal mold | Marfour | CP.5105 | |
| Sterile gauze | NA | NA | |
| Sterile scissor | NA | NA | |
| Sterile tweezer | NA | NA | |
| Tissue processor - TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 secondary antibody | Abcam | ab96886 | |
| ERα primary antibody | Abcam | ab75635 | |
| ERβ primary antibody | Abcam | ab3576 | |
| Ethanol | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| Formaldehyde | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER primary antibody | Abcam | ab39742 | |
| Hydrochloric acid | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
| Hydrogen peroxidase | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
| isoflurane (forane) | Baxter | 1001936040 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrie dish | Nest Scientific | 705001 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Physiological saline | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiotic) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| Sodium chloride | Chempur | WE/231-598-3 | |
| Sodium citrate | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |
References
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
- Morris, G. P., et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).
- Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).
- Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis. Cell. 75 (2), 263-274 (1993).
- Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice. Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).
- Harnish, D. C., et al. Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).
- Pierdominici, M., et al. Linking estrogen receptor β expression with inflammatory bowel disease activity. Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).
- Włodarczyk, M., et al. G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study. Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).
- Mohammad, I., et al. Estrogen receptor α contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation. Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).
- Jacenik, D., et al. G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn's disease. Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).
- Prossnitz, E. R., Barton, M. The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease. Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).
- Yaşar, P., Ayaz, G., User, S. D., Güpür, G., Muyan, M. Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling. Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).
- Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. Mouse models for the study of Crohn's disease. Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).
- Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., Stüber, E., Strober, W. Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice. Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).
- Ikeda, M., et al. Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis. Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
