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Biochemistry

PRESTO-टैंगो परख का उपयोग कर एक GPCR-वाइड पैमाने पर लिगांड स्क्रीनिंग के लिए 2 भर्ती के समानांतर पूछताछ

Published: March 10, 2020 doi: 10.3791/60823
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 2Brain and Mind Research Institute, University of Ottawa

Summary

यह देखते हुए कि जीपीसीआरएस आकर्षक नशीले लक्ष्य हैं, जीपीसीआर लिगामेंट स्क्रीनिंग इस प्रकार सीसा यौगिकों की पहचान और अअनाथअध्ययन के लिए अपरिहार्य है । इन प्रयासों की दिशा में, हम PRESTO-टैंगो का वर्णन करते हैं, जो एक ओपन-सोर्स संसाधन मंच है जो TEV आधारित रिपोर्टर परख का उपयोग करके लगभग 300 जीपीसीआर में क्षणिक-arrestin2 भर्ती की एक साथ प्रोफाइलिंग के लिए उपयोग किया जाता है।

Abstract

सेलुलर सिग्नलिंग रास्तों के सरगम के सबसे बड़े और सबसे बहुमुखी जीन सुपरफैमिली और मध्यस्थों के रूप में, जी-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआरएस) दवा उद्योग के लिए सबसे आशाजनक लक्ष्यों में से एक का प्रतिनिधित्व करते हैं। एर्गो, जीपीसीआर लिगामेंट स्क्रीनिंग परखों का डिजाइन, कार्यान्वयन और अनुकूलन महत्वपूर्ण है, क्योंकि वे दवा की खोज के लिए रिमोट-कंट्रोल टूल का प्रतिनिधित्व करते हैं और जीपीसीआर फार्माकोलॉजी और परिणामों में हेरफेर के लिए। अतीत में, जी-प्रोटीन पर निर्भर परख अनुसंधान के इस क्षेत्र को टाइप करता है, लिगामेंट-प्रेरित घटनाओं का पता लगाता है और माध्यमिक दूतों की पीढ़ी की मात्रा निर्धारित करता है। हालांकि, कार्यात्मक चयनात्मकता के आगमन के बाद से, साथ ही कई अन्य जी प्रोटीन-स्वतंत्र रास्तों और जी-प्रोटीन पर निर्भर परखों से जुड़ी सीमाओं के बारे में बढ़ी हुई जागरूकता, वैकल्पिक के निर्माण की दिशा में अधिक धक्का है जीपीसीआर लिगामेंट स्क्रीनिंग परख ती है। इस प्रयास की दिशा में, हम ऐसे ही एक संसाधन के आवेदन का वर्णन करते हैं, प्रेस्टो-टैंगो प्लेटफॉर्म, एक ल्यूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर-आधारित प्रणाली जो मानव जीपीसीआर-ओम के समानांतर और एक साथ पूछताछ को सक्षम बनाती है, एक उपलब्धि जो पहले माना जाता था तकनीकी और आर्थिक रूप से अव्यवहार्य । जी-प्रोटीन स्वतंत्र के आधार पर 2 भर्ती परख, जीपीसीआरएस में 2-मध्यस्थता तस्करी और सिग्नलिंग में 2-गिरफ्तारी की सार्वभौमिकता प्रेस्टो-टैंगो को लगभग 300 गैर-घ्राण मानव GPCRs का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त उपकरण बनाती है, जिसमें लगभग 100 शामिल हैं अनाथ रिसेप्टर्स। PRESTO-टैंगो की संवेदनशीलता और मजबूती यह यौगिक पुस्तकालयों का उपयोग कर प्राथमिक उच्च थ्रूपुट स्क्रीन के लिए उपयुक्त बनाते हैं, ज्ञात दवाओं के लिए नए GPCR लक्ष्यों को उजागर करने के लिए या अनाथ रिसेप्टर्स के लिए नए ligands की खोज करने के लिए कार्यरत हैं ।

Introduction

जी-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआरएस) ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन के सबसे बड़े और सबसे विविध परिवार का गठन करते हैं, जो कोशिका और उसके पर्यावरण1के बीच संचार इंटरफेस के रूप में काम करते हैं। जीपीसीआरएस की बहुमुखी प्रतिभा को लिगांड की एक विविध सरणी का पता लगाने की उनकी क्षमता से प्रकाश डाला जाता है- न्यूरोट्रांसमीटर से न्यूक्लियोटाइड्स तक, पेप्टाइड्स से फोटॉन, और कई औरअधिक - साथ ही सेलुलर विकास, प्रवास, भेदभाव, एपोप्टोसिस, सेल फायरिंग आदि में शामिल कई डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग कैस्केड को विनियमित करने की उनकीक्षमता। उनकी सर्वव्यापकता और शारीरिक प्रक्रियाओं की एक भीड़ में शामिल होने को ध्यान में रखते हुए, इस रिसेप्टर परिवार अत्यंत चिकित्सीय महत्व का है, इस तथ्य से प्रदर्शित किया गया है कि वर्तमान में उपलब्ध दवाओं के एक तिहाई से अधिक GPCRs4लक्ष्य । हालांकि, ये मौजूदा चिकित्सा विज्ञान केवल सुपरफैमिली (अनुमानित 10%) के एक छोटे सबसेट को लक्षित करते हैं, और कई जीपीसीआरएस की फार्माकोलॉजी असंबंधित बनी हुई है। इसके अलावा, 100 से अधिक जीपीसीआरएस अनाथ रिसेप्टर्स के रूप में मौजूद हैं, क्योंकि उनका मिलान एक एंडोजेनस लिगांड5से नहीं किया गया है। इस प्रकार, जीपीसीआर लिगामेंट स्क्रीनिंग अनाथीकरण और दवा विकास में महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह लीड खोज और अनुकूलन की दिशा में मार्ग प्रशस्त करता है, और संभवतः नैदानिक परीक्षण चरण के लिए।

जीपीसीआर लिगामेंट स्क्रीनिंग के लिए तरीके पारंपरिक रूप से दो श्रेणियों में से एक में गिर गए हैं, जी-प्रोटीन निर्भर या जी-प्रोटीन स्वतंत्र कार्यात्मक परख6। जीपीसीआर सिग्नलिंग को विषमतात्मक जी-प्रोटीन (Gαο) द्वारा विनियमित किया जाता है, जो जीएलपी के लिए जीटीपी के आदान-प्रदान से सक्रिय होते हैं जो Gα उपइकान7पर बाध्य होते हैं। सक्रिय रिसेप्टर से संकेतों को सीएमपी, कैल्शियम, डेग और आईपी 3 जैसे माध्यमिक दूतों के माध्यम से जी-प्रोटीन द्वारा स्थानांतरित किया जाता है, जो डाउनस्ट्रीमप्रभावकों 8पर डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग में मध्यस्थता करने के लिए होता है। जी प्रोटीन सिग्नलिंग के कार्यात्मक परिणामों की प्रकृति का दोहन सेल आधारित परख बनाने के लिए किया गया है जो रिसेप्टर सक्रियण को प्रतिबिंबित करते हैं । ये तरीके, जो जी-प्रोटीन सिग्नलिंग में समीपस्थ (प्रत्यक्ष) या डिस्टल (अप्रत्यक्ष) घटनाओं को मापते हैं, का उपयोग अक्सर जीपीसीआर लिगलैंड स्क्रीनिंग के लिए किया जाता है और मुख्य रूप से डीलमोथेशन स्टडीज6में नियोजित किया गया है। परख ों के उदाहरण जो सीधे जीपीसीआर-मध्यस्थता जी-प्रोटीन सक्रियण को मापते हैं, उनमें [35S] GTPοS बाध्यकारी परख शामिल है, जो Gα उपइकाई के लिए एक रेडियोलेबल और गैर हाइड्रोलाइजेबल जीटीपी एनालॉग के बाध्यकारी उपाय, और Förster/bioluminescence अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET/BRET, क्रमशः) जांच GPCR-Gα और Gα/Gο बातचीत है, जोपिछले कुछवर्षों में अधिक कर्षण प्राप्त कर रहा है की निगरानी के लिए 9,10। Asकहते हैं कि जिला घटनाओं की निगरानी जीपीसीआर प्रोफाइलिंग के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले उपकरण हैं; उदाहरण के लिए, सीएएमपी और IP1/3 परख जी-प्रोटीन निर्भर माध्यमिक दूतों के इंट्रासेलर संचय को मापते हैं, जबकि [सीए2 + ]प्रवाह और रिपोर्टर परखों में जी-प्रोटीन सक्रियण (सीआरई, NFAT-RE, एसआरई, एसआरएफ-आरई) में फंसाए गए विशिष्ट प्रतिक्रिया तत्वशामिल हैं, जो सिग्नलिंग कैस्केड11को और डाउनस्ट्रीम करते हैं । जबकि उपरोक्त अधिकांश परखों को उच्च-थ्रूपुट स्तर पर किया जा सकता है, काफी संवेदनशील हैं, और कुछ परख-विशिष्ट लाभों का दावा करते हैं (उदाहरण के लिए, GTPοS बाध्यकारी, या लाइव कोशिकाओं पर परख कार्यक्षमता जैसे [सीए2 +] और IP1/3)6के मामले में पूर्ण/आंशिक agonists, तटस्थ विरोधी और विलोम agonists के बीच भेदभाव, दुर्भाग्य से कोई मौजूदा जी-प्रोटीन निर्भर तरीके हैं जो पूरे दवाजी जीपीसीआर-ओम की पूछताछ के लिए उपयुक्त हैं। यह काफी हद तक जीपीसीआरएस के लिए कई जी प्रोटीन उपपरिवारों के देशी युग्मन के कारण है, जिसके परिणामस्वरूप कई झरने और अनाथ GPCRs पर अज्ञात जी प्रोटीन युग्मन पर संकेत है । इस मुद्दे को कम करने के लिए, परखों को एक आम सिग्नलिंग रीड-आउट के माध्यम से संकीर्ण जी-प्रोटीन युग्मन को मजबूर करने के लिए विकसित किया गया है, जैसे सीएएमपी, और सीए2 +,हालांकि उनमें से अधिकांश कम थ्रूपुट12हैं।

जीपीसीआर जीवनचक्र का एक महत्वपूर्ण पहलू जी-प्रोटीन-निर्भर सिग्नलिंग की समाप्ति है, जो बड़े हिस्से में जी-प्रोटीन के विसोशन को प्रेरित करने वाले गिरफ्तारकरने के माध्यम से होता है, और अंततः रिसेप्टर को हतोत्साहित करता है, जिसे क्लैथरिन-लेपित आंतरिककरण13के लिए लक्षित किया जाता है। 1 में गिरफ्तार किए गए अदृश्य और गिरफ्तार 2 में क्रमश: गिरफ्तारी-2 और गिरफ्तार-3 के रूप में भी दर्शाया गयाहै। जी-प्रोटीन स्वतंत्र सेल आधारित परख दर्ज करें, जो जीपीसीआर लिगामेंट स्क्रीनिंग में एक नया आयाम जोड़ते हैं; रिसेप्टर तस्करी, लेबल मुक्त पूरे सेल, और भर्ती परख में गिरफ्तार सभी उल्लेखनीय उदाहरण हैं । जीपीसीआर ट्रैफिकिंग परखों में फ्लोरोफोर-लेबल वाले लिगांडया को रिसेप्टर15को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है, जबकि लेबल-फ्री साबुत सेल परखबायोसेंसर का उपयोग करते हैं जो लिगांड बाइंडिंग द्वारा प्रेरित सेलुलर परिवर्तनों को मात्रात्मक आउटपुट में अनुवाद करते हैं, जैसे इलेक्ट्रिकल या ऑप्टिकल सिग्नल16। विशेष रूप से, सर्वोत्कृष्ट GPCR--बातचीत में गिरफ्तार कार्यात्मक परख17के प्रदर्शनों की सूची में एक आकर्षक उपकरण के रूप में भर्ती परख में गिरफ्तार फैशन । टैंगो प्रणाली, पहले बार्नेया एट अल द्वारा विकसित केवल एक दशक पहले, तीन एक्सोजेनस आनुवंशिक तत्वों की शुरूआत शामिल है: एक प्रोटीन फ्यूजन जिसमें तंबाकू नक़्क़ाशी वायरस प्रोटीज़ (TEVp), एक टेट्रासाइक्लिन ट्रांसएक्टिवेट (टीटीए) के साथ 2 को शामिल किया गया है जो तंबाकू नक़्क़ाशी वायरस प्रो के माध्यम से जीपीसीआर के लिए सीमित है tease दरार साइट (TEVcs) और सी से पहले है V2 vasopressin रिसेप्टर (V2 पूंछ) के टर्मिनस से एक अनुक्रम के लिए भर्ती में गिरफ्तारी को बढ़ावा देने के लिए, और एक रिपोर्टर लूसिफेरेज़ जीन जिसका प्रतिलेखन द्वारा शुरू हो रहा है टीटीए ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर न्यूक्लियस में ट्रांसलोकेशन, जो 2 भर्ती में 2 -arrestining(चित्रा 1)18के बाद झिल्ली प्रस्तोता से मुक्त है । जीपीसीआर एक्टिवेशन और 2 भर्ती में गिरफ्तार करने की मात्रात्मक रीडिंग बाद में ल्यूमिनेसेंस के लिए पढ़कर निर्धारित की जा सकती है। एक उल्लेखनीय अंतर यह है कि जबकि रिसेप्टर तस्करी और लेबल मुक्त पूरे सेल विधियां अपेक्षाकृत कम थ्रूपुट हैं, टैंगो के कई फायदे हैं, जिनमें चयनात्मक रीड-आउट शामिल हैं जो सिग्नल एकीकरण के कारण लक्ष्य रिसेप्टर और संवेदनशीलता के लिए विशिष्ट है, जो इसे बड़े पैमाने पर लिगामेंट स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त उम्मीदवार बनाते हैं18।

इन रणनीतिक विशेषताओं को ध्यान में रखते हुए, क्रोज़े एट अल ने प्रेस्टो-टैंगो (ट्रांसक्रिप्शनल आउटपुट-टैंगो के माध्यम से समानांतर रिसेप्टर-ओम एक्सप्रेशन और स्क्रीनिंग) विकसित किया, जो एक उच्च-थ्रूपुट ओपन-सोर्स प्लेटफॉर्म है जो समानांतर और एक साथतरीकेसे ड्रगेबल जीपीसीआर-ओम को प्रोफाइल करने के लिए टैंगो दृष्टिकोण का उपयोग करता है। लगभग सभी GPCRs के लिए 2 की "संकीर्ण" भर्ती का शोषण, PRESTO-टैंगो सेल आधारित कार्यात्मक परख के मामले में अपनी तरह का पहला है, लगभग सभी गैर घ्राण GPCRs पर छोटे अणु यौगिकों की तेजी से "पहले दौर" स्क्रीनिंग सक्षम करने, अनाथ सहित, जी प्रोटीन उपपरिवार युग्मन से स्वतंत्र ।

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Protocol

1. प्राथमिक स्क्रीनिंग: सेल संस्कृति और प्लेट सीडिंग

  1. पॉली-एल-लाइसिन (PLL) कोटेड प्लेटें तैयार करने के लिए, इलेक्ट्रॉनिक मल्टीचैनल पिपेट या रिएजेंट डिस्पेंसर का उपयोग करके सफेद या काले ३८४-अच्छी तरह से ऑप्टिकल बॉटम प्लेटों में एलपीएल के 25 μg/mL स्टॉक समाधान के 20 μL/अच्छी तरह से बांटें । 0.5-2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्लेटों इनक्यूबेट।
    नोट: यदि काले 384-अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग कर, पृष्ठभूमि संकेत सफेद प्लेटों की तुलना में कम होने की उम्मीद है. काले प्लेटों को निकटवर्ती कुओं के बीच चमक के माध्यम से खून को कम करने की सिफारिश की जाती है।
  2. कोटेड प्लेटों को संरक्षित करने और अतिरिक्त प्लेटल को धोने के लिए, इसे सिंक पर फ्लिकिंग करके प्लेटल को हटा दें, एक पेपर तौलिया पर सूखी टैप करें, और इलेक्ट्रॉनिक मल्टीचैनल पिपेट या रिएजेंट डिस्पेंसर का उपयोग करके एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक के पतला 1x समाधान के 40 μL/अच्छी तरह से जोड़ें। प्लेट सीडिंग के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट-कोटेड प्लेटस्टोर करें।
  3. एचटीएलए कोशिकाओं को बनाए रखें (कृपया डॉ रिचर्ड एक्सल द्वारा प्रदान की गई) - एक मानव भ्रूणीय गुर्दे की कोशिका रेखा (HEK293T) 2-गिरफ्तार 2-TEV और tTA संचालित ल्यूसिफ़ेरेस को व्यक्त करती है - पूर्ण डल्बेकको के संशोधित ईगल के माध्यम (डीएमईएम) में भ्रूण बोवाइन सीरम के 5% के साथ पूरक है, गोजातीय बछड़ा सीरम का 5%, प्यूरोमाइसिन का 2.5 μg/mL, 50 μg/mL हाइग्रोमाइसिन, 100 यू/एमएल पेनिसिलिन, और 100 μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2युक्त एक आर्द्र इनक्यूबेटर में।
  4. संस्कृति एचटीएलए कोशिकाएं 150 मिमी व्यंजनों में और सप्ताह में दो बार कोशिकाओं को 1:10 के कमजोर पड़ने वाले कारक पर पास करती हैं, जिसमें 5-25 की इष्टतम सेल मार्ग संख्या होती है। सुनिश्चित करें कि प्राथमिक स्क्रीन के पैमाने के आधार पर, 384-अच्छी तरह से प्लेट सीडिंग के दिन पर्याप्त संख्या में 150 मिमी व्यंजन अनुकूल हैं।
    नोट: 25 पारित होने से अधिक एचटीएलए कोशिकाओं के उपयोग के परिणामस्वरूप व्यवहार्यता कम हो सकती है, जिससे उप-इष्टतम परिणाम मिल सकते हैं।
  5. प्राथमिक स्क्रीन के लिए एचटीएलए कोशिकाओं को बीज करने के लिए, धीरे-धीरे 1x फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस), पीएच 7.4 के साथ संधाराबद्ध 150 मिमी पकवान (ईएस) को धीरे से कुल्ला करें। 0.05% ट्रिप्सिन/0.53 मीटर ईटीए के लगभग 6 मिलील के साथ अलग कोशिकाओं, और ट्राइप्सिन को बेअसर करने के लिए पूर्ण Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) की कम से कम बराबर राशि वाले अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. 3 मिन के लिए ५०० x ग्राम पर एचटीएलए कोशिकाओं को स्पिन करें और पूर्ण डीएमईएम में ०.२२ x १०६ कोशिकाओं/mL के घनत्व पर सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें, प्यूरोमाइसिन के २.५ μg/mL और ५० μg/mL के हाइग्रोमाइसिन के अलावा छोड़ दें क्योंकि वे ट्रांसक्शन क्षमता को कम कर सकते हैं ।
  7. कोशिकाओं को बोने से पहले उन्हें गर्म करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आवश्यक 384-अच्छी तरह से पीएलएल-लेपित प्लेटों को इनक्यूबेट करें। सिंक पर प्लेट को फ्लिक करके और सूखने के लिए पेपर तौलिया पर टेप करके 384-वेल पीएल-लेपित प्लेट (एस) से 1x एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक के स्टोरेज सॉल्यूशन को हटा दें।
  8. एक इलेक्ट्रॉनिक मल्टीचैनल पाइप का उपयोग करके ०.२२ x 106 कोशिकाओं/mL HTLA निलंबन के ४५ μL वितरण द्वारा १०,००० कोशिकाओं के अंतिम घनत्व पर ३८४-अच्छी तरह से PLL-लेपित प्लेटों में बीज कोशिकाओं । रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट प्लेटें। यदि एक ही दिन ट्रांसफेक्शन पसंद किया जाता है, तो 16,000 कोशिकाओं/अच्छी तरह के घनत्व पर बीज कोशिकाएं और बाद में ट्रांसफेक्शन 4 एच का प्रदर्शन करें।
    नोट: उच्च ट्रांसफेक्शन दक्षता के लिए, 50-70% सेल प्रवाह इष्टतम है।

2. प्राथमिक स्क्रीनिंग: डीएनए प्लेट तैयार करने और ट्रांसफेक्शन

  1. के रूप में चित्रा 2में दिखाया ट्रांसफेक्शन के लिए ३८४-अच्छी तरह से डीएनए स्रोत प्लेट तैयार करने के लिए, एक अलग GPCR के साथ, एक ९६-अच्छी तरह से थाली में रुचि के GPCR-टैंगो का निर्माण encoding प्लाज्मिड cDNAs वितरित करें । प्लाज्मिड डीएनए को 01x ट्रिस-ईडीटीए (टीई) बफर में 50 एनजी/माइक्रोन की एकाग्रता पर निलंबित किया जाना चाहिए।
    नोट: 96-अच्छी तरह से डीएनए प्लेटों को सील किया जा सकता है और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, और कई स्क्रीनिंग प्रयोगों के लिए फिर से उपयोग किया जा सकता है। सभी सीडीएनए एन्कोडिंग जीपीसीआर-टैंगो निर्माण वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध हैं (सामग्री की तालिकादेखें) और pcDNA3.1 नियोमाइसिन प्लाज्मिड में क्लोन किए जाते हैं। प्रेस्टो-टैंगो जीपीसीआर किट में चार 96-वेल प्लेटें शामिल हैं, जिनमें 80 जीपीसीआर प्रत्येक, नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक खाली वेक्टर के साथ कुओं के एक जोड़े, और सकारात्मक नियंत्रण कुओं जो डोपामाइन रिसेप्टर डी 2 (DRD2) को पकड़ते हैं, और कुओं जो ट्रांसफेक्शन दक्षता को ट्रैक करने के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी) को ट्रैक करने के लिए एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग ले जाते हैं।
  2. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करना, मैन्युअल रूप से डीएनए समाधान को 96-वेल से 384-अच्छी तरह से डीएनए स्रोत प्लेट में स्थानांतरित करें, प्रति 384-अच्छी तरह से 10 माइक्रोन जोड़ते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रयोग की प्रत्येक स्थिति चौगुनी में परख़ है, ९६-अच्छी तरह से डीएनए प्लेट (पंक्तियों ए-डी या ई-एच) का आधा दो क्वाड्रंट्स (पहले चतुर्भुज = - यौगिक, दूसरा चतुर्भुज = + यौगिक) में प्रत्येक जीपीसीआर वितरित करके एक पूर्ण 384-अच्छी प्लेट को कवर करेगा, जैसे कि एक ही जीपीसीआर 384-अच्छी प्लेट के 8 कुओं में ट्रांस्ट्रा हो जाएगा (चित्रा 2 गाइड के रूप में देखें)।
  3. कैल्शियम फॉस्फेट वर्षा विधि के लिए आवश्यक निम्नलिखित ट्रांसफेक्शन पुनरुत्थान अभिकर्ताओं को इकट्ठा करें, जैसा कि जॉर्डन एट अल द्वारा वर्णितहै। 20:0.1x TE बफर (1 mM Tris-HCl और 0.1 m EDTA); 2.5 एम सीएसीएल2 समाधान; 2x हेप्स बफर, पीएच 7.05 (50 एमएम हेप्स, 280 एमएम एनसीएल, 1.5 एमएम एनए2एचपीओ4)। छानने और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर द्वारा सभी समाधानों को स्टरलाइज करें। ट्रांसफेक्शन का दिन, अभिकर्ताओं को उपयोग से पहले कमरे के तापमान तक पहुंचने की अनुमति दें।
  4. 0.313 एम सीएसीएल2 और भंवर की अंतिम एकाग्रता के लिए 0.1 x TE (1:8 कमजोर पड़ने) में 2.5 एम सीएसीएल2 स्टॉक समाधान को पतला करें। 0.313 एम सीएसीएल2 के 40 माइक्रोन को 384-अच्छी तरह से डीएनए स्रोत प्लेट में स्थानांतरित करें और हाथ से आयोजित मल्टीचैनल पिपेट या स्वचालित बेंचटॉप 384-चैनल पाइपेटर के साथ ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिश्रण करें।
  5. 384-अच्छी तरह से डीएनए स्रोत प्लेट में 2x हेप्स बफर के 50 माइक्रोन जोड़ें, ऊपर और नीचे पाइपिंग करके फिर से मिलाएं और 1 मिन के लिए खड़े होने दें; प्रत्येक ३८४-वेल में नौ ३८४-वेल प्लेटों के ट्रांसफेक्शन के लिए डीएनए/ट्रांसफेक्शन मिश्रण की पर्याप्त मात्रा होगी, जो परीक्षण की जरूरत वाले यौगिकों की संख्या पर निर्भर करता है । 384-वेल डीएनए सोर्स प्लेट से डीएनए/ट्रांसफेक्शन मिश्रण के 10 माइक्रोन को वरीयता प्राप्त एचटीएलए कोशिकाओं में स्थानांतरित करें और प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।

3. प्राथमिक स्क्रीनिंग: सेल उत्तेजना

  1. चौबीस घंटे बाद, सिंक पर ३८४-अच्छी तरह से थाली को धीरे से फ्लिक करके और इसे एक पेपर तौलिया पर टेप करके, या एक एस्पिरेटर सिर के साथ ट्रांससंक्रमित सेल मीडिया को डिडेंट करें । धीरे-धीरे भूख से मर रहे मीडिया के 40 माइक्रोन जोड़ें (डीएमईएम 1% डायलिसि भ्रूण गोजातीय सीरम (डीएफबीएस) और 1x एंटीबायोटिक/एंटीमाइकोटिक के साथ पूरक है, कोशिकाओं को सीधे छूने से बचने के लिए सावधान रहना।
  2. एक 3x एकाग्रता पर ब्याज के यौगिक के Pipet 20 μL (सेल प्लेट में दवा की अंतिम एकाग्रता 1x हो जाएगा) (+) उत्तेजना के साथ बारी पंक्तियों में, और (-) यौगिक के बिना बारी पंक्तियों के लिए वाहन बफर के 20 μL । सेल प्लेट को 5% सीओ2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर लौटाएं और कम से कम 16 घंटे के लिए इनक्यूबेट दें।

4. प्राथमिक स्क्रीनिंग: ल्यूमिनेसेंस रीडिंग

  1. ग्लो रिएजेंट तैयार करें, बेकर और बॉयस21से संशोधित: 108 एम ट्राई-एचसीएल; 42 एमएम ट्रिस-बेस, 75 एमएम एनसीएल, 3 एमएम एमजीसीएल2, 5 एमएम डिथिओथ्रेरी-टॉल (डीटीटी), 0.2 एम एम कोएंजाइम ए, 0.14 मिलीग्राम/एमएल डी-लूसिफेरिन, 1.1 एमएम एटीपी, 025% v/v ट्राइटन एक्स-100, 2 एमएम सोडियम हाइड्रोसुफिट।
    नोट: अभिकर्मकों के स्टॉक समाधान पहले से किए जा सकते हैं, सिवाय डी-लूसिफ़ेरिन, जो हमेशा अपने पाउडर रूप में ग्लो रिएजेंट में ताजा रूप से जोड़ा जाता है। अगर ब्लैक प्लेट्स का इस्तेमाल किया गया तो डी-लूसिफेरिन की मात्रा 025 एमजी/एमजी तक बढ़ाई जा सकती है।
  2. उत्तेजना के बाद 16-24 घंटे में, सिंक पर ३८४-अच्छी तरह से प्लेट को धीरे से फ्लिक करके और इसे एक पेपर तौलिया पर टेप करके ट्रांससंक्रमित सेल मीडिया को डिडेंट करें । ग्लो रिएजेंट के 20 μL/well जोड़ें और 5-20 min के लिए कमरे के तापमान पर थाली इनक्यूबेट करें । 1 एस/वेल के एकीकरण समय के साथ माइक्रोप्लेट ल्यूमिनेसेंस काउंटर का उपयोग करप्लेटपढ़ें ।

5. प्राथमिक स्क्रीनिंग: डेटा विश्लेषण

  1. एक स्प्रेडशीट के रूप में ल्यूमिनेसेंस काउंटर से सहेजी गई फाइलों का निर्यात करें; परिणाम सापेक्ष ल्यूमिनेसेंस इकाइयों (आरबीयू) में दर्ज किए जाएंगे। 384-अच्छी तरह से प्लेट के लेआउट के आधार पर, निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके प्रत्येक रिसेप्टर की सक्रियण (गुना परिवर्तन) की गणना करें:
    Equation 1
    नोट: यहां नमूना RLU उत्तेजित (+ यौगिक) चतुर्भुज के चार दोहराने कुओं में से प्रत्येक के मूल्य को संदर्भित करता है, मतलब पृष्ठभूमि RLU थाली पर नकारात्मक नियंत्रण का मतलब है, और मतलब बेसल RLU है कि एक ही रिसेप्टर के अनुपचारित चतुर्भुज के मतलब को संदर्भित करता है (- यौगिक) । इसके अलावा, परिणामों की गुणवत्ता को सत्यापित करने के लिए 4 डेटा बिंदुओं के मानक विचलन की गणना करें। किसी भी विषमता को सुधारने के लिए गुना परिवर्तनों के मतलब पर लॉग2 परिवर्तन करने की सिफारिश की जाती है; सकारात्मक हिट की पहचान करने में मदद करने के लिए लॉग 2 आधार एक व्यावहारिक विकल्प है। अनुभवजन्य रूप से सकारात्मक हिट थ्रेसहोल्ड सेट करें; यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कुछ रिसेप्टर्स के रूप में 2 गुना वृद्धि के रूप में कम हो सकता है और पूर्ण पीड़ावादी के साथ दूसरों के लिए ४० गुना वृद्धि ।
  2. परिणामों के आधार पर, जीपीसीआरएस का चयन करें जो माध्यमिक स्क्रीनिंग के लिए संभावित सकारात्मक हिट हैं।

6. माध्यमिक स्क्रीनिंग: सेल सीडिंग और ट्रांसफेक्शन

  1. 100 मिमी व्यंजनों में उपसंस्कृति एचटीएलए कोशिकाएं पूर्ण मीडिया के 11 मिलील (4.55 x 10 5/मिलील) में 5 x 106 कोशिकाओं के कुल सेल घनत्व पर और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। यदि एक ही दिन ट्रांसफेक्शन पसंद किया जाता है, तो 7.5 x 106 कोशिकाओं के घनत्व पर बीज कोशिकाएं और बाद में ट्रांसफेक्शन 4 एच करते हैं।
  2. कमरे के तापमान पर कैल्शियम फॉस्फेट वर्षा के लिए आवश्यक अभिकर्मकों को पूर्व-गर्म करें। 2.5 एम सीएसीएल2 और जल्दी भंवर के 50 माइक्रोन के साथ 0.1x TE बफर के 450 μL गठबंधन; ये मात्रा एक 100 मिमी पकवान के लिए विशिष्ट हैं, जो विकास माध्यम की मात्रा के आधार पर रखती है।
  3. एक ट्यूब में जीपीसीआर सीडीएनए और भंवर के 10 माइक्रोन में टीई/सीएसीएल2 सॉल्यूशन का ५०० माइक्रोन जोड़ें । ट्यूब में 2x हेप्स बफर समाधान के 500 माइक्रोन जोड़ें, सख्ती से हिलाएं (भंवर न करें), और 1 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे वाईएफपी, एमचेरी, आदि) को एन्कोडिंग करने वाले किसी भी प्लाज्मिड का 1 μg कुल 10 μg के लिए जीपीसीआर सीडीएनए के 9 μg के साथ सह-ट्रांसफेक्ट किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग ट्रांसफेक्शन दक्षता को ट्रैक करने के लिए किया जाता है, और यह न्यूनतम राशि परख में हस्तक्षेप नहीं करेगी।
  4. तत्काल कम ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं पर 1 mL समाधान ड्रॉपवाइज बांटें। धीरे-धीरे प्लेट को आगे-पीछे रॉक करें ताकि समान रूप से वर्षा को वितरित किया जा सके, ध्यान रखा जा सके कि प्लेट को भंवर न करें, और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. अगले दिन, फ्लोरोसेंट सेल इमेजर के तहत फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति को देखकर ट्रांसफेक्शन दक्षता का निरीक्षण करें; 50% से अधिक कवरेज के ट्रांसफेक्शन आदर्श हैं।
  6. कोशिकाओं को बोने से पहले इसे गर्म करने के लिए इनक्यूबेटर में आवश्यक 384-अच्छी तरह से पीएलएल-कोटेड प्लेट (एस) को इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें। सिंक पर प्लेट को फ्लिक करके और सूखने के लिए पेपर तौलिया पर टेप करके 384-वेल पीएल-लेपित प्लेट (एस) से 1x एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक के स्टोरेज सॉल्यूशन को हटा दें।
  7. धीरे से Versene समाधान (1X PBS, पीएच 7.4; 0.53 mM EDTA) के साथ ट्रांससंक्रमित कोशिकाओं को कुल्ला, और डिश के लिए 0.05% ट्रिप्सिन/0.53 मीटर EDTA के 3 mL जोड़कर अलग करें। सामग्री को एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें ट्राइप्सिन को बेअसर करने के लिए कम से कम समान मात्रा में पूर्ण डीएमईएम हो।
  8. 3 मिन के लिए ५०० x ग्राम पर कोशिकाओं को नीचे स्पिन और भूख से मर मीडिया में ०.४ x १०६ कोशिकाओं/mL के घनत्व पर कोशिकाओं को फिर से निलंबित । एक इलेक्ट्रॉनिक मल्टीचैनल पाइप का उपयोग करसेल निलंबन के ४५ μL वितरण द्वारा २५,००० कोशिकाओं के अंतिम घनत्व पर ३८४-अच्छी तरह से PLL-coated प्लेट (ओं) में बीज कोशिकाओं । प्लेटों को न्यूनतम 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर लौटाएं, जिससे कोशिकाओं को उत्तेजना के आगे बढ़ने से पहले कुओं को ठीक से संलग्न करने की अनुमति दी जाती है।

7. माध्यमिक स्क्रीनिंग: 16 सूत्री (आधा लॉग) खुराक वक्र के लिए दवा की थाली तैयार

  1. 96-अच्छी प्लेट में, 1X एचबीएसएस दवा बफर (1x हैंक का संतुलित नमक समाधान [एचबीएसएस], 20 एमएम हेप्स पीएच 7.4, 1x एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक) के 270 माइक्रोन जोड़ें, प्लेट की अंतिम पंक्ति (पंक्ति एच) को छोड़कर, जैसा कि चित्र4में दिखाया गया है।
    नोट: पेप्टाइड्स, कोलाइडल अणुओं, और खराब पानी में घुलनशील यौगिकों के लिए, 0.1-1% बीएसए के अलावा सुझाव दिया जाता है। ड्रग ऑक्सीकरण को रोकने के लिए 0.01% एस्कोकएसिड भी जोड़ा जा सकता है।
  2. दवा स्टॉक से, अंतिम 3x एकाग्रता (सेल प्लेट में दवा की अंतिम एकाग्रता 1x) की गणना करके एक दवा समाधान (जिसे "उच्च" एकाग्रता के रूप में जाना जाता है) तैयार करें। एक उदाहरण के रूप में, अपनी उच्चतम एकाग्रता के रूप में 10 माइक्रोन के साथ एक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र के लिए, 30 माइक्रोन पर "उच्च" एकाग्रता तैयार करें। पंक्ति एच में कुओं में "उच्च" एकाग्रता के पाइप 300 μL।
  3. एक और ट्यूब में, "कम" एकाग्रता तैयार करें, जो 3.16 (आधा लॉग) द्वारा विभाजित "उच्च" एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है। पिछले उदाहरण के आधार पर, "कम" एकाग्रता 9.49 माइक्रोन होगी। "उच्च" कुओं के निकट पंक्ति एच में कुओं में "कम" एकाग्रता के पाइप 300 μL।
    नोट: पंक्ति एच में आवश्यक 96-कुओं की कुल संख्या कोशिकाओं और उत्तेजना की स्थिति की संख्या पर निर्भर करेगी। चार कुओं (दो "उच्च" और दो "कम") पर्याप्त दवा समाधान के लिए एक पूरे ३८४ अच्छी तरह से थाली को प्रोत्साहित किया जाएगा ।
  4. "उच्च" और पंक्ति एच के "कम" कुओं से पिछली पंक्ति (पंक्ति जी) से दवा समाधान के 30 μl पाइपिंग द्वारा एक धारावाहिक कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें और मैन्युअल रूप से ऊपर और नीचे पाइपिंग, या के रूप में सिफारिश की, "पिपेट और मिक्स" समारोह के साथ एक इलेक्ट्रॉनिक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके मिश्रण । कमजोर होने के बीच सुझावों को त्यागते हुए पहली और सबसे पतला पंक्ति (पंक्ति ए) तक इस कदम को दोहराएं।
    नोट: यदि वांछित है, तो धारावाहिक कमजोर होना पंक्ति ए से पहले रोका जा सकता है, जो बिना किसी दवा के आंतरिक नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है, दूसरे शब्दों में, एक "सच्चा शून्य"।
  5. एक संदर्भ के रूप में चित्रा 4 का उपयोग करना, 96-अच्छी तरह से प्लेट से "कम" कॉलम कमजोर के 20 μl को पहले वरीयता प्राप्त 384-अच्छी प्लेट के साथ-ओ, साथ ही बी-पी. के 20 μL को कम से कम 16 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करने के लिए प्रेरित करें।

8. माध्यमिक स्क्रीनिंग: ल्यूमिनेसेंस रीडिंग और डेटा विश्लेषण

  1. उत्तेजना के बाद 16-24 घंटे में, सिंक पर ३८४-अच्छी तरह से प्लेट को धीरे से फ्लिक करके और इसे एक पेपर तौलिया पर टेप करके ट्रांससंक्रमित सेल मीडिया को डिडेंट करें । ग्लो रिएजेंट के 20 μL/well जोड़ें और 5-20 min के लिए कमरे के तापमान पर थाली इनक्यूबेट करें । 1 एस/वेल के एकीकरण समय के साथ माइक्रोप्लेट ल्यूमिनेसेंस काउंटर का उपयोग करप्लेटपढ़ें ।
  2. एक स्प्रेडशीट के रूप में ल्यूमिनेसेंस काउंटर से सहेजी गई फाइलों का निर्यात करें; परिणाम सापेक्ष ल्यूमिनेसेंस इकाइयों (आरबीयू) में दर्ज किए जाएंगे। गैर रैखिक प्रतिगमन वक्र फिट के लिए अपने निर्मित XY विश्लेषण का उपयोग कर परिणामों का विश्लेषण करने के लिए एक सांख्यिकी सॉफ्टवेयर के लिए ३८४-अच्छी तरह से थाली के डेटा हस्तांतरण । बिल्ट-इन 3-पैरामीटर खुराक-प्रतिक्रिया उत्तेजना समारोह "लॉग (एगोनिस्ट) बनाम प्रतिक्रिया (तीन पैरामीटर)" का चयन करें,
    Equation 2
    नोट: यहां ऊपर और नीचे वाई धुरी की इकाइयों में पठार हैं, क्रमशः अधिकतम प्रतिक्रिया और बेसल स्तर, EC50 एगोनिस्ट की एकाग्रता है जो ऊपर और नीचे के बीच 50% प्रतिक्रिया उत्पन्न करती है, और एक्स एगोनिस्ट की लॉग एकाग्रता को संदर्भित करता है। इस मॉडल मानता है कि खुराक प्रतिक्रिया वक्र 1 की एक मानक पहाड़ी ढलान है ।

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Representative Results

यहां प्रस्तुत प्रेस्टो-टैंगो प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, 168 गैर-घ्राण जीपीसीआर लक्ष्यों के खिलाफ एक क्रोमेफिन ग्रेन्यूल (सीजी) अर्क की जांच की गई थी, जिसमें अधिकांश अनाथ रिसेप्टर्स थे। नेकहा कि निकाले गए अर्क की प्रोफाइलिंग बार्नेया एटअल.18 (चित्रा 1)द्वारा डिजाइन किए गए सिद्धांत के आधार पर चुने गए रिसेप्टर्स में 2 जुटाने की जांच करके किया गया था । रुचि के जीपीसीआरएस का प्लाज्मिड सीडीएनए प्रेस्टो-टैंगो जीपीसीआर किट से लिया गया था और वांछित लेआउट में दो 96 अच्छी प्लेटों में इकट्ठा किया गया था। कुल मिलाकर, एचटीएलए कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त चार ३८४-अच्छी तरह से प्लेटें ट्रांससंक्रमित थीं, क्योंकि ९६-अच्छी तरह से डीएनए प्लेटों में से प्रत्येक आधे को पूर्ण ३८४-अच्छी तरह से प्लेट में बनाया गया था, जिसके परिणामस्वरूप प्रत्येक रिसेप्टर दो क्वाड्रंट्स (आठ ३८४-कुओं के कुल) में ट्रांस्ट्रल हो गया था । दो क्वाड्रंट्स में से एक सीजी निकालने के साथ उत्तेजित किया गया था; अलग-अलग, बारी-बारी पंक्तियों सी-डी, जी-एच, के-एल, और ओ-पी (+) उत्तेजना(चित्रा 2)का प्रतिनिधित्व किया। प्राथमिक स्क्रीनिंग में पूछताछ की गई १६८ जीपीसीआरएस में से केवल दो रिसेप्टर्स संभावित सक्रिय लक्ष्यों के रूप में दावेदार थे, विशेष रूप से डोपामाइन रिसेप्टर डी 3 (DRD3) और ऑप्सिन 5 (OPN5) । DRD3 ने 4.70 का एक महत्वपूर्ण लॉग2गुना परिवर्तन का उत्पादन किया, जबकि OPN5 ने 2.39 की थोड़ी कम प्रतिक्रिया का उत्पादन किया, दोनों लॉग2 गुना परिवर्तन और gt;2 की सीमा कट-ऑफ को पूरा करते हैं। इसकी तुलना में, प्राथमिक स्क्रीन के लिए सकारात्मक नियंत्रण DRD2 को क्विंपिरोल के साथ उत्तेजित किया गया था, जो इस रिसेप्टर का एक चयनात्मक एगोनिस्ट था, और 4.58(चित्रा 3)के लॉग2 गुना परिवर्तन का उत्पादन किया। इन सिग्नल खिड़कियों को पुन: पेश करने और झूठी-सकारात्मक हिट की संभावना को खत्म करने के लिए, उपरोक्त रिसेप्टर्स के साथ एक माध्यमिक स्क्रीन आयोजित की गई थी। सीजी निकालने का परीक्षण करने के अलावा, यह देखते हुए कि DRD3 एक गैर-अनाथ रिसेप्टर है, एक और स्थिति एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में तैयार की गई थी, विशेष रूप से क्विंपिरोल के साथ उत्तेजना, इसके चयनात्मक एगोनिस्ट में से एक। दूसरी ओर, OPN5 एक अनाथ रिसेप्टर है और इस तरह के रूप में, कोई संदर्भ एगोनिस्ट एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सीजी निकालने के साथ परीक्षण किया जा सकता है; केवल बफर एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में परीक्षण किया गया था । इन दो जीपीसीआरएस के आगे औषधीय लक्षण वर्णन10-5 एम से लेकर10-12.5 मीटर तक विशेष रूप से, 10 मीटर पर सीजी एक्सट्रैक्ट और क्विंपिरोल स्टॉक समाधान ों को 30 माइक्रोन और 9.49 माइक्रोएम, इसी "उच्च" और "कम" सांद्रता में 96-अच्छी तरह से दवा प्लेट की तैयारी करके किया गया था; ये फॉर्मूलेशन 10-5 एम और 10-5.5 मीटर बन जाएंगे एक बार 20 माइक्रोन को प्रत्येक 384-वेल के भीतर कुल 60 माइक्रोन के लिए भूखे माध्यम के 40 माइक्रोन में ट्रांससंक्रमित कोशिकाओं पर तिरस्कृत किया जाता है। जैसा कि पहले वर्णित है, धारावाहिक कमजोर करने वालों को ऐसा किया गया था कि10-12 मीटर और 10-12.5 एम के लिए सबसे पतला दवा संरचनाएं शीर्ष पंक्ति (पंक्ति ए)(चित्रा 4)में हैं। लिगामेंट शक्ति और प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए ग्राफपैड चश्मे का उपयोग करके माध्यमिक स्क्रीनिंग से खुराक-प्रतिक्रिया घटता बनाया गया था। क्विंपिरोल की तुलना में, सीजी एक्सट्रैक्ट ने इसी तरह के सिग्नल खिड़कियों और EC50 मूल्यों का उत्पादन किया, जो DRD3 में सक्रिय हिट के रूप में इसकी वैधता की पुष्टि करता है। हालांकि, एक फ्लैट खुराक-नकारात्मक नियंत्रण के समान वक्र OPN5 के लिए उत्पादित किया गया था, यह सत्तारूढ़ बाहर CG निकालने के लिए एक संभावित लक्ष्य के रूप में(चित्रा 5)।

Figure 1
चित्रा 1: टैंगो का मॉड्यूलर डिजाइन (ए) और सामान्य योजना के लिए (टैंगो) भर्ती परख (बी) । (A)जीपीसीआर टैंगो निर्माण में निम्नलिखित क्रम में विभिन्न मॉड्यूल तत्व शामिल हैं: एक एचए सिग्नल/फ्लैग टैग, जीपीसीआर सीडीएस, एक वासोप्रेसिन रिसेप्टर 2 सी-टर्मिनल पूंछ, टीईवी प्रोटीज़ क्लीवेज साइट, और एक टीटीए प्रतिलेखन कारक। (ख)टैंगो परख के सिद्धांत में एचटीएलए कोशिकाओं में जीपीसीआर टैंगो प्लाज्मिड ्स को क्षणिक रूप से स्थानांतरित करना शामिल है, HEK293T कोशिकाएं एक "arrestin2-TEV प्रोटीज़ फ्यूजन प्रोटीन और एक लूसिफ़ेराज रिपोर्टर जीन जिसकी अभिव्यक्ति टीटीए द्वारा सक्रिय है। जीपीसीआर की सक्रियता अंततः रिसेप्टर के लिए 2-TEV में गिरफ्तार करने के लिए जुटाने में परिणाम होगा, अपनी दरार साइट के करीब निकटता में प्रोटीज़ लाने । नतीजतन, टीटीए जीपीसीआर पूंछ से क्लीव किया जाता है, जिससे ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर को न्यूक्लियस में स्थानांतरित करने और लूसिफ़ेरास अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए मुक्त किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रेस्टो-टैंगो प्राथमिक स्क्रीनिंग में ट्रांसफेक्शन और उत्तेजना के लिए 96-वेल सीडीएनए प्लेट और 384-वेल सेल प्लेट के लेआउट। ट्रांसफेक्शन के लिए 384-वेल सीडीएनए स्रोत प्लेट की तैयारी का चित्रण करते हुए, जीपीसीआर टैंगो निर्माण पहले 96-वेल प्लेट के एक आधे हिस्से से पूर्ण 384-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित हो जाते हैं, प्रत्येक रिसेप्टर को अष्टक में ट्रांस्ट्रल किया जाता है। इस सेटिंग में, (+) के साथ कोशिकाओं की उत्तेजना और बिना (-) ब्याज की दवा (एस) प्रत्येक व्यक्ति रिसेप्टर के लिए चौगुनी में होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रेस्टो-टैंगो प्राथमिक स्क्रीनिंग से हिट पहचान के चित्रमय अभ्यावेदन। एक सबूत के रूप में अवधारणा, GPCRome पर एक क्रोमाफिन ग्रेन्यूल (सीजी) निकालने की जैविक गतिविधि का विश्लेषण किया गया था । एचटीएलए कोशिकाओं को 168 जीपीसीआर टैंगो निर्माण के साथ 384 अच्छी प्लेटों में ट्रांस्ट्रल किया गया था, और या तो सीजी एक्सट्रैक्ट (+ यौगिक) या वाहन बफर (-यौगिक) के साथ उत्तेजित किया गया था। pcDNA3.1 एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और DRD2 रिसेप्टर क्विंपिरोल के साथ उत्तेजित एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । रिसेप्टर एक्टिवेशन में सिग्नल खिड़कियां(ए)और लॉग2 गुना परिवर्तन(बी)की गणना सीजी निकालने की अनुपस्थिति या उपस्थिति में कुओं के बीच की गई थी। सभी त्रुटि सलाखों के एसडी (n = चार माप) का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: माध्यमिक स्क्रीनिंग में उत्तेजना के लिए 96-अच्छी तरह से दवा प्लेट तैयारकरने का लेआउट। सेल उत्तेजना के लिए 96-अच्छी तरह से दवा प्लेट की तैयारी का चित्रण, पंक्ति एच में10-5 मीटर (अंतिम एकाग्रता) पर 16-पॉइंट खुराक वक्र रेंज शुरू करने के लिए धारावाहिक कमजोरियां, प्रत्येक बिंदु के बीच आधा लॉग अंतराल के साथ पंक्ति में10-12.5 मीटर तक ए "उच्च" और "कम" दवा स्तंभों का उपयोग वरीयता प्राप्त 384-अच्छी प्लेट की बारी पंक्तियों को उत्तेजित करने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: कंपाउंड प्रोफाइलिंग के लिए खुराक-वक्र प्रतिक्रियाएं और माध्यमिक स्क्रीनिंग में जीपीसीआरएस के लिए 2 भर्ती में गिरफ्तार करने के प्रदर्शन । एचटीएलए कोशिकाएं रिसेप्टर्स डीआरडी3(ए)और ओपीएन5(बी)से क्षणिक रूप से संक्रमित थीं। दोनों ट्रांससंक्रमित स्थितियों को आधा लॉग वेतन वृद्धि में सीजी निकालने के साथ-साथ एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में DRD3 विशिष्ट एगोनिस्ट क्विंपिरोल के साथ प्रेरित किया गया था, और एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में OPN5 के लिए वाहन बफर। सभी त्रुटि सलाखों के एसडी (n = तीन माप) का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

सहमति से गतिशील जीपीसीआरएस सिग्नल ट्रांसड्यूक्शन के पावरहाउस हैं। इन हेप्टाहेलिक रिसेप्टर्स की बाध्यकारी जेब के शारीरिक गुण, साथ ही उनकी शारीरिक प्रासंगिकता जीपीसीआर लिगामेंट स्क्रीनिंग टूल की आवश्यकता को रेखांकित करती है। जैसा कि ऊपर प्रस्तुत किया गया है, प्रेस्टो-टैंगो परख तेजी से, संवेदनशील और उपयोगकर्ता के अनुकूल है, खुद को दवा विकास के लिए उधार । न केवल यह परख एगोनिस्ट-प्रेरित सक्रियण को मापती है, बल्कि इसका उपयोग विरोधी और एल्लॉस्टिक मॉड्यूलर19की गतिविधि की मात्रा निर्धारित करने के लिए भी किया जा सकता है। कार्यात्मक चयनात्मकता के प्रकाश में, एक अवधारणा जो यह बताती है कि विभिन्न दवा संरचनाएं एक ही रिसेप्टर पर विभिन्न रिसेप्टर सिग्नलिंग कैस्केड प्राप्त कर सकती हैं, जी-प्रोटीन निर्भर परस्त का उपयोग करके जी-प्रोटीन मार्ग की सक्रियता की तुलना PRESTO-टैंगो का उपयोग करभर्ती में गिरफ्तारी के साथ कम नकारात्मक दुष्प्रभावों के साथ डिजाइनिंग लीड यौगिकों के लिए संकेत प्रदान कर सकती है। विशेष रूप से, जी प्रोटीन युग्मन का पता लगाने से अपनी स्वतंत्रता अनाथ GPCRs है कि पहले जी प्रोटीन निर्भर assays द्वारा पता नहीं किया गया होगा के लिए युग्मन भागीदारों की पहचान में मदद करता है ।

प्रेस्टो-टैंगो स्क्रीन की स्थिरता और मजबूती सुनिश्चित करने के लिए, प्रोटोकॉल के सभी चरणों में देखभाल की जानी चाहिए, क्योंकि इस मंच की प्रकृति के कारण शुरू किए गए क्षोभ ों को बढ़ाया जाएगा। बेशक, सभी एचटीएस स्क्रीन के लिए सामान्य उपाय आम हैं, जिन्हें ध्यान में रखा जाना चाहिए, जैसे कि समान स्थिरता और जैविक गतिविधि सुनिश्चित करने के लिए एक ही लॉट/फॉर्मूलेशन के अभिकर्मकों का उपयोग करना, साथ ही एचटीएस प्रणाली पर स्थितियां रखना जैसे सेल सीडिंग घनत्व और औषधि ऊष्मायन समय । प्रेस्टो-टैंगो का लघुकृत प्रारूप कुछ महत्वपूर्ण बिंदुओं पर ध्यान देने की मांग करता है: कुओं के बीच सेल सीडिंग घनत्व और उनके सजातीय वितरण (झुरमुट बनाम एकल सेल निलंबन) में भिन्नता, कम ट्रांसफेक्शन दक्षता, और खराब यौगिक उत्तेजना और वितरण दिन-प्रतिदिन और प्लेट-टू-प्लेट प्रजनन क्षमता को रोकदेगा। इस आशय के लिए, सीडिंग से पहले समाधान को समरूप बनाने के लिए एचटीएलए सेल निलंबन को ट्राय करें और ट्रांसफेक्शन से पहले 50-70% सेल कन्फ्ल्युचर सुनिश्चित करें। यौगिकों की डिलीवरी के लिए वाहन को सत्यापित किया जाना चाहिए, जिसमें डाइमेथिल सल्फासऑक्साइड सबसे आम वाहक है। आमतौर पर, हमारी खुराक घटता की उच्चतम एकाग्रता 10 μM है, लेकिन यह यौगिक की प्रकृति और शक्ति के आधार पर बदल सकता है; सेलुलर सहिष्णुता और विषाक्तता को कम करने के लिए विभिन्न सांद्रता का परीक्षण करना महत्वपूर्ण है।

यह देखते हुए कि कुछ GPCRs उच्च संविलियन गतिविधि है, एक मुद्दा है कि स्क्रीनिंग के दौरान पैदा हो सकता है एक कम गतिशील रेंज और एक पृष्ठभूमि संकेत है कि उंमीद से अधिक है । यह सुनिश्चित करके कुछ हद तक कम किया जा सकता है कि सीरम भुखमरी 1% डीएफबीएस के साथ पूरक DMEM माध्यम के साथ किया जा रहा है। यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि यदि ल्यूमिनेसेंस आउटपुट पर्याप्त अधिक है, तो अभी भी निकटवर्ती कुओं में खून बह सकता है, जिसके परिणामस्वरूप गलती से गणना गुना परिवर्तन हो सकते हैं। अज्ञेय या कम संकेत (प्रतिक्रिया को संभालने की उम्मीद है) को कई तरीकों से समझाया जा सकता है, अर्थात् एचटीएलए कोशिकाओं में जीपीसीआर (एस) की खराब अभिव्यक्ति, यौगिक की जैविक गतिविधि इसे अक्षमता प्रदान करती है, या प्रश्न में रिसेप्टर (एस) आंतरिक रूप से भर्ती नहीं होती है। क्रमशः, ट्रांस्रेड प्लाज्मिड रिसेप्टर डीएनए की मात्रा और गुणवत्ता का आकलन करना, प्रश्न में अक्षमता यौगिक के अन्य तैयारियों/बहुत सारे परीक्षण करना, और ऑर्थोलोगस प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन तकनीकजैसे BRET/FRET या सह-इम्यूनोप्रिसिप्रिटेशन करना इस समस्या के कुछ सुझाए गए समाधान हैं । इसके अलावा, रिसेप्टर अभिव्यक्ति को लेंटिवायरल वैक्टर में रुचि के टैंगो रिसेप्टर (एस) को सबक्लोनिंग करके और एचटीएलए कोशिकाओं को पार करने, एचटीएलए-जीपीसीआर स्थिर सेल लाइन उत्पन्न करके भी सुधारा जा सकता है। माध्यमिक स्क्रीनिंग के दौरान एक एगोनिस्ट की अपेक्षित शक्ति में बदलाव का मतलब यह हो सकता है कि प्रतिक्रिया को प्रोत्साहित करने के लिए आवश्यक दवा उत्तेजना समय और/या यौगिक की एकाग्रता अपर्याप्त है, या कि दवा प्लेट धारावाहिक कमजोरियों को गलत तरीके से तैयार किया गया था । चिपचिपा यौगिकों के साथ काम करते समय दवा धारावाहिक कमजोर बनाने के बीच में सुझावों को बदलने के बिना इलेक्ट्रॉनिक मल्टीचैनल पिपेट या स्वचालित पाइप्टर सिस्टम का उपयोग एक मुद्दा हो सकता है।

मूल टैंगो परख के बीच उल्लेखनीय मतभेद Barnea एट अल द्वारा विकसित की है ।18 और प्रेस्टो-टैंगो प्लेटफॉर्म में एक मॉड्यूलर प्रारूप में रिसेप्टर का डिजाइन शामिल है, जिसमें कोडन-अनुकूलित दृश्य शामिल हैं, जो स्तनधारी कोशिकाओं में रिसेप्टर अभिव्यक्ति में सुधार करता है, एपिटोप टैग ने कहा कि अभिव्यक्ति को मान्य करने के लिए, और प्रतिबंध साइटें जो जीपीसीआरएस, V2 पूंछ और TEVcs-tTA को पार्श्व करती हैं, भागों और सबक्लोनिंग के एक्सीशन के लिए सक्षम करती हैं। सबसे महत्वपूर्ण बात, PRESTO-टैंगो स्क्रीनिंग शक्ति और प्रयोगात्मक डिजाइन के मामले में टैंगो परख से बढ़कर है । लगभग 300 जीपीसीआरएस का चौगुनी नमूना परीक्षण केवल 8 384-अच्छी प्लेटों में पूरा किया जाता है, जबकि ट्रांसफेक्शन दक्षता की निगरानी के लिए नकारात्मक पृष्ठभूमि नियंत्रण और सकारात्मक नियंत्रण के लिए लेखांकन। जबकि प्रेस्टो-टैंगो केवल रुचि के केवल एक यौगिक के साथ GPCR-ome स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है, कई ligands के साथ पूछताछ भी किया जा सकता है, हालांकि बढ़ी हुई लागत और संसाधनों के उपयोग पर, जैसे पूल्ड या सरणी छोटे अणु यौगिक पुस्तकालयों या जैविक नमूनों के साथ जो विभिन्न रासायनिक संस्थाओं के मिश्रण से मिलकर बनता है । माना कि इस मुद्दे को प्रश्न में यौगिक पुस्तकालयों की रासायनिक समानता और विविधता विश्लेषण करके पूछताछ करने के लिए यौगिकों की संख्या को कम करके कम किया जा सकता है । जबकि प्रेस्टो-टैंगो प्लेटफॉर्म प्राथमिक स्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए अधिक लागू होता है, लिगामेंट उत्तेजना के कार्यात्मक परिणामों की पुष्टि करने के लिए माध्यमिक प्रोफाइलिंग को मध्यम या कम थ्रूपुट प्रारूपों में छोटे पैमाने पर किया जा सकता है। हालांकि, अन्य सभी GPCR परख के साथ के रूप में, यह स्वीकार किया जाना चाहिए कि टैंगो परख के साथ माध्यमिक स्क्रीनिंग के दौरान अनाथ रिसेप्टर्स के लिए कोई उपयुक्त सकारात्मक नियंत्रण कर रहे हैं । फिर भी, संभावित सकारात्मक हिट की पहचान की जा सकती है यदि आउटपुट डेटा को एक सिगमोइडल खुराक-प्रतिक्रिया वक्र में फिट किया जा सकता है, जिसमें एक गणना संकेत खिड़की और EC50 मूल्य है। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि लिगामेंट गतिविधि का तंत्र, चाहे वह अनाथ या गैर-अनाथ रिसेप्टर्स के लिए हो, समानांतर परख ों को चलाने के बिना स्पष्ट नहीं किया जा सकता ।

एचटीएलए सेल लाइन और जीपीसीआर टैंगो निर्माण सहित पहले से ही अनुकूलित प्रेस्टो-टैंगो के सभी घटकों के साथ, दवा उत्तेजना के लिए उपयोग किए जाने वाले यौगिक निर्माण (एस) के विकल्प के अलावा संशोधन के लिए थोड़ा कमरा आवश्यक है। यदि वांछित है, तो क्लोनिंग द्वारा रिसेप्टर व्यक्त करने वाली एचटीएलए सेल लाइन को क्लोनिंग द्वारा आसानी से उत्पन्न किया जा सकता है, अनुशंसित pIRESbleo3 वेक्टर (क्लोनटेक) के भीतर जीपीसीआर-टैंगो रिसेप्टर ने कहा, और ज़ेसिन का उपयोग करके क्लोन का चयन किया जा सकता है। pcDNA3.1 से pIRESbleo3 के लिए स्वैप के संबंध में, बस जीपीसीआर टैंगो नोटी और XbaI के साथ निर्माण पचा और प्रतिबंध साइटों NotI और NheI पर गंतव्य वेक्टर में डालने । बावजूद इसके, इस तकनीक को अनुकूलित करने और अनुकूलित करने के रास्ते हैं। इस तकनीक के स्तंभों में से एक HTLA कोशिकाओं, एक HEK293T सेल लाइन stably एक 2-गिरफ्तार 2-TEV संलयन जीन और एक टीटीए पर निर्भर लूसिफ़ेरेज रिपोर्टर, शालीनता से रिचर्ड एक्सल की प्रयोगशाला से आपूर्ति व्यक्त कर रहे हैं । जबकि PRESTO-टैंगो का एक महत्वपूर्ण घटक, वर्तमान में सेल लाइन मूल, या जीन वे व्यक्त के मामले में कोई अंय विकल्प हैं । इसके अलावा, भविष्य के इंजीनियर सेल लाइनों को अन्य टीवी फ्यूजन जीन को व्यक्त करने के लिए उत्पन्न किया जा सकता है ताकि वे अन्य प्रोटीनों को ट्रैक कर सकें, विशेष रूप से उन लोगों को जो पहले जीपीसीआरएस के निवास पर बातचीत करने या पाए गए हैं, जैसे 14-3-322,SAP9723,और24कशेरुकी में गैर-गिरफ्तारी दृश्यों का अधिक प्रचलित आइसोफॉर्म है। यह माता-पिता एचटीएल कोशिकाओं का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है जिसमें पूरी तरह से tetO7 प्रमोटर द्वारा नियंत्रित लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर शामिल था। PRESTO-टैंगो के लिए एक सीमा रिपोर्टर प्रमोटर की गैर विशिष्ट सक्रियण है । टेट्रासाइक्लिन-निर्भर नियामक प्रणाली (टीईटी प्रणाली) के आधार पर, टेट्रासाइक्लिन-उत्तरदायी तत्व (टीआरई) डाउनस्ट्रीम लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है। हालांकि, पिछले अध्ययनों ने25,26एंडोजेनस ट्रांसक्रिप्शन कारकों के कारण ल्यूसिफ़ेरेज़ की "टपकाहुआ" अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया है। नतीजतन, कुछ यौगिक रिपोर्टर को 2 भर्ती या जीपीसीआर सक्रियण में गिरफ्तार करने से स्वतंत्र रूप से सक्रिय हो सकते हैं, जिससे झूठे सकारात्मक की संख्या बढ़ सकती है । एक और मुद्दा जो उभरता है, अन्य एचटीएस विधियों के लिए भी आम है, "लगातार हिटर्स", संकीर्ण यौगिक हैं जो कईलक्ष्यों 27में पर्याप्त प्रतिक्रियाओं को प्रोत्साहित करते हैं। बहरहाल, PRESTO-टैंगो के समानांतर स्क्रीनिंग सेट-अप इन कलाकृतियों की पहचान की सुविधा है, जो आगे लूसिफ़ेरेज गतिविधि पर उनके प्रभाव की पुष्टि करने के लिए परीक्षण किया जा सकता है । कुल मिलाकर, प्रेस्टो-टैंगो ने जीपीसीआर की भर्ती में गिरफ्तारी के अध्ययन के लिए ठोस नींव प्रदान की है, और दवा खोज की बड़ी योजना में, एक उपयोगिता जीपीसीआर लिगामेंट स्क्रीनिंग और डीटॉरिटेनाइजेशन टूल के रूप में।

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Disclosures

ऑटघंटे कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

इस काम को कनाडा के इंस्टीट्यूट्स ऑफ हेल्थ रिसर्च (सीआईएचआर ग्रांट #MOP142219) ने सपोर्ट किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile NUNC 12-566
384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile NUNC 12-566-1
384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid ThermoFisher 12-565-390
Antibiotic-Antimycotic Wisent 450-115-EL
D-Luciferin, sodium salt GoldBio LUCNA
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Corning 10-013-CV
Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15–300 µL Eppendorf 4861000155
Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5–100 µL Eppendorf 4861000139
Matrix Platemate 2x3 ThermoFisher 801-10001
MicroBeta 1450 Wallac Perkin Elmer
Penicilin-Streptomycin Wisent 450-201-EL
Poly-L-Lysine hydrobromide Millipore-Sigma P2636-500MG
Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit Addgene Kit #1000000068

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बायोकेमिस्ट्री इश्यू 157 जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स लिगामेंट स्क्रीनिंग ड्रग डिस्कवरी डीअनाथाइजेशन हाई-थ्रूपुट टैंगो परख 2 जी-प्रोटीन-इंडिपेंडेंट परख जीपीसीआर-ओम
PRESTO-टैंगो परख का उपयोग कर एक GPCR-वाइड पैमाने पर लिगांड स्क्रीनिंग के लिए 2 भर्ती के समानांतर पूछताछ
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Zeghal, M., Laroche, G., Giguère, P. M. Parallel Interrogation of β-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay. J. Vis. Exp. (157), e60823, doi:10.3791/60823 (2020).

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