Summary
In dit artikel beschrijven we, in detail, een protocol voor het genereren van neurosfeerculturen uit postnatale muisneurale stamcellen afkomstig van de belangrijkste muisneurogene niches. Neurosferen worden gebruikt om neurale stamcellen te identificeren uit hersenweefsel waardoor de schatting van voorloper celnummers. Bovendien kunnen deze 3D-structuren worden verguld met differentiërende omstandigheden, waardoor neuronen, oligodendrocyten en astrocyten ontstaan, waardoor het cellot kan worden bestudeerd.
Abstract
De neurosfeer test is een zeer nuttig in vitro techniek voor het bestuderen van de inherente eigenschappen van neurale stam / voorloper cellen (NSSPCs) met inbegrip van proliferatie, zelf-vernieuwing en multipotentie. In het postnatale en volwassen brein zijn NSPC's voornamelijk aanwezig in twee neurogene nissen: de subventriculaire zone (SVZ) langs de laterale ventrikels en de subgranulaire zone van de hippocampaldentate gyrus (DG). De isolatie van de neurogene niches van postnatale hersenen maakt het verkrijgen van een hogere hoeveelheid NSSPCs in de cultuur met een daaruit voortvloeiend voordeel van hogere opbrengsten. Het nauwe contact tussen cellen binnen elke neurosfeer creëert een micro-omgeving die kan lijken op neurogene niches. Hier beschrijven we in detail hoe we SVZ- en DG-afgeleide neurosfeerculturen kunnen genereren van 1-3-dagenoude (P1−3) muizen, evenals passaging, voor neurosfeeruitbreiding. Dit is een voordelige benadering omdat de neurosfeertest een snelle generatie NSPC-klonen (6−12 dagen) mogelijk maakt en bijdraagt aan een aanzienlijke vermindering van het aantal dierlijke toepassingen. Door neurosferen in differentiërende omstandigheden te platen, kunnen we een pseudomonolayer verkrijgen van cellen bestaande uit NSPC's en gedifferentieerde cellen van verschillende neurale geslachten (neuronen, astrocyten en oligodendrocyten) waardoor de acties van intrinsieke of extrinsieke factoren op NSPC-proliferatie, differentiatie, celoverleving en neuritogenese kunnen worden bestudeerd.
Introduction
De neurosfeer test (NSA) werd eerst beschreven in 19921,2 en nog steeds een uniek en krachtig instrument in neurale stamcel (NSC) onderzoek. De isolatie van NSC's uit de belangrijkste neurogene regio's heeft uitdagende problemen omdat de vereisten om deze cellen in fysiologische omstandigheden te behouden slecht begrepen blijven. In de NSA worden cellen gekweekt in een chemisch gedefinieerd serumvrij medium met de aanwezigheid van groeifactoren, waaronder de epidermale groeifactor (EFG) en de basisgroeifactor voor fibroblasten (bFGF)1,2,3. Neurale voorlopercellen (stamcellen en voorlopers) worden geselecteerd met behulp van deze mitogenen, omdat deze cellen EFG en FGF-responsief zijn die een periode van actieve proliferatie binnenkomen, terwijl andere cellen, namelijk gedifferentieerde cellen, sterven4. Neurale voorlopercellen groeien als neurosferen, die vervolgens kunnen worden doorgestoid om de pool van deze cellen verder uit te breiden5. Belangrijk is dat, aangezien deze neurale stam voorloper cellen (NSSPCs) zijn multipotent ze in staat zijn om te differentiëren in de drie belangrijkste celtypes van het centrale zenuwstelsel (CNS): neuronen, oligodendrocyten en astrocyten5.
De NSA biedt een hernieuwbare bron van ongedifferentieerde CNS-precursoren, die kunnen worden gebruikt om verschillende processen te bestuderen, waaronder NSC-proliferatie en zelfvernieuwing, en neuronale en gliadifferentiatie, zowel in fysiologische als in ziektecontext. Bovendien kunnen in vitro studies worden gebruikt om de mate van intrinsieke specificatie die aanwezig is in neurale precursoren tijdens de ontwikkeling te evalueren, evenals om het volledige potentieel van de cellen te bestuderen, door het verwijderen van extrinsieke signalen in verband met hun normale omgeving6. Het neurosfeermodel is waardevol om putatieve regelgevers te evalueren, aangezien door het handhaven van de cellen in een medium zonder serum, de milieusignalen alleen worden geleverd door de omringende cellen6. Bovendien zijn nssspc's in de NSA gemakkelijk uit te breiden in cultuur, is de dichtheid van cellen per gebied hoog en heeft de heterogene samenstelling van de neurosferen enige gelijkenis met in vivo niches6. Deze gevestigde voordelen zijn de reden waarom deze methodologie is op grote schaal gebruikt door veel onderzoekers.
Het volgende protocol beschrijft in detail alle processen van de isolatie van de postnatale NSPC-populatie uit de twee belangrijkste neurogene regio's, de subventriculaire zone (SVZ) en de hippocampaldentategyrus (DG), tot de uitbreiding van die cellen als neurosferen, evenals tot de differentiatie in neuronen, astrocyten en oligodendrocyten. Ten slotte worden ook verschillende tests beschreven om toegang te krijgen tot stamness en multipotentie-eigenschappen van SVZ- en DG-afgeleide NSSPCs.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de Europese Gemeenschap (86/609/EEG; 2010/63/EU; 2012/707/EU) en Portugese wetgeving (DL 113/2013) voor de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt. Het protocol werd goedgekeurd door de "iMM's institutionele Animal Welfare Body - ORBEA-iMM en de nationale bevoegde autoriteit - DGAV (Direcção Geral de Alimentação e Veterinária)."
1. Basisopstelling en voorbereiding van cultuurmedium
- Bereid op de dag van dissectie de juiste hoeveelheid groeimedium voor dat overeenkomt met serumvrij medium (SFM) bestaande uit dulbecco's gemodificeerde adelaarsmedium [(DMEM)/F12 met L-glutamine] (Materiaaltafel)aangevuld met 100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine (pen/strep), 1% B27, met ook 10 ng/mL EGF en 5 ng/mL bFGF. Verwarm het kweekmedium tot 37 °C in een waterbad.
OPMERKING: Het volume van het groeimedium is afhankelijk van het aantal pups, voor 5 pups bereiden ~ 100 mL (50 mL voor SVZ en 50 mL voor DG); echter, na het tellen van het aantal cellen (stap 5.1) het exacte volume zal moeten worden aangepast. - Voor microdissectie van SVZ en DG, bereid de calcium en magnesium-vrije Hanks 'gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) dissectie medium aangevuld met 100 U/mL pen / strep.
LET OP: Bereid 50−100 mL dissectiemedium voor. - Zet een dissectiemicroscoop op en bereid de gereedschappen voor die nodig zijn om de hersenen (schaar en kleine spatel) en voor SVZ- en DG-microdissecties (Dumont kleine schaar, #7 tangen, #5 tangen, #5S tangen) voor te bereiden door 70% ethanol in te nemen.
2. Oogsten van postnatale (P1−3) muizenhersenen en SVZ/DG-microdissecties
- Bereid 60 mm petrischaaltjes (groeigebied 21 cm2)met HBSS aangevuld met pen/strep en 2 monsterbuizen (één voor SVZ en één voor DG) met elk 500 μL aangevulde HBSS.
- Euthanasermuizenpups (P1−3) volgens het protocol dat is goedgekeurd door de institutional animal care faciliteit/richtlijnen. Voer onthoofding uit met een enkele incisie met een scherpe schaar aan de basis van de hersenstam.
- Houd het ventrale deel van het lichaam aan de basis van het hoofd en met behulp van kleine puntige schaar, maak een middellijn incisie in de huid over de gehele lengte van het hoofd, waardoor het oppervlak van de schedel.
- Maak een longitudinale incisie aan de basis van de schedel en blijven snijden langs de sagittale hechting met behulp van kleine schaar met een hoek ondiep mogelijk om te voorkomen dat beschadiging van de hersenstructuren.
- Schil de schedel aan de zijkanten met behulp van gebogen tangen en bloot de hersenen.
LET OP: Zorg ervoor dat de ontleden de instrumenten vrij zijn van ethanol voordat u de hersenen aanraakt. - Isoleer de hersenen van de schedel met behulp van een kleine spatel, door te glijden onder de basis van de hersenen om de schedelzenuwen en bloedvaten die zijn aangesloten op de basis van de hersenen te snijden, en de overdracht van de hersenen in een petrischaal met koude aangevuld HBSS-oplossing.
- Plaats de petrischaal met de hersenen onder een ontledenmicroscoop bij lage vergroting en plaats de hersenen op het rugoppervlak.
- Met behulp van fijne tangen, verwijder de hersenvliezen van de ventrale kant van de hersenen en de reukbollen, terwijl de hersenen in positie door het cerebellum. Draai de hersenen op het ventrale aspect en pel de rest van de hersenvliezen af.
LET OP: Het verwijderen van de rugvliezen is een cruciale stap om te zorgen voor een correcte hersensnijden. - Gooi het cerebellum het maken van een snede met behulp van tangen. Plaats een filterpapier met een poriegrootte van 11 μm op een weefselhakselaar(Tabel van materialen)en zet de hersenen op het filterpapier met gebogen puntige tangen. Hak de hersenen in 450 μm coronale secties en gebruik een natte lamina om de gessectioneerde hersenen te verzamelen in een nieuwe petrischaal gevuld met koude aangevuld HBSS.
- Om de SVZ te ontleden, gebruik je tangen om coronale plakjes op een voorste-naar-achterste manier te scheiden totdat je plakjes bereikt met de laterale ventrikels, onder een ontledende microscoop.
- Snijd de dunne laag weefsel rond de laterale wand van de ventrikels (die overeenkomt met de SVZ) met fijne tangen, met uitzondering van de striatale parenchyma en het corpus callosum. Isoleer de SVZ door de punt van de tang in de laterale hoeken van de laterale ventrikel te plaatsen: een direct onder het corpus callosum en de andere in het weefsel dat direct grenst aan het ventrale gebied van de laterale ventrikel. Snijd vervolgens een kleine lijn weefsel rond de laterale ventrikel.
- Verzamel het ontleedweefsel in een monsterbuis met een aangevulde HBSS-oplossing die eerder als SVZ is geïdentificeerd.
OPMERKING: Sluit de SVZ uit in plakjes waar zowel de laterale ventrikels als de hippocampalvorming beginnen te verschijnen. - Ga door alle plakjes na SVZ microdissectie in een voorste-tot-achterste manier en bereiken de hippocampal formatie. Met behulp van tangen gooi het eerste deel met hippocampus waar DG nog onherkenbaar is.
- Om het DG te verwijderen, isoleert u eerst de hippocampus van de plakjes. Herfocus de microscoop om de grenzen rond DG te visualiseren.
- Ontleed het DG-gedeelte door een snede uit te voeren tussen het DG en de CA1-regio, gevolgd door een verticale snede tussen het DG en de CA3-regio met behulp van tangen. Verwijder fimbria en elk aangrenzend weefsel.
OPMERKING: Bij P1−3 dieren is het DG bijna niet te onderscheiden van de hoorn van Ammon, maar geeft het een kleine tip. - Verzamel het ontleede weefsel in een monsterbuis met aangevulde HBSS-oplossingen die eerder als DG waren geïdentificeerd.
OPMERKING: Algehele schade aan de hippocampus of omgeving zal het moeilijker maken om het DG te isoleren. Het gebruik van een atlas van het postnatale muisbrein is essentieel wanneer de gebruiker niet vertrouwd is met de isolatie van het SVZ- en DG-weefsel van coronale secties.
3. Weefseldissociatie
- Om het SVZ- en DG-weefsel in hun respectievelijke buizen te scheiden, voegt u trypsine-EDTA 0,05% toe om een eindconcentratie van 5−10% trypsin-EDTA 0,05% in HBSS te hebben. Incubeer gedurende ongeveer 15 minuten bij 37 °C, totdat het weefsel samen wordt geklonterd.
- Was het weefsel van de trypsine door het verwijderen van de media en het toevoegen van 1 mL van nieuwe HBSS aangevuld oplossing voor 4 opeenvolgende keren.
- Verwijder de HBSS en stoof het verteerde weefsel opnieuw op in 1 mL SFM aangevuld met 10 ng/mL EGF en 5 ng/mL bFGF. Los de pellet mechanisch van elkaar door de pellet voorzichtig op en neer te ponsen met behulp van een P1000 pipet, totdat u een homogene celoplossing krijgt.
LET OP: Overmatige mechanische dissociatie kan leiden tot een verhoogde celdood en zal een negatieve invloed hebben op de daaropvolgende celgroei.
4. Cel-pair test om cel lot te bestuderen
- Voorafgaand aan het experiment, bereid gecoate 24-put platen voor aanhangende monolayer culturen volgens secties 8-10.
- Als u het aantal SVZ- of DG-cellen (verkregen in punt 3) wilt tellen dat moet worden verguld, gebruikt u een oplossing die 0,2% Trypanblauw bevat en telt u de cellen met behulp van een hematocytometer.
- Verdun de gescheiden celvering in SFM aangevuld met 5 ng/mL EGF en 2,5 ng/mL bFGF (laag EFG/bFGF) met een dichtheid van 11.300 cellen/cm2 en maak ze af op gecoate glaskappen.
- Na 24 uur, bevestig de cellen voor immunocytochemie tegen NSC markers zoals geslacht bepalenregio Y-box 2 (Sox2) en nestin e.a. evenals met een marker van de neuronale afstamming (namelijk doublecortine [DCX], voor onrijpe neuronen) (zie sectie 14).
OPMERKING: Sox2 is een marker van NSC's die mitose ondergaan. Sox2+/+ celparen als gevolg van een enkele celdeling van de voorloper weerspiegelt stamceluitzetting7.
5. Uitbreiding van postnatale neurale stamcellen als neurosferen
- Als u de dichtheid van de gescheiden SVZ- of DG-celsuspensie (verkregen in punt 3) wilt bepalen, u de cellen tellen met behulp van een hematocytometer.
- Verduning svz en DG eencellige suspensie met een dichtheid van 2 x 104 cellen/mL in SFM aangevuld met 10 ng/mL EGF en 5 ng/mL bFGF. Zaad SVZ en DG cellen in ongecoate 60 mm petrischaalmet een eindvolume van 5 mL/petrischaal.
- Incubeer svz- en DG-cellen gedurende respectievelijk 6−8 dagen en 10−12 dagen om primaire neurosferen te vormen, bij 37 °C met 5% CO2.
OPMERKING: Incubatiedagen meer dan de genoemde kan bevorderen aggregatie van neurosferen en hogere niveaus van celdood in het centrum van de neurosfeer. - Wanneer de meerderheid van de neurosferen een diameter van 150−200 μm hebben, voert u de neurosfeerpassage uit.
OPMERKING: Voorbijgaande neurosferen wanneer ze niet over een geschikte diameter compromissen alle volgende stappen.
6. Het doorgeven van neurosferen
OPMERKING: Het volgende protocol kan worden toegepast om zowel SVZ als DG neurosferen uit te breiden.
- Om neurosferen door te geven, verzamel je de SFM met groeifactoren die neurosferen uit de 60 mm petrischaal(es) bevatten en centrifugeer gedurende 5 min bij 300 x g.
- Gooi de supernatant weg en storing de neurosfeerpellet opnieuw met behulp van een chemische dissociatiekit (muis) volgens de instructies van de fabrikant (Tabel van materialen).
LET OP: Let op de incubatietijden precies zoals ze cruciaal zijn voor de prestaties. - Centrifugeer gedurende 5 min bij 300 x g,verwijder de supernatant en voeg 1 mL SFM toe aangevuld met 10 ng/mL EGF en 5 ng/mL bFGF.
- Triturate op en neer ongeveer 10x met een P1000 pipet om neurosferen te scheiden.
- Tel het aantal cellen met behulp van een oplossing die 0,2% Trypan blauw en een hematocytometer.
- Herzaadcellen met een dichtheid van 2 x 104 cellen/mL in ongecoate petrischaaltjes van 60 mm.
- Incubeer svz- en DG-cellen gedurende respectievelijk 6−8 dagen en 10−12 dagen om secundaire neurosferen te verkrijgen, bij 37 °C met 5% CO2.
OPMERKING: De zelfvernieuwingscapaciteit van SVZ- en DG-afgeleide NSSPCs is toegankelijk via protocolsecties 5 en 6. Voor dat, zaad SVZ en DG cellen met een dichtheid van 1,0 x 104 cellen/mL (in ongecoate 24-well platen) in groei SFM medium met 5 ng/mL EGF en 2,5 ng/mL bFGF (lage EGF/bFGF). Tel het aantal resulterende primaire en secundaire neurosferen.
7. Opslag van neurosferen
- Verzamel het medium met neurosferen (verkregen uit stap 5.3 en 6.7) uit de 60 mm petrischaaltjes.
- Centrifugeer 5 min op 300 x g en gooi de supernatant weg.
- Was de cellen 2x met 1 mL HBSS (5 min bij 300 x g).
- Centrifugeer gedurende 5 min bij 300 x g,gooi de supernatant weg en bewaar de pellet van neurosferen op -20 °C voor moleculaire biologieanalyse.
8. PDL-coatingplaatprocedure
- Om oplossing 1 (0,1 M borate buffer) voor te bereiden, weeg 3,92 g boorzuur en verdun in 400 mL water met een hoge zuiverheid. Stel de pH aan tot 8,2 en maak tot 500 mL met water met een hoge zuiverheid.
- Voor het bereiden van oplossing 2 (0,167 M borate buffer), wegen 10,3 g boorzuur en verdunnen in 900 mL van hoge zuiverheid water. Stel de pH aan op 8,2 en maak tot 1000 mL met water met een hoge zuiverheid.
- Voor het reconstrueren van poli-D-lysine (PDL) (1 mg/mL in 0.1 M borate buffer), verdun 100 mg PDL in 100 mL van oplossing 1.
- Maak aliquots van 10 mL om onmiddellijk te gebruiken of in te vriezen en op te slaan bij -20 °C.
- Voeg onder de laminaire stroom 1 coverslip per put toe en steriliseer onder UV-licht gedurende 15 min.
- Gebruik de gereconstitueerde PDL of ontdooi bevroren gereconstitueerde PDL.
- Bereid de uiteindelijke oplossing van 100 μg/mL PDL voor in 0,167 M boratebuffer door 10 mL gereconstitueerde PDL toe te voegen aan 90 mL oplossing 2.
- Voeg de uiteindelijke oplossing toe aan putten voor minimaal 2 uur tot 's nachts bij 37 °C.
OPMERKING: Voor 24-well platen, voeg een volume van 500 μL in elke put. - Verwijder de oplossing en was 3x met water met een hoge zuiverheid.
- Laat de hoezen drogen in de laminaire stroomkap.
- Laat de multi-well cultuurplaten op 4 °C.
9. PDL/Laminin coatingplaatprocedure
- Op dag 1, bekleed de platen met PDL zoals beschreven in sectie 8.
- Verwijder op dag 2 de PDL-oplossing en was 3x met water met een hoge zuiverheid. Laat drogen.
- Bereid 5 μg/mL laminine voor in koude SFM zonder groeifactoren.
- Voeg opgeloste laminine toe aan de coverslips en incubeer 's nachts bij 37 °C.
OPMERKING: Voor 24-well platen, voeg een volume van 500 μL in elke put. - Verwijder lamine met behulp van een pipet.
LET OP: Was de hoesjes niet van laminine. - Gebruik onmiddellijk of bewaar op -20 °C.
10. Poly-L-ornithine (PLO) /laminecoatingprocedure
- Voeg onder de laminaire stroom één coverslip per put toe en steriliseer onder UV-licht gedurende 15 min.
- Voeg 0,01% PLO-oplossing toe aan elke put gedurende 20 min bij kamertemperatuur (RT).
OPMERKING: Voor 24-well platen, voeg een volume van 500 μL in elke put. - Verwijder de oplossing en was 3x met gesteriliseerd 1x PBS. Laat drogen.
- Bereid 5 μg/mL laminine in steriele 1x PBS.
- Incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C.
- Verwijder laminine.
LET OP: Was de hoesjes niet van laminine. - Gebruik onmiddellijk.
LET OP: Zorg ervoor dat de afdekkingsslip volledig door de PLO-oplossing wordt afgedekt door voorzichtig op de afdekkingsslip te tikken met een pipetpunt. Wanneer geschud, moeten de multi-well platen geen geluid maken.
11. Evaluatie van neuritogenese door het genereren van een gedifferentieerde monolayer van de cel
- Verzamel media met neurosferen van 60 mm petrischaaltjes (verkregen uit sectie 5) en centrifugeer gedurende 5 min bij 300 x g bij RT.
- Gooi de supernatant weg en dissocieert de pellet van neurosferen in 1 mL van dissociatie PBS (d.w.z. PBS zonder Mg2+/Ca2+ en met EDTA [2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4 en 0,5 mM EDTA 4Na, bij pH = 7,40]) door 15 min uit te broeden, gevolgd door mechanische dissociatie. U ook neurosferen scheiden met behulp van een chemische dissociatiekit (muis) (Tabel van materialen).
- Centrifugeer 5 min bij 300 x g bij RT en gooi de supernatant weg.
- Resuspend de cel pellet in 1 mL van SFM verstoken van groeifactoren.
- Bepaal de celdichtheid met behulp van een hematocytometer.
- Verdun de gescheiden celsuspensie in SFM zonder groeifactoren met een dichtheid van 3.766 cellen/cm2 en plaatcellen op gecoate glaskapjes in 24-putplaten.
- Bevestig na 1−3 dagen cellen voor immunocytochemie tegen een eiwit van het cytoskelet (zie sectie 14).
12. Differentiatie van neurosfeerculturen
OPMERKING: Neurosferen verkregen uit celuitzetting, hetzij uit primaire of passaged neurosferen (verkregen in secties 5 of 6) kunnen worden onderscheiden in cellen uit verschillende neurale geslachten.
- Wanneer neurosferen een diameter hebben van 150−200 μm, verzamel dan 25 μL neurosfeersveringmedium en plaat op gecoate glazen afdekkingen, in 24-putplaten.
OPMERKING: Om meer neurosferen te verzamelen, draai je de petrischaal voorzichtig om de neurosferen in het midden te concentreren. Dan, pipet van het centrum. - Leg de platen gedurende 15 min in een couveuse op 37 °C, zodat neurosferen zich aan het substraat hechten. Voeg daarna 500 μL SFM zonder groeifactoren toe (differentiërende omstandigheden).
- Na 24 uur, vervang het medium met verse SFM verstoken van groeifactoren.
- Differentiëren voor verschillende tijdpunten (bijvoorbeeld 2 en 7 dagen in vitro, DIV2 en DIV7) met respectievelijk 5% CO2 en 95% atmosferische lucht bij 37 °C.
OPMERKING: Celoverleving, proliferatie en differentiatie kunnen worden geanalyseerd met behulp van verschillende celtesten.
13. Celbiologie-testen
- Cel overlevingstest
- Bloot plaatneurosferen aan 3 μg/mL propidium jodide (PI) gedurende 30 min vóór celfixatie in de couveuse bij 37 °C.
OPMERKING: PI is een autofluorescerend middel dat alleen cellen met gecompromitteerde membraanintegriteit8kan binnendringen. Andere methoden om de overleving van cellen te analyseren kunnen worden gebruikt, zoals caspase 3-kleuring of de terminale deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling (TUNEL) test.
- Bloot plaatneurosferen aan 3 μg/mL propidium jodide (PI) gedurende 30 min vóór celfixatie in de couveuse bij 37 °C.
- Cel proliferatie test
- Bloot vergulde neurosferen aan 10 μM 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) gedurende 4 uur voor fixatie in de couveuse bij 37 °C.
OPMERKING: BrdU is een synthetisch thymidine analoog dat kan worden opgenomen tijdens de DNA-synthese in vermenigvuldigende cellen9.
- Bloot vergulde neurosferen aan 10 μM 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) gedurende 4 uur voor fixatie in de couveuse bij 37 °C.
- Celdifferentiatietest
- Stel 7-dagen oude vergulde neurosferen bloot aan 10 μM BrdU in de eerste 24 uur, in de couveuse bij 37 °C.
- Vernieuw de SFM zonder groeifactoren (onderscheidende omstandigheden) en laat cellen zich ontwikkelen bij afwezigheid van BrdU gedurende de volgende 6 dagen tot fixatie.
OPMERKING: Deze pulse-chase experimenten, door co-etikettering met markers van volwassen neurale cellen, maken de evaluatie van voorlopercellen die zich onderscheiden in volwassen cellen tijdens het protocol.
14. Immunostaining van neurosfeerculturen
- Celfixatie
- Bereid 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS en bewaar bij 4 °C of -20 °C.
- Verwijder de SFM verstoken van groeifactoren uit putten en voeg, aan elke put, 500 μL van 4% PFA bij 4 °C voor 20 min bij RT.
- Was 3x met 1x PBS, gedurende 5 min elke keer, de coverslips met gedifferentieerde neurosferen.
- Bewaar de lippen tot het gebruik in 500 μL van 1x PBS bij 4 °C.
OPMERKING: Als het experiment geen BrdU heeft, gaat u naar stap 14.3.
- Denaturatiemethode (alleen voor BrdU-experimenten)
- Bereid 1 M HCl voor op 37 °C.
- Rinse coverslips 3x in 1x PBS.
- Permeabilize cellen gedurende 30 min in PBS met 1% niet-ionische oppervlakteactieve stoffen (bijvoorbeeld Triton X-100).
- Denature dsDNA met 1 M HCl voorverwarmd tot 37 °C voor 30−40 min bij 37 °C (~300 μL/well).
- Was putten 4x met 1x PBS.
- Permeabilisatie en blokkering
- Spoel de lip in 1x PBS gedurende 5 min.
- Incubatie voor 1,5 uur met 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve stof en 3% runderserumalbumine (BSA) in 1x PBS (~300 μL/well).
OPMERKING: Gebruik voor NeuN 6% BSA in 1x PBS.
- Incubatie en montage
- Op dag 1, zonder te wassen, incubeercellen met primaire antilichamen (Tabel van materialen) in 0,1% niet-ionische oppervlakteactieve stof en 0,3% BSA in 1x PBS in de incubatiekamer (voor 24-put platen gebruik 20 μL/well). Laat de lippen 's nachts uitbroeden bij 4 °C licht beschermd als antilichamen worden geconjugeerd tot een fluoropfore.
- Op dag 2, terug coverslips naar hun respectievelijke putten en spoel 3x in 1x PBS voor 5 min.
- Tegenvlek met passende fluorescentie geconjugeerde secundaire antilichamen (verdunning 1:200) en met 12 μg/mL Hoechst 33342 in 1x PBS voor 2 uur bij RT en licht beschermd in de incubatiekamer (20 μL/coverslip).
- Wash coverslips 3x in 1x PBS voor 5 min.
- Mount dekt lippen op microscoopdia's met behulp van 5 μL/coverslip van fluorescentiemontagemedium.
- Laat de lippen bij RT drogen, beschermd tegen licht, gedurende 1 dag.
- Microscopie
- Bekijk en verwerf afbeeldingen met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
- Gebruik voor elke voorwaarde drie replica's. Voer celtellingen uit in vijf onafhankelijke microscopische velden in elke coverslip met een doelstelling van 40x (~ 100 cellen per veld).
15. Voorbereiding van efg- en bFGF-voorraadoplossingen
- EGF-voorraadoplossing
- Om lyofiegehalte EGF te reconstrueren, verdunt u het product in water met een hoge zuiverheid tot een eindconcentratie van 20 μg/mL.
- Aliquot en bewaar in microtubes bij -5 tot -20 °C.
- bFGF-voorraadoplossing
LET OP: bFGF moet worden gereconstitueerd met een oplossing van 10 mM Tris, pH 7.6.- Centrifugeer de flacon kort voor het openen om de inhoud naar de bodem te brengen.
- Bereid 50 mL van 10 mM Tris, pH 7.6. Weeg daarvoor 60,57 mg Tris ((HOCH2)3CNH2)en verdun het in 40 mL water met een hoge zuiverheid. Stel de pH aan op 7,6 en maak tot 50 mL met water met een hoge zuiverheid.
- Bereid 10 mL van 0,1% BSA voor in 10 mM Tris, pH 7,6. Weeg daarvoor 10 mg BSA en verdun het in 10 mL van 10 mM Tris.
- Filteroplossingen bereid in stappen 15.2.2 en 15.2.3 met een 0,22 μm filter onder een laminaire stroomkap.
- Reconstrueren 10 μg bFGF in 1.000 μL van 0,1% BSA in 10 mM Tris met pH 7,6 om een eindconcentratie van 10 μg/mL te bereiken. Aliquot in microtubes bij -20 °C voor een maximum van 6 maanden.
Representative Results
SVZ en DG neurosferen, verkregen met behulp van de NSA, zijn samengesteld uit ongedifferentieerde cellen, positief voor Sox2, een transcriptiefactor die betrokken is bij de zelfvernieuwingscapaciteit en positief voor nestine, een tussenliggend filamenteiwit uitgedrukt in NSMc's (figuur 1A). Bovendien hebben svz-afgeleide neurosferen grotere afmetingen dan hun DG-tegenhangers (figuur 1A). Belangrijk is dat in differentiërende omstandigheden SVZ- en DG-afgeleide NSSPCs migreren uit neurosferen die een pseudomonolayer van cellen vormen (figuur 1B).
Om toegang te krijgen tot de zelfvernieuwingscapaciteit, wordt de test van het celpaar uitgevoerd op basis van de expressie van Sox2 en nestindie meestal verdwijnen in delende cellen die het differentiatieproces starten met een combinatie van een marker van de neuronale afstamming namelijk DCX. In beide neurogene gebieden is het mogelijk om de aanwezigheid van Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/- symmetrische divisies (zelfvernieuwing) (Figuur 2A1,B1), Sox2-/+/nestin-/+/DCX+/- asymmetrische divisies (figuur 2A1,B2) en Sox2-/-/nestin-/-/DCX+/+ symmetrische divisies (differentiatie)(figuur 2A2,B1).
Het passeren van de neurosferen verhoogt de opbrengst van NSPC's; echter, celdood bij DIV2 verandert met passaging. In feite wordt het percentage PI-positieve cellen verhoogd met celpassage in SVZ (P0: 15,6% ± 1,2% vs P1: 19,2% ± 2,7% vs P2: 32,35% ± 0,14% vs P3: 39,6% ± 4,0%) en in DG (P0: 16,31% ± 0,95% vs P1: 32,1% ± 1,7% vs P2: 27,42% vs P3: 32,2% ± 3,1%) (figuur 3).
Neuritogenese kan worden geëvalueerd in neuronen verkregen uit de differentiatie van SVZ en DG NSSpCs aan het begin van differentiatie: DIV1 (Figuur 4A, D), DIV2 ( Figuur4B, E) en DIV3 ( Figuur4C, F). In feite, zoals waargenomen in figuur 4,de lengte en vertakking van de neurites toeneemt met differentiatie.
Celproliferatie kan worden geëvalueerd in svz- en dg-afgeleide neurosferen. Door de primaire gedifferentieerde neurosferen bij DIV1 te vergelijken met SVZ (figuur 5A1) en DG (figuur 5A2), is het percentage BrdU-positieve cellen hoger in SVZ dan in DG (SVZ: 6,15% ± 0,64% vs DG: 3,27% ± 0,13%; p < 0,05; n = 4; Figuur 5A3). Bovendien kan celdifferentiatie ook worden benaderd door BrdU-kleuring te combineren met een volwassen maker, zoals neuronale kernen (NeuN) die volwassen neuronen identificeert(figuur 5B1,B2). Figuur 5B3 toont aan dat het percentage zich vermenigvuldigende voorouders dat zich onderscheidt in volwassen neuronen vergelijkbaar is in SVZ en DG (SVZ: 12,04% ± 1,58% vs DG: 13,56% ± 0,48%; p > 0,05; n = 4).
De stamkracht en de multipotentie van SVZ- en DG-afgeleide NSSPCs kunnen worden benaderd met behulp van de NSA door de expressie van verschillende markers op verschillende differentiatiedagen (DIV2 en DIV7) te evalueren. NsC's (nestin- en gliafibrillaire zure eiwitten [GFAP]-dubbelpositieve cellen) zijn namelijk aanwezig in beide neurogene gebieden(figuur 6A,G). Deze cellen zijn in staat om te differentiëren in onrijpe neuronen (DCX-positieve cellen) (Figuur 6B,H), rijpe neuronen (NeuN-positieve cellen) (Figuur 6F, L),oligodendrocyte precursorcellen (neuron-glial antigeen 2 [NG2] en bloedplaatjes-afgeleide groeifactor receptor α [PDGFRα]- positieve cellen) ( Figuur6C,I), rijpe oligodendrocyten (myelinebasiseiwit [MBP]-positieve cellen) (Figuur 6E,K) en astrocyten (GFAP-positieve cellen) (Figuur 6D,J).
Verschillende substraten kunnen worden gebruikt om coverslips te coaten om de pseudomonolayer van cellen te vormen onder differentiërende omstandigheden. Zoals blijkt uit aanvullende figuur 1, migreren DG-cellen meer wanneer de coverslips extra coating hebben met laminine in combinatie met PLO of PDL dan met PDL alleen ( Aanvullend figuur1B−H). In feite vormen DG-cellen een meer confluente pseudomonolayer dan SVZ-cellen waarvoor ALLEEN PDL wordt gebruikt (Aanvullend figuur 1C,E).Supplementary Figure 1C,G
Belangrijk is dat deze resultaten het potentieel van de NSA aantonen om de stam- en multipotentie-eigenschappen van NSC's afkomstig van de twee belangrijkste neurogene niches te evalueren.
Figuur 1: Subventriculaire zone en dentate gyrus afgeleid NSPC gekweekt als neurosferen of als pseudomonolayers. (A) Representative brightfield (A1,A3) en fluorescentie (A2,A4) beelden van SVZ- en DG-afgeleide neurosferen, waar kernen werden gekleurd met Hoechst 33342 (blauw) en NSCs voor Sox2 (groen) en nestin (rood). (B) Representatieve brightfield beelden van pseudomonolagen gegenereerd uit SVZ- en DG-afgeleide neurosferen onder differentiërende omstandigheden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: De test van het celpaar. Representatieve fluorescentiebeelden van celparen afkomstig van een celdeling van de voorloper. SVZ en DG kernen werden gekleurd met Hoechst 33342 (blauw), stamcellen-achtige cellen voor Sox2 (rood) en nestin (wit) en onrijpe neuronen met DCX (groen). Pijlpunten in de deelvensters A1 en B1 geven Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/- symmetrische zelfvernieuwende divisies, pijlen in panelen A1 en B2 aan op Sox2+/- /-/nestin+/-/DCX-/+ asymmetrische divisies, stippellijnpijlen in panelen A2 en B1 tonen Sox2-/-/nestin-/-/DCX+/+ symmetrische differentiëringdivisies. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Celoverlevingsanalyse met celveroudering. Kwantitatieve analyse van PI-positieve cellen bij DIV2 in SVZ- en DG-afgeleide gedifferentieerde neurosfeercultuur, na 0, 1, 2 en 3 passages (P0−P3). Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM, n = 1−8. PI = propidium Jodide. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Neuritogenese analyse bij DIV 1, 2 en 3. Representatieve confocale fluorescentiebeelden van neurites, geïdentificeerd door het βIII-tubulinesignaal, in SVZ- en DG-neuronen bij (A,D) DIV1, (B,E) DIV2 en (C,F) DIV3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Celproliferatietest. Representatieve confocale beelden van BrdU-positieve cellen bij DIV1 in (A1) SVZ en (A2) DG. (A3) Kwantitatieve analyse van BrdU-positieve cellen bij DIV1 in DG- en SVZ-afgeleide gedifferentieerde neurosfeercultuur. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM, n = 4. *p < 0,05 door t-test. Representatieve fluorescentiebeelden van BrdU- en NeuN-positieve cellen bij DIV7 in (B1) SVZ en (B2) DG. Pijlpunten wijzen brdu-/NeuN-positieve cellen aan. (B3) Kwantitatieve analyse van BrdU-/NeuN-positieve cellen bij DIV7 in beide niches. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM, n = 4. BrdU: 5-bromo-2'-deoxyuridine, synthetisch thymidine analoog. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Neurale celtypen aanwezig in SVZ- en DG-afgeleide gedifferentieerde neurosfeercultuur. Representatieve fluorescentiebeelden van SVZ- en DG-afgeleide celtypen na 2 en 7 dagen neurosfeerdifferentiatie (DIV2 en DIV7), waar celkernen werden bevlekt met Hoechst 33342 (blauw) en: (A,G) NSCs voor GFAP (groen) en nestin (rood), (B,H) onrijpe neuronen voor DCX (groen), (C,I) oligodendrocyte precursorcellen voor PDGFRα (groen) en NG2 (rood), (D,J) astrocyten voor GFAP (groen), (E,K) rijpe oligodendrocyten voor MBP (groen), en (F, L) volwassen neuronen voor NeuN (rood). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 1: Het testen van verschillende substraten voor neurosfeertherapie en migratie om een pseudomonolayer te vormen. Representatieve fluorescentiebeelden van (A,E) SVZ-afgeleide pseudomonolayer met poly-D-lysine als substraat; (B,F) DG-afgeleide pseudomonolayer met poly-D-lysine als substraat, (C,G) DG-afgeleide pseudomonolayer met poly-D-lysine met laminine als substraat, en (D,H) DG-afgeleide pseudomonolayer met poly-D-lysine met poly-L-ornithine als substraat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
In vitro systemen van NSC's zorgen voor een beter begrip van de cellulaire en moleculaire mechanismen, die verder kunnen worden gevalideerd in vivo. De NSA is een zeer krachtige methode om fysiologische omstandigheden na te bootsen als gevolg van hun driedimensionale structuur. Bovendien is dit cultuursysteem technisch ook gemakkelijker te kweken10, in vergelijking met andere in vitro systemen zoals het monolayer cultuursysteem. Inderdaad, met de NSA, is het gemakkelijk om de blootgestelde extrinsieke signalen tijdens de celontwikkeling te controleren, hetzij tijdens de expansie- of differentiatiefase, door nauwkeurige en variabele hoeveelheden factoren toe te voegen die van belang zijn voor de media en door neurosferen te kweken met andere celtypen6. Bovendien is het in vergelijking met monolayerculturen in de NSA mogelijk om een hogere celdichtheid te verkrijgen uit een kleine hoeveelheid weefsel of met een klein aantal cellen, waardoor parallelle studies kunnen worden uitgevoerd, waardoor het aantal dieren kan wordenverminderd 1.
De NSA is de meest voorkomende methode om NSC's te isoleren en uit te breiden11,12,13, kan worden gebruikt om het aantal voorlopercellen aanwezig in een bepaald weefselmonster5 en de voorlopercelfrequentie tussen verschillende omstandigheden te schatten. Echter, zowel neurosferen en monolayer culturen geen rekening houden met rust NSCs14. Bovendien heeft de NSA een aantal beperkingen11,12,13 en de resulterende neurosfeerfrequentie is afhankelijk van vele factoren, waaronder de medium componenten, de dissectieprocedure, het dissociatieproces11,12,13, en neurosfeeraggregatie5. Inderdaad, in een cultuur met hoge dichtheid, neurosferen hebben de neiging om samen te voegen. Daarom moet voorzichtigheid worden betracht bij het schatten van het aantal voorlopercellen in een monster. Om bovenstaande beperkingen te overwinnen, kunnen geïsoleerde NSSPCs ook worden uitgebreid en doorgetrokken in een monolayer5,15. Belangrijk is dat het gebruik van NSA om de frequentie van voorlopercellen tussen verschillende omstandigheden te vergelijken zeer nuttig en nauwkeurig is, omdat al deze beperkingen impliciet en vergelijkbaar zijn tussen alle omstandigheden die in hetzelfde experiment worden uitgevoerd.
Er zijn kritische stappen in de neurosfeer cultuur die aandacht nodig hebben. In de hersenen oogsten stap, volledige verwijdering van de hersenvliezen en een goede isolatie van de neurogene niches zijn essentieel om de zuiverheid en opbrengst van NSC's te maximaliseren. Tijdens weefseldissociatie kan als gevolg van de proteolytische activiteit van trypsine overmatig gebruik van trypsine of langere incubatietijden leiden tot cellyse. Bovendien is de dag van de passage van cruciaal belang om een gezonde populatie van neurosferen te verkrijgen. Voorbijgaande neurosferen met een diameter hoger dan 200 μm heeft een grote invloed op de levensvatbaarheid, de proliferatie en de onderscheidende capaciteit van NSPc's. Belangrijk is dat langere cycli van passages, meer dan 10 genetische instabiliteit kunnen verhogen6. Bovendien is coating met RESPECTIEVELIJK PDL en PLD/laminine voor SVZ- en DG-cellen essentieel om een goede celmigratie uit de neurosferen te garanderen zonder het differentiatieproces in gevaar te brengen. In termen van de immunocytochemie analyse, langere incubatietijden met PFA kan ingevaar brengen kleuring door het maskeren van de antigenen en het verhogen van de achtergrond.
De NSA is een krachtig instrument voor het verstrekken van een consistente en een onbeperkte bron van NSSP's voor in vitro studies van neurale ontwikkeling en differentiatie, alsmede voor therapeutische doeleinden16,17. Deze test kan immers worden toegepast op genetische en gedragsmodellen om de moleculaire en cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij de proliferatie van DEPC en differentiatie18,19verder te begrijpen. Deze test is ook nuttig om verschillende geneesmiddelen en verbindingen te testen20,21,22 evenals om genetische manipulaties uit te voeren19,23 om NSC eigenschappen te moduleren. Naast immunocytochemie, omgekeerde transcriptie polymerase kettingreactie en westerse vlek analyse kan worden uitgevoerd om toegang te krijgen tot RNA en eiwit expressie, terwijl elektrofysiologische studies en calcium beeldvorming kan worden gebruikt om de functie van de pasgeboren neuronen te evalueren21.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door IF/01227/2015 en UID/BIM/50005/2019, projeto financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) através de Fundos do Orçamento de Estado. R.S. (SFRH/BD/128280/2017, F.F.R. (IMM/CT/35-2018), D.M.L. (PD/BD/141784/2018) en R.S.R. (SFRH/BD/129710/2017) kregen een beurs van FCT. De auteurs willen de leden van de bioimaging faciliteit van het Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes bedanken voor microscopie assistentie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
| 0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| 12mm Glass coverslips | VWR | 631-1577 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
| 5-bromo-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | B9285-1G | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
| 70% Ethanol | Manuel Vieira & Cª (Irmão) Sucrs, Lda | UN1170 | |
| Adhesion slides, Menzel Gläser, SuperFrost Plus | VWR | 631-9483 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken IgG (H+L) | Life Technologies | A11039 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A21206 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (H+L) | Life Technologies | A21208 | |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A10037 | |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A10042 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A21235 | |
| Anti-5-Bromo-2-Deoxyuridine | Dako | M0744 | |
| Anti-CD140a (PDGFRα) (rat) | BD Biosciences | 558774 | Dilute at a ratio 1:500. |
| Anti-Chondroitin Sulphate Proteoglycan NG2 (rabbit) | Merck Milipore | AB5320 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Doublecortin (rabbit) | Abcam | ab18723 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Doublecortin (chicken) | Synaptic Systems | 326006 | Dilute at a ratio 1:500. |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (rabbit) | Sigma-Aldrich | G9269-.2ML | Dilute at a ratio 1:1000. |
| Anti-Myelin Basic Protein (rabbit) | Cell Signalling Technology | 78896S | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Nestin (mouse) | Merck Milipore | MAB353 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Neuronal Nuclei (mouse) | Merck Milipore | MAB377 | Use 6% BSA in PBS 1X. Dilute at a ratio 1:400. |
| Anti-SOX2 (rabbit) | Abcam | ab97959 | Dilute at a ratio 1:500. |
| Anti-Tubulin β3 (rabbit) | BioLegend | 802001 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Axiovert 200 wide field microscope | ZEISS | ||
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher | 17504044 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-500g | |
| Bovine Serum Albumin | NZYTech | MB04602 | |
| Cell counting chamber, Neubauer | Hirschmann | 8100104 | |
| Cell culture CO2 incubator | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Corning Costar TC-Treated 24 Multiple Well Plate | Corning | CLS3524-100EA | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31331028 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | FST | 11254-20 | |
| Dumont #5S Forceps | FST | 11252-00 | |
| Dumont #7 Forceps | FST | 11272-30 | |
| Epidermal growth factor | ThermoFisher | 53003018 | |
| Fibroblast growth factor | ThermoFisher | 13256029 | |
| Filter papers | Whatman | 1001-055 | |
| Fine Scissors - Sharp | FST | 14060-09 | |
| Gillete Platinum 5 blades | Gillette | ||
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14175053 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 1399 | |
| Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 (1L) | |
| Labculture Class II Biological Safety Cabinet | ESCO | 2012-65727 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| McILWAIN Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 450 μm |
| Micro Spatula - 12 cm | FST | 10091-12 | |
| Micro tube 0.5 mL | SARSTEDT | 72.699 | |
| Micro tube 1.5 mL | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| Micro tube 2.0 mL | SARSTEDT | 72.691 | |
| NeuroCult Chemical Dissociation Kit (Mouse) | Stem Cell | 5707 | |
| Olympus microscope SZ51 | Olympus | SZ51 | |
| Paraformaldehyde, powder | VWR | 28794.295 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Petri dishes 60 mm | Corning | 430166 | |
| Phosphate standard solutions, PO43 - in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
| Poly-D-Lysine 100mg | Sigma-Aldrich | P7886 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | |
| Sodium chloride | VWR | 27800.360.5K | |
| Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
| Triton X-100 | BDH | 14630 | |
| VWR INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 |
References
- Reynolds, B., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), e2393 (2010).
- Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11 (5), 951-966 (1993).
- Rietze, R. L., Reynolds, B. A. Neural Stem Cell Isolation and Characterization. Methods in Enzymology. 419, 3-23 (2006).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice. Journal of Visualized Experiments. (84), e51225 (2014).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and Limitations of the Neurosphere Culture System. Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-162 (2006).
- Xapelli, S., et al. Activation of Type 1 Cannabinoid Receptor (CB1R) Promotes Neurogenesis in Murine Subventricular Zone Cell Cultures. PLoS ONE. 8 (5), e63529 (2013).
- Riccardi, C., Nicoletti, I. Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. Nature Protocols. 1 (3), 1458-1461 (2006).
- Nowakowski, R. S., Lewin, S. B., Miller, M. W. Bromodeoxyuridine immunohistochemical determination of the lengths of the cell cycle and the DNA-synthetic phase for an anatomically defined population. Journal of Neurocytology. 18 (3), 311-318 (1989).
- Weinberg, D., Adams, C. F., Chari, D. M. Deploying clinical grade magnetic nanoparticles with magnetic fields to magnetolabel neural stem cells in adherent versus suspension cultures. RSC Advances. 5 (54), 43353-43360 (2015).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. Journal of Visualized Experiments. (47), e2457 (2011).
- Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells. Journal of Visualized Experiments. (49), e2639 (2011).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres-re-evaluating the relationship. Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).
- Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (15), 6387-6392 (2009).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities? Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
- Ghate, P. S., Sidhar, H., Carlson, G. A., Giri, R. K. Development of a novel cellular model of Alzheimer's disease utilizing neurosphere cultures derived from B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J embryonic mouse brain. SpringerPlus. 3 (1), 161 (2014).
- Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).
- Ogawa, Y., Kaizu, K., Yanagi, Y., Takada, S., Sakuraba, H., Oishi, K. Abnormal differentiation of Sandhoff disease model mouse-derived multipotent stem cells toward a neural lineage. PLoS ONE. 12 (6), e0178978 (2017).
- Khacho, M., et al. Mitochondrial Dynamics Impacts Stem Cell Identity and Fate Decisions by Regulating a Nuclear Transcriptional Program. Cell Stem Cell. 19 (2), 232-247 (2016).
- Soares, R., et al. Tauroursodeoxycholic Acid Enhances Mitochondrial Biogenesis, Neural Stem Cell Pool, and Early Neurogenesis in Adult Rats. Molecular Neurobiology. 55 (5), 3725-3738 (2017).
- Rodrigues, R. S., Ribeiro, F. F., Ferreira, F., Vaz, S. H., Sebastião, A. M., Xapelli, S. Interaction between Cannabinoid Type 1 and Type 2 Receptors in the Modulation of Subventricular Zone and Dentate Gyrus Neurogenesis. Frontiers in Pharmacology. 8, 516 (2017).
- Xapelli, S., et al. Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin? Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59 (2014).
- Kim, H. J., et al. Dynamin-related protein 1 controls the migration and neuronal differentiation of subventricular zone-derived neural progenitor cells. Scientific Reports. 5 (1), 15962 (2015).
