Summary
GPCRs가 매력적인 약물 성 표적이라는 점을 감안할 때, GPCR 리간드 스크리닝은 따라서 납 화합물의 식별및 탈판화 연구에 필수적입니다. 이러한 노력에 대해, 우리는 PRESTO-탱고, TEV 기반 기자 분석기를 사용하여 약 300 GPCRs에서 과도 β arrestin2 모집의 동시 프로파일링에 사용되는 오픈 소스 자원 플랫폼을 설명합니다.
Abstract
세포 신호 경로의 영역의 가장 크고 가장 다양한 유전자 슈퍼 패밀리 및 중재자로서, G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)는 제약 산업에 대한 가장 유망한 목표 중 하나를 나타냅니다. GpCR 리간드 스크리닝 분석의 설계, 구현 및 최적화는 신약 발견및 GPCR 약리학 및 결과 조작을 위한 원격 제어 도구를 나타내므로 매우 중요합니다. 과거에, G 단백질 의존적인 희구한 조사는 연구의 이 지역을, 리간드 유도한 사건을 검출하고 이차 메신저의 생성을 정량화했습니다. 그러나, 기능적 선택성의 출현 이후, 뿐만 아니라 여러 다른 G 단백질 독립적 인 경로의 증가 인식과 G 단백질 의존적 인 반응성 반응성 반응성 반응제와 관련된 제한, 대안의 생성을 향한 더 큰 추진이있다 GPCR 리간드 스크리닝 검거 검사. 이러한 노력에 대해, 우리는 이러한 자원 중 하나의 응용 프로그램을 설명, PRESTO-탱고 플랫폼, 인간 GPCR-ome의 병렬 및 동시 심문을 가능하게 하는 luciferase 기자 기반 시스템, 이전에 고려 된 위업 기술적, 경제적으로 실현 불가능합니다. G-단백질 독립적인 β-arrestin2 모집 분석에 근거하여, GPCRs에서 β-arrestin2 중재된 인신 매매 및 신호의 보편성은 PRESTO-TANGO를 대략 100를 포함하여 대략 300의 비 후각 인간 GPCRs를 공부하기위한 적당한 공구를 만듭니다 고아 수용체. PRESTO-Tango의 감도와 견고성은 알려진 약물에 대한 새로운 GPCR 표적을 발견하거나 고아 수용체에 대한 새로운 리간드를 발견하기 위해 사용되는 화합물 라이브러리를 사용하여 1 차적인 고처리량 스크린에 적합합니다.
Introduction
G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)는 세포와 그 환경 사이의 통신 인터페이스로 작동하는 가장 크고 가장 다양한 세포 막 단백질 제품군을 구성합니다1. GPCRs의 다양성은 신경 전달 물질에서 뉴클레오티드, 펩티드, 그리고 더 많은 -뿐만 아니라 세포 성장에 관련된 수많은 다운 스트림 신호 캐시드를 조절하는 능력뿐만 아니라, 세포 성장, 이동, 분화, 세포 발사, 등 등 리간드의 다양한 배열을 감지 할 수있는 능력에 의해 강조된다2,3. 생리적 과정의 무리에 그들의 보편성과 관여를 고려, 이 수용체 가족은 현재 유효한 처방 된 약물의 3 분의 1 이상이 GPCRs4를대상으로한다는 사실에 의해 전시, 가장 치료 중요성이다. 그러나, 이러한 기존 치료는 슈퍼 패밀리의 작은 하위 집합을 대상으로 (추정 된 10%), 그리고 많은 GPCRs의 약리학 은 elucidated 남아. 더욱이, 100개 이상의 GPCR은 내인성 리간드5와일치하지 않았기 때문에 고아 수용체로서 존재한다. 따라서, GPCR 리간드 스크리닝은 납 발견 및 최적화를 향한 길을 열어주며, 아마도 임상 시험 단계로 가는 데 있어 매우 중요합니다.
GPCR 리간드 스크리닝을 위한 방법은 전통적으로 G 단백질 의존성 또는 G-단백질 독립적인 기능성 검사법6의두 가지 범주 중 하나에 빠졌다. GPCR 신호는 이종성 G 단백질(Gαβγ)에 의해 조절되며, 이는 Gα 서브유닛7에결합된 GDP에 대한 GTP의 교환에 의해 활성화된다. 활성화된 수용체로부터의 신호는 cAMP, 칼슘, DAG 및 IP3와 같은 보조 메신저를 통해 G-단백질에 의해 변환되어 다운스트림 이펙터에서 다운스트림 신호를중재한다 8. G 단백질 신호의 기능적 결과의 본질은 수용체 활성화를 반영하는 세포 기지를 둔 분석문을 만들기 위하여 이용되었습니다. 이러한 방법은, G-단백질 신호에서 근위(direct) 또는 원위(direct) 사건을 측정하는, GPCR 리간드 스크리닝에 가장 빈번하게 사용되며 주로 탈판화 연구에서 사용되어 왔다6. GPCR 매개 G 단백질 활성화를 직접 측정하는 분석법의 예는 [35S]GTPγS 결합 분석, 이는 Gα 소단위로 방사성 표지 및 비 가수분해성 GTP 아날로그의 결합을 측정하고, Förster/bio luminescence 공명 에너지 전달(FRET/BRET, 각각) 프로브를 측정하여 GPCR-Gα 및 Gα/Gγ 상호작용을 모니터링하는 프로브로, 이는9,10년동안 더 많은 견인력을 얻고 있다. 말단 이벤트를 모니터링하는 assays는 GPCR 프로파일링에 가장 일반적으로 사용되는 도구입니다. 예를 들어, cAMP 및 IP1/3 측정은 G-단백질 의존이 되는 이차 메신저의 세포내 축적을 측정하는 반면, [Ca2+]플럭스 및 리포터 어설션은 G-단백질 활성화에 연루된 특정 반응 요소(CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE)가 시그널링캐스케이드(11)를더 하류로 검사하는 경우이다. 전술한 대부분의 검사는 처리량이 높은 수준에서 수행될 수 있지만, 상당히 민감하고, 특정 분석특이 특이적 이점(예를 들어, GTPγS 결합의 경우 전체/부분 작용제, 중성 길항제 및 역 작용제 간의 차별, 또는 [Ca2+ ]및 IP1/3)와 같은 라이브 세포에 대한 분석 기능6,불행히도 전체 약물 의 심문에 부합하는 기존의 G-단백질 의존적 방법이 없다. 이것은 GPCRs에 다중 G 단백질 하위 가족의 네이티브 결합에 크게 기인합니다, 고아 GPCRs에 몇몇 폭포 및 알려지지 않은 G 단백질 결합에 신호의 결과로. 이 문제점을 완화하기 위하여는, asays는 cAMP와 같은 단 하나 일반적인 신호 판독을 통해 무차별적인 G 단백질 결합을 강제하기 위하여 개발되었습니다, 및Ca2+,이기는 하지만 그들 대부분은 낮은 처리량12입니다.
GPCR 수명 주기의 중요한 양상은 G-단백질-의존성 신호전달의 종결이며, 이는 G-단백질의 해리를 유도하는 β-arrestins의 모집을 통해 상당 부분 발생하고, 궁극적으로 는 클라트린 코팅 내재화를 대상으로 하는 수용체를 둔감화한다13. β-arrestin의 가장 유비쿼터스 표현된 이소폼은 비시각적 β-arrestin1 및 β-arrestin2, 또한 체포-2 및 체포-3로 각각14로표기된다. GPCR 리간드 스크리닝에 새로운 차원을 추가하는 G-단백질 독립적인 세포 기반 검혈을 입력합니다; 수용체 인신 매매, 라벨없는 전체 세포, β-arrestin 모집 세포는 모두 주목할만한 예입니다. GPCR trafficking assays employ fluorophore-labeled ligands or co-internalized antibodies targeting the receptor15, whereas label-free whole cell assays use biosensors which translate cellular changes induced by ligand binding into quantifiable outputs, such as electrical or optical signals16. 특히, 전형적인 GPCR-β-arrestin 상호작용은 β-arrestin 모집 분석법의 레퍼토리에서 매력적인도구로서 17. 불과 10년 전, 바네아 외가 처음 개발한 탱고 시스템, 담배 에칭 바이러스 프로테아제 (TEVp)와 β-arrestin2로 구성된 단백질 융합 , 담배 등 통해 GPCR에 묶여테트라 사이클린 형질 전환기 (tTA)의 세 가지 외인성 유전 요소의 도입을 포함한다 바이러스 프로테아제 분열 부위(TEVcs)는 V2 바소프레신 수용체(V2 tail)의 C-종단으로부터의 서열에 선행되어 체포모집을 촉진하고, 그의 전사가 발동되는 기자 루시퍼라제 유전자는 tTA 전사 인자는 β-arrestin2 모집에 따라 막 앵커링으로부터 해방되는 핵으로전좌(도1)18. GPCR 활성화 및 β-arrestin2 모집의 정량 적 판독은 발광을 위해 판독에 의해 이후에 결정될 수 있다. 주목할 만한 구별은 수용체 인신 매매 및 라벨없는 전체 세포 방법이 상대적으로 낮은 처리량이지만, 탱고는 신호 통합으로 인한 표적 수용체 및 감도에 특이적인 선택적 판독을 포함하여 몇 가지 장점을 가지고 있으며, 이는 더 큰 규모의 리간드 스크리닝에 적합한후보(18)이다.
이러한 전략적 특징을 고려하여, 크로에즈 등은 PRESTO-Tango(병렬 수용체-오메 발현 및 전사 출력 탱고를 통한 스크리닝)를 개발했으며, 탱고 접근법을 사용하여 약물성 GPCR-ome을 병렬 및 동시 방식으로 프로파일링하는 고처리량 오픈 소스플랫폼19를개발했다. 거의 모든 GPCRs에 β-arrestin2의 "무차별"모집을 이용, PRESTO-탱고는 세포 기반 기능 분석의 측면에서 최초의 종류입니다, 거의 모든 비 후각 GPCRs에서 작은 분자 화합물의 빠른 "첫 번째 라운드"스크리닝을 가능하게, 고아를 포함, G-단백질 하위 가족 커플링과 무관.
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Protocol
1. 1 차 선별 : 세포 배양 및 플레이트 시딩
- 폴리-L-리신(PLL) 코팅 플레이트를 준비하려면 전자 멀티채널 파이펫 또는 시약 디스펜서를 사용하여 흰색 또는 검은색 384웰 광학 바닥 플레이트에 PLL의 25 μg/mL 스톡 솔루션의 20 μL/well을 분배합니다. 0.5-2 시간 동안 실온에서 플레이트를 배양하십시오.
참고: 검정색 384웰 플레이트를 사용하는 경우 흰색 플레이트에 비해 배경 신호가 낮아질 것으로 예상합니다. 검은 판은 인접한 우물 사이의 발광의 출혈을 줄이기 위해 권장됩니다. - 코팅된 플레이트를 보존하고 여분의 PLL을 씻어내려면 싱크대 위로 가볍게 치우고 종이 타월 위에 두드려 PLL을 제거하고 전자 멀티채널 파이펫 또는 시약 디스펜서를 사용하여 희석된 1x 용액 의 40 μL/well을 추가합니다. 플레이트 파종을 위해 준비가 될 때까지 PLL 코팅 플레이트를 4°C에서 보관하십시오.
- HTLA 세포 유지 (리처드 악셀 박사에 의해 친절하게 제공)-인간 배아 신장 세포주 (HEK293T) 안정적으로 β-arrestin2-TEV 및 tTA 구동 루시퍼라제를 발현 -완전한 덜베코의 수정 된 독수리의 배지 (DMEM) 태아 소 소 세럼의 5 %로 보충, 소 송아지 세럼의 5%, 2.5 μg/mL의 푸로마이신, 50 μg/mL의 히그로마이신, 100 U/mL 페니실린, 37°C에서 100 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 가습 된 인큐베이터에서 5%CO2를함유하고 있다.
- 배양 HTLA 세포는 150 mm 접시에 있고 1:10의 희석 인자에서 일주일에 두 번 세포를 통과시키고, 최적의 세포 전달 수 5-25의 수를 갖는다. 1차 화면의 규모에 따라 384웰 플레이트 파종의 날에 충분한 수의 150mm 접시가 동시제공되도록 하십시오.
참고: 통로 25보다 큰 HTLA 세포를 사용하면 생존율이 저하되어 최적이 아닌 결과를 얻을 수 있습니다. - 1차 스크린을 위한 HTLA 세포를 시드하려면, 1x 인산완충식염수(PBS), pH 7.4로 150mm 접시(들)를 부드럽게 헹구십시오. 약 6 mL의 트립신/0.53 mM EDTA로 세포를 분리하고, 트립신을 중화시키기 위해 완전한 덜벡코의 변형된 이글 배지(DMEM)를 적어도 동일한 양을 포함하는 원심분리관으로 이송한다.
- HTLA 세포를 500 x g에서 3분 동안 스핀다운하고 완전한 DMEM에서 0.22 x 106 세포/mL의 밀도로 세포 펠릿을 다시 일시 중단하고, 2.5 μg/mL의 퓨로마이신과 50 μg/mL의 보습 효능을 감소시킬 수 있습니다.
- 37°C에서 필요한 384웰 PLL 코팅 플레이트를 배양하여 파종 세포 전에 따뜻하게 합니다. 384웰 PLL 코팅 플레이트에서 1x 항생제 항균제의 저장 용액을 싱크대 위로 가볍게 치고 종이 타월 위에 테이핑하여 건조시다.
- 종자 세포는 전자 멀티채널 파이펫을 사용하여 0.22 x 106 셀/mL HTLA 현탁액의 45 μL을 분배함으로써 10,000개의 최종 밀도에서 384웰 PLL 코팅 플레이트내로 코팅되었습니다. 하룻밤 동안 37 °C에서 플레이트를 배양합니다. 당일 형질감염이 바람직한 경우, 종자 세포는 16,000 개의 밀도에서 잘 및 형질 감염을 수행 4 시간 후.
참고: 높은 형질 감염 효율을 위해 50-70% 세포 융합이 최적입니다.
2. 1 차 선별 : DNA 판 준비 및 형질 전환
- 그림 2에나타난 바와 같이 형질을 위한 384웰 DNA 소스 플레이트를 준비하기 위해, 다른 GPCR/well을 가진 96웰 플레이트에 관심 있는 GPCR-탱고 구조를 인코딩하는 플라스미드 cdDNA를 분배한다. 플라스미드 DNA는 50 ng/μL의 농도에서 0.1x Tris-EDTA(TE) 완충액으로 중단되어야 합니다.
참고: 96웰 DNA 플레이트는 -20°C에서 밀봉 및 보관할 수 있으며, 여러 스크리닝 실험에 재사용할 수 있습니다. GPCR-탱고 구문을 인코딩하는 모든 cDNA는 시판되고(재료 표참조) pcDNA3.1 네오마이신 플라스미드에서 복제됩니다. PRESTO-Tango GPCR 키트는 각각 80개의 GPRS, 음의 대조군으로 빈 벡터가 있는 웰 몇 개, 도파민 수용체 D2(DRD2)를 보유하는 양성 대조군 웰, 형광 효율을 추적하기 위해 형광 단백질(YFP)을 코딩하는 플라스미드를 운반하는 웰을 포함하는 4개의 96웰 플레이트로 구성됩니다. - 다중 채널 파이펫을 사용하여 96 웰에서 384 웰 DNA 소스 플레이트로 DNA 용액을 수동으로 이송하고 384 웰 당 10 μL을 추가합니다. 실험의 각 조건이 4중 으로 분석되도록 하기 위해, 96웰 DNA 플레이트(행 A-D 또는 E-H)의 절반은 2개의 사분면(제1 사분면 =- 화합물, 제2 사분면 =+ 화합물)에 각 GPCR을 분배함으로써 전체 384웰 플레이트를 커버할 것이며, 그러한 GPCR이 384-도2의 8웰에서 형질화될 것이다(도2 참조).
- 요르단 외20: 0.1x TE 완충액 (1 mM Tris-HCl 및 0.1 mM EDTA)에 의해 설명된 바와 같이 칼슘 인산염 침전 방법에 필요한 다음과 같은 형질 감염 시약을 조립한다; 2.5 M CaCl2 용액; 2x 헤페스 버퍼, pH 7.05 (50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4). 여과하여 모든 솔루션을 살균하고 4 °C에 보관하십시오. 형질전환의 날, 시약이 사용하기 전에 실온에 도달 할 수 있습니다.
- 2.5M CaCl2 스톡 용액을 0.1x TE(1:8 희석)로 희석하여 0.313 M CaCl2 및 와류의 최종 농도로 희석합니다. 40 μL의 0.313 M CaCl2를 384웰 DNA 소스 플레이트에 옮기고 핸드헬드 멀티채널 파이펫 또는 자동 벤치탑 384채널 파이펫으로 위아래로 파이펫팅하여 혼합합니다.
- 384 웰 DNA 소스 플레이트에 2x Hepes 버퍼 50 μL을 추가하고 위아래로 파이펫팅하여 다시 혼합하고 1 분 동안 방치하십시오. 각 384-well은 시험해야 하는 화합물의 수에 따라 9개의 384웰 플레이트의 형질감염에 대해 적절한 양의 DNA/형질감염 혼합물을 갖게 됩니다. 384웰 DNA 소스 플레이트로부터 DNA/형질감염 혼합물의 10 μL을 시드HTLA 세포로 옮기고 37°C에서 밤새 플레이트를 배양한다.
3. 1 차 스크리닝: 세포 자극
- 24시간 후, 384웰 플레이트를 싱크대 위로 부드럽게 쓸어넘기고 종이 타월 위에 테이핑하거나 흡입기 헤드로 테이핑하여 형질감염된 세포 매체를 디펜더합니다. 40 μL의 굶주림 을 천천히 추가하십시오 (DMEM은 1 % 투석 된 태아 소 혈청 (dFBS)과 1 x 항생제 / 항균제로 보충되어 세포를 직접 만지지 않도록주의하십시오.
- 관심 있는 화합물의 피펫 20 μL은 3배 농도(세포 플레이트 내의 약물의 최종 농도는 1x가 될 것이다)를 (+) 자극을 가진 교대행으로, 및 (-) 화합물없이 교대행에 대한 비히클 버퍼의 20 μL이다. 5%CO2에서 37°C에서 세포 판을 반환하고 적어도 16 시간 동안 배양한다.
4. 1차 검진: 발광 독서
- 베이커와 보이스21에서개질된 글로 시약을 준비한다: 108 mM 트리스-HCl; 42 mM 트리스 베이스, 75 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 5 mM 디티오트레이 톨 (DTT), 0.2 mM 코엔자임 A, 0.14 mg/ ml D-루시페린, 1.1 mM ATP, 0.25% v/v 트리톤 X-100, 2 mM 하이드로핏.
참고 : 시약의 재고 용액은 항상 분말 형태로 Glo 시약에 신선하게 첨가되는 D-Luciferin을 제외하고 사전에 만들 수 있습니다. 블랙 플레이트를 사용 하는 경우, D-루시퍼린의 양을 증가 시킬 수 있다 0.25 mg/mL. - 자극 후 16-24 시간에서, 부드럽게 싱크대 위에 384 웰 플레이트를 가볍게 가볍게 가볍게 하고 종이 타월 위에 테이핑하여 형질 감염 된 세포 매체를 decant. Glo 시약 의 20 μL / well을 추가하고 5-20 분 동안 실온에서 플레이트를 배양하십시오.
5. 1차 선별: 데이터 분석
- 발광 카운터에서 저장된 파일을 스프레드시트로 내보냅니다. 결과는 상대 발광 단위(RLU)로 기록됩니다. 384 웰 플레이트의 레이아웃에 기초하여, 다음 공식을 사용하여 각 수용체의 활성화 (접기 변화)를 계산한다:
참고: 여기서 샘플 RLU는 자극된(+ 화합물) 사분면의 4개의 복제 웰각각의 값을 의미하며, 평균 배경 RLU는 플레이트상에서 의 음의 대조군의 평균이며, 평균 기저 RLU는 동일한 수용체의 처리되지 않은 사분면의 평균을 의미한다(- 화합물)을 참조하십시오. 또한 4개의 데이터 점의 표준 편차를 계산하여 결과의 품질을 확인합니다. 이종을 정류하기 위해 접기 변경의 평균에 log2 변환을 수행하는 것이 좋습니다. log2 베이스는 포지티브 적중을 식별하는 데 도움이 되는 실용적인 선택입니다. 경험적으로 양수 적중 임계값을 설정; 그것은 주목 해야 한다 일부 수용 체로 낮은 가질 수 있다 2 배 증가 및 최대 40 배 증가 전체 주 작동 근을 가진 다른 사람에 대 한. - 결과에 따라 보조 스크리닝에 대한 잠재적 인 긍정적 인 적중인 GPCR을 선택하십시오.
6. 이차 스크리닝: 세포 종자 및 형질 전환
- 100 mm 의 서브 배양 HTLA 세포는 완전한 배지의 11 mL에서 5 x 106 세포의 총 세포 밀도에서 요리및 24 시간 동안 37 °C에서 배양한다. 당일 형질감염이 바람직한 경우, 종자 세포는 7.5 x 106 세포의 밀도로 추하4시간 후 수행한다.
- 실온에서 칼슘 인산염 침전에 필요한 시약을 미리 따뜻하게 합니다. 450 μL의 0.1x TE 버퍼를 2.5 M CaCl2의 50 μL과 결합하고 신속하게 소용돌이; 이 양은 보유 하는 성장 매체의 볼륨에 따라 하나의 100 mm 접시에 대 한 특정.
- 튜브에 TE/CaCl2 용액 500 μL을 GPCR cDNA 및 와류 10 μg에 추가합니다. 튜브에 2x Hepes 버퍼 용액 500 μL을 넣고 힘차게 흔들고 (소용돌이하지 않음), 1 분 동안 배양하십시오.
참고: 형광 단백질(예: YFP, mCherry 등)을 코딩하는 임의의 플라스미드의 1 μg는 총 10 μg에 대해 9 μg의 GPCR cDNA와 함께 공동 트랜스펙트될 수 있다. 형광 단백질은 형질 감염 효율을 추적하는 데 사용되며,이 최소량은 분석기를 방해하지 않습니다. - 짧은 배양 직후, 1 mL 용액을 세포에 떨어 뜨려 분배하십시오. 플레이트를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 침전량을 고르게 분배하고, 플레이트를 소용돌이치지 않도록 주의하고, 24시간 동안 37°C에서 배양한다.
- 다음 날, 형광 세포 이미저 하에서 형광 단백질의 발현을 보면서 형질감염 효율을 관찰하는; 50% 커버리지를 초과하는 형질전환이 이상적입니다.
- 37°C에서 인큐베이터에서 필요한 384웰 PLL 코팅 플레이트(들)를 배양하여 파종 세포 전에 따뜻하게 한다. 384웰 PLL 코팅 플레이트에서 1x 항생제 항균제의 저장 용액을 싱크대 위로 가볍게 치고 종이 타월 위에 테이핑하여 건조시다.
- 형질감염된 세포를 Versene 용액(1X PBS, pH 7.4; 0.53 mM EDTA)으로 부드럽게 헹구고 접시에 0.05% 트립신/0.53 mM EDTA의 3 mL을 추가하여 분리합니다. 내용물들을 트립신을 중화시키기 위해 적어도 동일한 양의 완전한 DMEM을 함유하는 원심분리기 튜브로 옮김을 전달한다.
- 500 x g에서 3 분 동안 세포를 스핀 다운하고 굶주린 매체에서 0.4 x 106 세포 / mL의 밀도로 세포를 다시 일시 중단하십시오. 종자 세포는 전자 다중채널 파이펫을 사용하여 세포 현탁액의 45 μL을 분배함으로써 25,000 셀/웰의 최종 밀도에서 384웰 PLL 코팅 플레이트내로. 플레이트를 최소 4시간 동안 37°C로 되돌려 세포가 웰에 적절하게 부착한 후 자극을 진행합니다.
7. 이차 스크리닝 : 16 점 (반 로그) 용량 곡선을위한 약물 판 준비
- 도 4에나타낸 바와 같이, 플레이트의 마지막 행(행 H)을 제외한 96웰 플레이트에서, 1X HBSS 약물 완충액(1x 행크의 균형 잡힌 염액 [HBSS]), 20 mM HEPES pH 7.4, 1x 항생제 항균제의 270 μL을 첨가한다.
참고 : 펩티드, 콜로이드 분자 및 수용성 화합물의 경우 0.1-1 % BSA를 첨가하는 것이 좋습니다. 약물 산화를 방지하기 위해 최대 0.01 %의 아스코르브 산을 첨가 할 수 있습니다. - 약물 스톡으로부터, 최종 3x 농도(세포 판 내의 약물의 최종 농도는 1배)를 계산하여 약물 용액("높은" 농도라고 함)을 준비한다. 일례로, 가장 높은 농도로 10 μM의 투여량-반응 곡선의 경우, 30 μM에서 "높은" 농도를 준비한다. "높음" 농도의 파이펫 300 μL을 H 행의 우물로.
- 다른 튜브에서, 3.16(반로그)으로 나눈 "높음" 농도를 나타내는 "낮음" 농도를 준비한다. 이전 예에 따라 "낮음" 농도는 9.49 μM입니다. "높음" 웰에 인접한 행 H의 웰로의 "낮은" 농도의 파이펫 300 μL.
참고: 행 H에 필요한 96웰의 총 수는 세포 수와 자극 조건에 따라 달라집니다. 4개의 웰(2개의 "높음"과 2개의 "낮음")은 전체 384 웰 플레이트를 자극하는 충분한 약물 용액을 갖습니다. - "높음" 및 "로우" 행 H의 30 μL 의 약물 용액을 이전 행(row G)으로 파이펫팅하여 직렬 희석을 수행하고 "파이펫 및 믹스" 기능을 갖춘 전자 멀티채널 파이펫을 사용하여 수동으로 위아래로 파이펫팅하거나 권장대로 혼합합니다. 희석 사이의 팁을 삭제하면서 첫 번째 및 가장 희석 된 행 (행 A)까지이 단계를 반복합니다.
참고: 원하는 경우 직렬 희석을 A 행 앞에 중지할 수 있으며, 이는 약물이 없는 내부 제어를 나타내는 것, 즉 "true zero"입니다. - 도 4를 참고로, 96웰 플레이트로부터 20 μL의 "로우" 컬럼 희석을 배관하여 형질감염된 세포를 자극하여 이전에 시드된 384웰 플레이트의 A-O행뿐만 아니라 20 μL의 "높음" 컬럼 희석을 37°C에서 37°C에서 배양하여 최소 16시간 동안 플레이트를 인큐베이트한다.
8. 보조 스크리닝: 발광 판독 및 데이터 분석
- 자극 후 16-24 시간에서, 부드럽게 싱크대 위에 384 웰 플레이트를 가볍게 가볍게 가볍게 하고 종이 타월 위에 테이핑하여 형질 감염 된 세포 매체를 decant. Glo 시약 의 20 μL / well을 추가하고 5-20 분 동안 실온에서 플레이트를 배양하십시오.
- 발광 카운터에서 저장된 파일을 스프레드시트로 내보냅니다. 결과는 상대 발광 단위(RLU)로 기록됩니다. 384웰 플레이트의 데이터를 통계 소프트웨어로 전송하여 비선형 회귀 곡선 맞춤을 위해 내장된 XY 해석을 사용하여 결과를 분석합니다. 내장된 3파라미터 용량-응답 자극 기능 "로그(agonist) vs. 응답(3개의 파라미터)",
참고: 여기서 상부와 하부는 Y축의 단위에서 고원이며, 각각 최대 응답 및 기저 수준, EC50은 상하 간에 50% 응답을 생성하는 작용제의 농도이며, X는 작용제의 로그 농도를 의미한다. 이 모델은 용량 응답 곡선의 표준 언덕 경사가 1이라고 가정합니다.
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Representative Results
본 원에 제시된 PRESTO-탱고 프로토콜을 사용하여, 크로마핀 과립(CG) 추출물을 168개의 비후각 GPCR 표적에 대해 스크리닝하였고, 대다수는 고아 수용체이다. 상기 추출물의 프로파일링은 바네아 외18(도 1)에의해 설계된 원리에 기초하여 선택된 수용체에서 β-arrestin2 동원을 조사함으로써 수행되었다. 관심 있는 GPCRs의 플라스미드 cDNA는 PRESTO-탱고 GPCR 키트에서 가져와 원하는 레이아웃의 두 96 웰 플레이트로 조립되었습니다. 총, HTLA 세포로 시드 네 384 웰 플레이트는 형질 감염되었다, 96 웰 DNA 플레이트의 각 절반은 전체 384 웰 플레이트로 만들어졌다, 각 수용체는 두 사분면에 형질 감염되는 결과 (여덟 384 웰 총). 두 사분면 중 하나는 CG 추출물로 자극되었다; 다르게 넣어, 교대 행 C-D, G-H, K-L, 및 O-P는 (+) 자극을 나타냈다(그림 2). 1차 스크리닝에서 심문된 168개의 GPCRs 중, 단지 2개의 수용체만이 잠재적활성 표적으로서 경쟁자였으며, 특히 도파민 수용체 D3(DRD3) 및 옵신 5(OPN5)를 대상으로 하였다. DRD3는 4.70의 상당한 로그2fold 변화를 생성한 반면 OPN5는 2.39의 약간 낮은 응답을 생성했으며, 둘 다 log2 배 변화 >2의 임계값 컷오프를 충족시켰습니다. 이에 비해, 1차 스크린에 대한 양성 대조군은 DRD2가 이 수용체의 선택적 작용제인 퀸피롤로 자극되었고, 4.58의 로그2 배 변화를일으켰다(도 3). 이러한 신호 창을 재현하고 가양성 적중의 가능성을 제거하기 위해, 상기 수용체로 보조 스크린을 실시시켰다. CG 추출물을 테스트하는 것 외에도 DRD3가 비 고아 수용체라는 점을 감안할 때, 또 다른 조건은 선택적 작용제 중 하나인 퀸피롤(quinpirole)을 통한 양성 대조군, 특히 자극으로 제조되었다. 한편, OPN5는 고아 수용체이며, 이와 같이, 어떤 기준 작용제도 양성 대조군으로서 CG 추출물과 함께 시험될 수 없다; 오직 버퍼만이 음성 대조군으로 테스트되었다. 이들 두 GPCRs의 추가 약리학적 특성은10-5M ~ 10-12.5 M에 이르는 16포인트 투여 곡선을 준비함으로써 수행되었으며, 특히 10 mM에서 CG 추출물 및 퀴퀴롤 스톡 용액을 30 μM 및 9.49 μM으로 희석하였으며, 이에 상응하는 "높음" 및 "낮은" 농도를 96약물의 바닥(row H)에 희석시켰다. 이들 제형은10-5M 및10-5.5 M이 될 것이고, 일단 20 μL이 40 μL의 굶주린 배지에서 형질감염된 세포에 분배되고, 각 384 웰 내에서 총 60 μL이 될 것이다. 앞서 설명한 바와 같이, 직렬 희석은 10-12 M 및10-12.5 M에 대한 가장 희석된 약물 형성이 맨 위 행(행 A)에 있도록 수행되었다(도4). 보조 스크리닝에서 투여 량 응답 곡선은 리간드 효능및 효능을 평가하기 위해 GraphPad 프리즘을 사용하여 만들어졌습니다. 퀸피롤과 비교하여, CG 추출물은 유사한 신호 창과 EC50 값을 생성하여 DRD3에서 활성 히트로 그 유효성을 확인했습니다. 그러나, OPN5에 대해 음성 대조군과 유사한 평평한 투여량-곡선이 생성되었고, 이를 CG 추출물에 대한 가능한 표적으로 판정하였다(도5).
그림 1: 탱고 구조(A)의 모듈식 설계 및 β-arrestin(탱고) 모집 분석(B)에 대한 일반적인 계획. (A)GPCR 탱고 구성은 HA 신호/FLAG 태그, GPCR CDS, 바소프레신 수용체 2 C-단말 꼬리, TEV 프로테아제 절단 부위 및 tTA 전사 인자 와 같은 순서로 다양한 모듈 요소로 구성됩니다. (B)탱고 분석의 원리는 HTLA 세포에서 GPCR 탱고 플라스미드를 일시적으로 transfecting 하는 것을 포함, HEK293T 세포 안정적으로 β-arrestin2-TEV 프로테아제 융합 단백질을 발현하고 그의 발현이 tTA에 의해 활성화되는 루시퍼라제 리포터 유전자. GPCR의 활성화는 결국 수용체에 β-arrestin2-TEV의 동원귀착될 것이고, 그것의 절단 사이트에 근접하여 프로테아제들을 가져온다. 그 결과, tTA는 GPCR 꼬리로부터 갈라지고, 전사 인자를 핵으로 옮기고 루시퍼라아제 발현을 활성화시킨다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: PRESTO-TANGO 1차 스크리닝에서 형질전환 및 자극을 위한 96웰 cDNA 플레이트 및 384웰 셀 플레이트의 레이아웃. 형질감염에 대한 384 웰 cDNA 소스 플레이트의 제조를 묘사, GPCR 탱고 구성은 먼저 전체 384 웰 플레이트에 96 웰 플레이트의 절반에서 전송, 각 수용체는 옥터 리케이트에 형질감염되는. 이 설정에서, 관심 있는 약물(-)이 없는 (+) 세포의 자극은 각 개별 수용체에 대해 4중으로 발생한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: PRESTO-탱고 1차 선별에서 적중 식별의 그래픽 표현. 개념 증명으로서, GPCRome에서 크로마핀 과립(CG) 추출물의 생물학적 활성을 분석하였다. HTLA 세포는 168 GPCR 탱고 구조로 384 웰 플레이트에서 형질 감염되었고, CG 추출물 (+ 화합물) 또는 비기 완충제 (- 화합물)로 자극되었다. pcDNA3.1은 음성 대조군으로 사용되었고, DRD2 수용체는 퀴네드로 자극하여 양성 대조군으로 사용되었다. 신호창(A)과log2 배 변화(B)는 수용체 활성화에서 CG 추출물의 부재 또는 존재 시 웰 들 사이에서 계산되었다. 모든 오류 막대는 SD(n = 4개의 측정값)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 이차 스크리닝에서 자극을 위한 96웰 약물 플레이트 제제의 레이아웃. 세포 자극을 위한 96웰 약물 플레이트의 제조를 묘사하고, 16-point 투여 곡선 범위에 대한 직렬 희석은 행 H에서10-5 M(최종 농도)에서 시작하여, 행에서10-12.5 M까지의 반 로그 간격으로 A. "높음" 및 "낮은" 약물 컬럼이 38-플레이트의 교대행을 자극하는데 사용된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 복합 프로파일링에 대한 투여-곡선 반응 및 β-arrestin2 모집의 이차 스크리닝에서의 GPCRs 모집. HTLA 세포는 수용체 DRD3(A) 및OPN5(B)로 과도하게 형질감염되었다. 두 형질 감염 조건은 모두 반 로그 증분의 CG 추출물로 자극되었고, 양성 대조군으로서 DRD3 특이적 아고니스트 퀴누와 OPN5용 비히클 버퍼를 음성 대조군으로 자극했다. 모든 오류 막대는 SD(n = 세 개의 측정값)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
형태역학적 GPCR은 신호 변환의 강국입니다. 이러한 heptahelical 수용체의 결합 포켓의 생리화학적 특성뿐만 아니라 그들의 생리학적 관련성은 GPCR 리간드 스크리닝 도구의 필요성을 강조한다. 위에서 제시한 바와 같이, PRESTO-탱고 분석은 신속하고 민감하며 사용자 친화적이며 약물 개발에 자신을 빌려주고 있습니다. 이 분석은 작용제 유도 활성화를 측정할 뿐만 아니라 길항제 및 알로스테리컬변조기(19)의활성을 정량화하는 데에도 사용될 수 있다. 기능적 선택성에 비추어, 다른 약물 구조가 단일 수용체에서 다른 수용체 신호 캐스케이드를 유도할 수 있음을 시사하는 개념으로, PRESTO-탱고를 이용한 β-arrestin 모집과 G-단백질 의존성 분석기를 사용하여 G 단백질 경로의 활성화를 비교하면 부정적인 부작용이 감소된 납 화합물 설계에 대한 단서를 제공할 수 있다. 특히, G 단백질 결합검출에서 그것의 독립은 G 단백질 의존적인 분석가에 의해 이전에 검출되지 않았을 고아 GPCRs를 위한 결합 파트너를 확인하는 것을 돕습니다.
PRESTO-탱고 스크린의 일관성과 견고성을 보장하기 위해 이 플랫폼의 특성으로 인해 도입된 교란이 확대되기 때문에 프로토콜의 모든 단계에서 주의를 기울여야 합니다. 물론, 동일한 로트/제형의 시약을 사용하여 전체에서 동일한 안정성과 생물학적 활성을 보장하는 것과 같은 모든 HTS 스크린에 공통적인 일반적인 조치가 있을 뿐만 아니라 세포 시종 밀도 및 약물 배양 시간과 같은 HTS 시스템의 조건을 일관되게 유지합니다. PRESTO-Tango의 소형화 된 형식은 몇 가지 중요한 점에주의를 기울여야합니다 : 세포 시종 밀도의 변화와 우물 사이의 균질한 분포 (응집 대 단일 세포 현탁액) , 낮은 형질 감염 효율 및 불량 한 화합물 자극 및 전달은 일상적인 및 플레이트 간 재현성을 방지합니다. 그 효과를 위해, HTLA 세포 현탁액을 시딩 전에 균질화하고 형질감염 전에 50-70% 세포 컨플루전성을 보장한다. 화합물의 전달을위한 차량은 디메틸 설폭사이드가 가장 일반적인 캐리어인 것과 함께 검증되어야합니다. 전형적으로, 우리의 복용량 곡선의 가장 높은 농도는 10 μM, 하지만이 화합물의 특성및 효능에 따라 변경 될 수 있습니다.; 세포 내성 및 독성을 추론 하기 위해 다양 한 농도 테스트 하는 것이 중요 하다.
일부 GPCR은 구성 활동이 높다는 점을 감안할 때, 스크리닝 중에 발생할 수 있는 한 가지 문제는 감소된 동적 범위와 예상보다 높은 배경 신호입니다. 이것은 혈청 기아가 1% dFBS로 보충된 DMEM 배지로 수행되고 있다는 것을 보장함으로써 다소 완화될 수 있다. 발광 출력이 충분히 높으면 인접한 웰로 출혈이 발생할 수 있으며, 이로 인해 잘못 계산된 접기 변화가 발생할 수 있습니다. 검출할 수 없거나 낮은 신호(반응이 예상되는 가정)는 HTLA 세포에서 GPCR(들)의 발현 불량, 화합물의 생물학적 활성이 손실되어 비효율적이거나, 또는 문제의 수용체(들)가 본질적으로 β-arrestin2를 모집하지 않는 여러 가지 방법으로 설명될 수 있다. 각각, 형질감염된 플라스미드 수용체 DNA의 양 그리고 질을 평가하고, 문제의 다른 제제/많은 비효율적 화합물을 테스트하고, BRET/FRET 또는 공동 면역 침전과 같은 정형단백질-단백질 상호작용 기술을 수행하는 것은 이 문제에 대한 몇 가지 제안된 해결책이다. 또한, 수용체 발현은 또한 렌티바이러스 벡터로 관심 있는 탱고 수용체(들)를 서브클로닝하고 HTLA 세포를 변환하여 HTLA-GPCR 안정세포주생성을 통해 개선될 수 있었다. 이차 스크리닝 도중 작용제의 예상된 힘에 있는 교대는 반응을 자극하는 데 필요한 화합물의 약물 자극 시간 및/또는 농도가 불충분하다는 것을 암시할 수 있습니다, 또는 약물 판 직렬 희석이 잘못 준비되었다는 것을. 끈적끈적한 화합물로 작업할 때 약물 시리얼 희석을 만들 때 팁을 변경하지 않고 전자 다중 채널 파이펫 또는 자동화 된 파이펫 시스템을 사용하는 것이 문제가 될 수 있습니다.
Barnea et al.18및 PRESTO-탱고 플랫폼에 의해 개발된 원래 탱고 분석실험의 주목할 만한 차이점은 포유류 세포의 수용체 발현을 개선하는 코돈 최적화 서열로 구성된 모듈식 수용체의 설계, 즉 발현을 검증하는 에피토프 태그, GPCRs, V2 꼬리 및 TEVcs-TTA를 가능하게 하는 제한 사이트를 포함합니다. 가장 중요한 것은, PRESTO-탱고는 스크리닝 능력과 실험 설계 측면에서 탱고 분석기를 능가합니다. 약 300GPCRs의 4배 샘플 테스트는 8개의 384웰 플레이트에서만 수행되며, 음의 배경 제어 및 형질 감염 효율을 모니터링하는 포지티브 컨트롤을 고려합니다. PRESTO-Tango는 GPCR-ome을 하나의 관심 화합물로 스크리닝하는 데 적합하지만, 여러 리간드를 사용한 심문은 다양한 화학 적 실체의 혼합물로 구성된 풀링 또는 배열된 소분자 화합물 라이브러리 또는 생물학적 샘플과 같이 증가된 비용과 자원 사용에도 불구하고 수행될 수 있습니다. 부여, 이 문제는 문제의 화합물 라이브러리의 화학적 유사성 및 다양성 분석을 수행하여 심문하는 화합물의 수를 감소시킴으로써 완화 될 수있다. PRESTO-Tango 플랫폼은 1차 스크리닝 용도에 더 적합하지만, 이차 프로파일링은 중간 또는 낮은 처리량 형식으로 더 작은 규모로 수행하여 리간드 자극의 기능적 결과를 확인할 수 있습니다. 그러나, 다른 모든 GPCR 분석과 마찬가지로, 탱고 분석으로 이차 스크리닝 동안 고아 수용체에 대한 적절한 양성 대조구가 없다는 것을 인정해야합니다. 그럼에도 불구하고, 출력 데이터가 계산된 신호 창 및 EC50 값을 가진 sigmoidal 복용량 응답 곡선에 장착될 수 있는 경우에 잠재적인 포지티브 히트를 식별할 수 있습니다. 또한 리간드 활성의 메커니즘, 고아 또는 비 고아 수용체에 대한, 병렬 분석기를 실행하지 않고 해명 할 수 없다는 것을 주의하는 것이 중요하다.
HTLA 세포주 및 GPCR 탱고 구셈을 포함하여 PRESTO-Tango의 모든 성분이 이미 최적화되어 있기 때문에 약물 자극에 사용할 화합물 제형의 선택 외에는 약간의 변형 공간이 필요합니다. 원하는 경우, 수용체를 안정적으로 발현하는 HTLA 세포주들은 상기 GPCR-탱고 수용체를 권장하는 pIRESbleo3 벡터(Clonetech) 내에서 복제하고, 제오신을 이용한 클론을 선택함으로써 용이하게 생성될 수 있다. pcDNA3.1에서 pIRESbleo3로의 스왑과 관련하여, 단순히 NOTI 및 XbaI로 GPCR 탱고 구성을 소화하고 제한 사이트 NotI 및 NheI에서 대상 벡터에 삽입하십시오. 그럼에도 불구하고 이 기술을 적용하고 최적화할 수 있는 방법이 있습니다. 이 기술의 기둥 중 하나는 HTLA 세포, β-arrestin2-TEV 융합 유전자를 안정적으로 발현하는 HEK293T 세포주 및 tTA 의존성 루시퍼라제 리포터이며, 리처드 악셀의 실험실에서 정중하게 공급된다. PRESTO 탱고의 중요한 분대 동안, 세포주 기원, 또는 그(것)들이 표현하는 유전자의 관점에서 그밖 대안은 현재 없습니다. 더욱이, 미래 공학된 세포주는 β-arrestin2 외에 다른 단백질을 추적하기 위해 다른 TEV 융합 유전자를 발현하기 위해 생성될 수 있으며, 특히 이전에 GPCRs에 거주하거나 14-3-322,SAP9723및 β-arrestin1과 같이 상호 작용하거나 발견된 것으로 나타난 유전자는 비시각 체포2의 보다 널리 퍼진 이소폼인 비-시각 체포2를 생성할 수있다. 이는 전적으로 tetO7 프로모터에 의해 조절되는 루시퍼라제 리포터를 함유한 부모HTL 세포를 사용하여 달성될 수 있다. PRESTO-탱고에 대한 한 가지 제한사항은 리포터 프로모터의 비특이적 활성화이다. 테트라사이클린 의존적 규제 시스템(tet system)에 기초하여, 테트라사이클린 반응성 요소(TRE)는 다운스트림 루시퍼라아제 리포터의 발현을 제어한다. 그러나, 이전 연구는 내인성 전사 인자25,26으로인한 루시퍼라아제의 "새는" 발현을 입증했다. 그 결과, 일부 화합물은 β-arrestin2 모집 또는 GPCR 활성화와 독립적으로 리포터를 활성화할 수 있으며, 거짓 긍정의 수를 증가시킬 수 있었다. 다른 HTS 방법에 공통적으로 나타나는 또 다른 문제는 여러 표적27에서실질적인 반응을 자극하는 "빈번한 타자", 난잡한 화합물이다. 그럼에도 불구하고 PRESTO-Tango의 병렬 스크리닝 설정은 이러한 유물의 식별을 용이하게 하며, 이는 루시퍼라아제 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해 추가로 테스트할 수 있습니다. 전부, PRESTO-탱고는 GPCRs에 체포 모집의 연구를 위한 견고한 기초를 제공하고 있습니다, 그리고 약 발견의 더 큰 계획에서, 활용GPCR 리간드 검열 및 탈판화 공구로.
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Disclosures
authours는 경쟁적인 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 건강 연구의 캐나다 학회에 의해 지원되었다 (CIHR 교부금 #MOP142219).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile | NUNC | 12-566 | |
| 384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile | NUNC | 12-566-1 | |
| 384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid | ThermoFisher | 12-565-390 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Wisent | 450-115-EL | |
| D-Luciferin, sodium salt | GoldBio | LUCNA | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15–300 µL | Eppendorf | 4861000155 | |
| Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5–100 µL | Eppendorf | 4861000139 | |
| Matrix Platemate 2x3 | ThermoFisher | 801-10001 | |
| MicroBeta 1450 Wallac | Perkin Elmer | ||
| Penicilin-Streptomycin | Wisent | 450-201-EL | |
| Poly-L-Lysine hydrobromide | Millipore-Sigma | P2636-500MG | |
| Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit | Addgene | Kit #1000000068 |
References
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