हम माउस शुक्राणु क्षमता के दौरान ग्लाइकोलिसिस और ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन में वास्तविक समय के परिवर्तनों की निगरानी करने के लिए एक बाह्य फ्लक्स एनालाइजर के आवेदन का वर्णन करते हैं।
स्तनधारी शुक्राणु क्षमता के रूप में जाना जाता प्रक्रिया में महिला प्रजनन पथ में निषेचन क्षमता प्राप्त करते हैं। क्षमता से जुड़ी प्रक्रियाओं के लिए ऊर्जा की आवश्यकता होती है। एटीपी पैदा करने वाले स्रोतों के बारे में एक चल रही बहस बनी हुई है जो शुक्राणु प्रगतिशील गतिशीलता, क्षमता, हाइपरएक्टिवेशन और परिवर्णी प्रतिक्रिया को ईंधन देता है। यहां, हम माउस शुक्राणु क्षमता के दौरान ऊर्जा चयापचय में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए एक उपकरण के रूप में एक एक्स्ट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर के आवेदन का वर्णन करते हैं। एच+और ओ2– संवेदनशील फ्लोरोफोरस का उपयोग करना, यह विधि गैर-कैपेसिटेमेंस बनाम कैपेसिटिंग शुक्राणु में वास्तविक समय में ग्लाइकोलिसिस और ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन की निगरानी की अनुमति देती है। विभिन्न ऊर्जा सब्सट्रेट्स और/या फार्माकोलॉजिकल एक्टिवेटर और/या अवरोधकों की उपस्थिति में इस परख का उपयोग शुक्राणु क्षमता के दौरान संकेत झरना और चयापचय के बीच विभिन्न चयापचय रास्तों और चौराहे के योगदान में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं ।
मास स्पेक्ट्रोमेट्री के आवेदन ने मेटाबोलिज्म के अध्ययन में क्रांति ला दी है। लक्षित मेटाबोलिक प्रोफाइलिंग और मेटाबोलोमिक ट्रेसिंग ऊर्जा चयापचय में परिवर्तन की सटीक निगरानी की अनुमति देते हैं। हालांकि, metabolomics प्रदर्शन सफलतापूर्वक व्यापक प्रशिक्षण, अनुभवी कर्मचारियों की आवश्यकता है, और महंगा, अत्यधिक संवेदनशील जन स्पेक्ट्रोमीटर हर प्रयोगशाला के लिए आसानी से उपलब्ध नहीं है । हाल के वर्षों में, सीहॉर्स एक्सएफ96 जैसे एक बाह्य प्रवाह विश्लेषक का उपयोग करना विभिन्न सेलप्रकार1,2,3,4,5में ऊर्जा चयापचय में परिवर्तन को मापने के लिए एक किराए की विधि के रूप में लोकप्रिय हो गया है।
शुक्राणु अत्यधिक विशिष्ट मोती कोशिकाएं हैं; जिसका काम ऊसाइट को पैतृक जीनोम देने का है। स्खलन के बाद पुरुष प्रजनन पथ छोड़ने वाले शुक्राणु अभी भी कार्यात्मक रूप से अपरिपक्व हैं और ओसाइट को निषेचित नहीं कर सकते क्योंकि वे ओसाइट्स के वेशभूषा में प्रवेश करने में असमर्थ हैं। शुक्राणु निषेचन क्षमता प्राप्त करते हैं क्योंकि वे एक परिपक्वता प्रक्रिया में महिला प्रजनन पथ के माध्यम से पारगमन करते हैं जिसे कैपेसिटीेशन6,7के नाम से जाना जाता है । काउडा एपिडिडिमिस से विच्छेदित ताजा स्खलन शुक्राणु या शुक्राणु को सीए2 +,बाइकार्बोनेट (एचसीओ3–) या सेल-परगम्य सीएमपी एनालॉग (जैसे, परिभाषित क्षमता मीडिया में ऊष्मायन द्वारा विट्रो में कैपेसिटेड किया जा सकता है। डिस्ब्यूटिरिल-सीएमपी), एक कोलेस्ट्रॉल स्वीकारकर्ता (उदाहरण के लिए, गोजातीय सीरम एल्बुमिन, बीएसए), और एक ऊर्जा स्रोत (जैसे, ग्लूकोज)। कैपेसिटी के दौरान, शुक्राणु अपने गतिशील पैटर्न को एक असममित फ्लैगेलर बीट में संशोधित करते हैं, जो हाइपरएक्टिवेशन8,9नामक तैराकी मोड का प्रतिनिधित्व करते हैं, और वे कलाबाजी प्रतिक्रिया 7 से गुजरने में सक्षम हो जाते हैं, जहां प्रोटेलिटिक एंजाइम जारी किए जाते हैं जो ओसाइट्स के वेशभूषा को पचाते हैं। इन प्रक्रियाओं में ऊर्जा की आवश्यकता होती है, और दैहिक कोशिकाओं के समान, शुक्राणु ग्लाइकोलिसिस के साथ-साथ माइटोकॉन्ड्रियल टीसीए चक्र और ऑक्सीडेटिव फास्फोरिलाइजेशन (ऑक्सफोस)10के माध्यम से एटीपी और अन्य उच्च ऊर्जा यौगिकउत्पन्न करते हैं। जबकि कई अध्ययनों से पता चलता है कि ग्लाइकोलाइसिस आवश्यक है और शुक्राणु क्षमता11,12,13,14का समर्थन करने के लिए पर्याप्त है, ऑक्सफॉस का योगदान कम स्पष्ट है। अन्य सेल प्रकारों के विपरीत जहां ग्लाइकोलिसिस को टीसीए चक्र के साथ शारीरिक रूप से जोड़ा जाता है, शुक्राणु अत्यधिक विभाजित होते हैं और इन प्रक्रियाओं को अलग-अलग फ्लैगलेवर डिब्बों में बनाए रखने के लिए सोचा जाता है: मिडपीस माइटोकॉन्ड्रियल मशीनरी को केंद्रित करता है, जबकि ग्लाइकोलिसिस के प्रमुख एंजाइम प्रमुख टुकड़े15,16तक सीमित दिखाई देते हैं। इस कंपार्टमेंट के परिणामस्वरूप यह बहस चल रही है कि ग्लाइकोलिसिस द्वारा प्रमुख टुकड़े में उत्पादित पायरुवेट मिडपीस में माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सफोस का समर्थन कर सकता है, और क्या मिडपीस में ऑक्सफोस द्वारा उत्पादित एटीपी प्रमुख टुकड़े17,18,19के जिला भागों में ऊर्जा आवश्यकताओं का समर्थन करने के लिए फ्लैगलम की लंबाई के साथ पर्याप्त तेजी से फैलाना करने में सक्षम होगा। शुक्राणु क्षमता में ऑक्सफॉस के लिए एक भूमिका का भी समर्थन है। न केवल ऑक्सफॉस ग्लाइकोलाइसिस की तुलना में अधिक ऊर्जावान रूप से अनुकूल है, जो ग्लाइकोलाइसिस की तुलना में 16 गुना अधिक एटीपी उत्पन्न करता है, बल्कि मिडपीस वॉल्यूम और माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री सीधे स्तनधारी प्रजातियों में प्रजनन फिटनेस से सहसंबद्ध होती है जो20साथियों के लिए पुरुषों के बीच प्रतिस्पर्धा की अधिक डिग्री प्रदर्शित करती है। इन प्रश्नों को संबोधित करने के लिए शुक्राणु क्षमता के दौरान ग्लाइकोलाइसिस और ऑक्सफॉस के सापेक्ष योगदान की जांच करने के तरीकों की आवश्यकता होती है।
टूमेंटे एट अल ने 24-अच्छी तरह से एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर लागू किया ताकि बारीकी से संबंधित माउस प्रजातियों के ऊर्जा चयापचय की तुलना काफी अलग शुक्राणु प्रदर्शन मापदंडों21के साथ की जा सके। गैर-कैपेसिबल शुक्राणु के बेसल ईएआर और ओसीआर मूल्यों की रिपोर्ट करने के बजाय, यहां, हम वास्तविक समय में माउस शुक्राणु क्षमता के दौरान ऊर्जा चयापचय में परिवर्तन की निगरानी के लिए 96-अच्छी तरह से एक्स्सेल्युलर फ्लक्स एनालाइजर का उपयोग करके उनकी विधि को अनुकूलित करते हैं। हमने एक विधि विकसित की है जो एक साथ शुक्राणु में वास्तविक समय में ग्लाइकोलिस और ऑक्सफॉस की निगरानी करने की अनुमति देती है, जिसमें ऑक्सीजन (ओ2)और प्रोटॉन (एच+)(चित्रा 1A)के प्रवाह को मापकर बारह विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों में फ्लैगेला को मात देता है। ग्लाइकोलाइसिस के दौरान लैक्टेट करने के लिए पाइरुवेट के टूटने और टीसीए-चक्र के माध्यम से सीओ2 के उत्पादन के कारण, गैर-कैपेसिट और कैपेसिट शुक्राणु एक्सट्रूड एच+ परख मीडिया में जो एच + के माध्यम से बाह्य फ्लक्स एनालाइजर द्वारा पता लगाया जाता है+संवेदनशील फ्लोरोफोरस एक सेंसर कारतूस की जांच टिप के लिए स्थिर । समानांतर में, ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन द्वारा ओ2 खपत का पता ओ2-संवेदनशीलफ्लोरोफोरस के माध्यम से एक ही जांच टिप(चित्रा 1B)के लिए स्थिर किया जाता है। जारी एच+ का प्रभावी पता लगाने और सेवन किया गया ओ2 को बाइकार्बोनेट या फिनॉल लाल के बिना कम बफरिंग क्षमता के साथ संशोधित शुक्राणु बफर की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, बाइकार्बोनेट की अनुपस्थिति में क्षमता को प्रेरित करने के लिए, हमने व्यापक सीमा वाले पेडे अवरोधक आईबीएमएक्स22के साथ इंजेक्शन वाले सेल-पारगम्य कैपएम्प एनालॉग के उपयोग को अपनाया। तीन अतिरिक्त स्वतंत्र इंजेक्शन बंदरगाह औषधीय सक्रियकों और/या अवरोधकों के इंजेक्शन की अनुमति देते हैं, जो प्रायोगिक हेरफेर के कारण सेलुलर श्वसन और ग्लाइकोलाइसिस दर में परिवर्तन का वास्तविक समय का पता लगाने की सुविधा प्रदान करता है ।
कुछ मेटाबोलिक सब्सट्रेट्स या महत्वपूर्ण मेटाबोलिक एंजाइमों की अनुपस्थिति में शुक्राणु क्षमता की हानि ने सफल निषेचन का समर्थन करने वाले एक प्रमुख कारक के रूप में ऊर्जा चयापचय का पता चला। सेल एक्टिवे?…
The authors have nothing to disclose.
लेखक रॉकफेलर हाई थ्रूपुट और स्पेक्ट्रोस्कोपी रिसोर्स सेंटर में डॉ लावोइसियर रामोस-एस्पिरिटु से समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं ।
Reagents | |||
2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375 | 2-DG |
3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots |
Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A1470 | BSA |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut) | Sigma-Aldrich | L7381 | ConA |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
Hepes | Sigma-Aldrich | H0887 | |
Isothesia | Henry Schein Animal Health | 1169567761 | Isoflurane |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | MgSO4 |
N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | db-cAMP |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | KCl |
Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | P5655 | KH2PO4 |
Rotenone | Cayman Chemical Company | 13995 | Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3- |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | NaCl |
Equipment and materials | |||
12 channel pipette 10-100 μL | eppendorf | ES-12-100 | |
12 channel pipette 50-300 μL | vwr | 613-5257 | |
37 °C, non-CO2 incubator | vwr | 1545 | |
5 mL cetrifuge tubes | eppendorf | 30119380 | |
50 mL conical centrifuge tubes | vwr | 76211-286 | |
Centrifuge with plate adapter | Thermo Scientific | IEC FL40R | |
Dissection kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
Inverted phase contrast microscope with 40X objective | Nikon | ||
OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided | Thomas Scientific | 1159X93 | |
OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided | Thomas Scientific | 1159X95 | |
Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges. |