Summary
Nous présentons un modèle murin d’induction de mort de cerveau afin d’évaluer l’influence de ses effets pathophysiologiques sur des organes aussi bien que sur des greffes consécutives dans le contexte de la transplantation d’organe solide.
Abstract
Bien que le don vivant et le don après la mort circulatoire offrent d’autres possibilités de transplantation d’organes, le don après la mort cérébrale du donneur (BD) représente toujours la principale source de transplantations solides. Malheureusement, la perte irréversible de la fonction cérébrale est connue pour induire de multiples changements pathophysiologiques, y compris les modifications hémodynamiques ainsi que hormonales, conduisant finalement à une réponse inflammatoire systémique. Les modèles qui permettent une étude systématique de ces effets in vivo sont rares. Nous présentons un modèle murin d’induction de BD, qui pourrait aider à enquêter sur les effets dévastateurs de BD sur la qualité d’allogreffe. Après la mise en œuvre de la mesure de la pression artérielle intra-artérielle par l’intermédiaire de l’artère carotide commune et de la ventilation fiable par l’intermédiaire d’une trachéotomie, BD est induite par une augmentation constante de la pression intracrânienne à l’aide d’un cathéter ballon. Quatre heures après l’induction de BD, les organes peuvent être récoltés pour l’analyse ou pour d’autres procédures de transplantation. Notre stratégie permet l’analyse complète de la BD du donneur dans un modèle murin, permettant ainsi une compréhension approfondie des effets liés à la BD dans la transplantation d’organes solides et ouvrant potentiellement la voie à un préconditionnement optimisé des organes.
Introduction
La transplantation est actuellement le seul traitement curatif pour l’échec d’organe de phase finale. Jusqu’à présent, les patients atteints de décès du cerveau (BD) ont été la principale source de dons d’organes, bien que le don et le don vivant après la mort circulatoire soient des alternatives précieuses1. BD est défini par un coma irréversible (avec une cause connue), l’absence de réflexes de tige de cerveau et l’apnée2. Malheureusement, les organes de BD démontrent des résultats inférieurs dans la survie à long terme de greffe indépendamment de l’antigène leucocyte humain (HLA)-décalage et temps ischémique froid3. Pendant ce temps, des recherches intensives sur ce facteur de risque antigène-indépendant ont été effectuées ayant pour résultat trois aspects principaux des changements pathophysiologiques négociés à la suite de BD: hémodynamique, hormonale, et inflammatoire4.
À ce jour, des modèles expérimentaux de BD chez les rongeurs ont été principalement exécutés à l’aide de rats. Afin d’obtenir une meilleure compréhension des conséquences immunologiques sur les organes solides suivant BD, nous avons cherché à établir un modèle murin de BD, car actuellement seuls les modèles de souris permettent des études complètes sur les facteurs génétiques ou immunologiques. Dans ce contexte, le système de souris fournit une plus grande variété d’outils analytiques.
Le principe de l’induction BD tel que décrit ici est basé sur une augmentation de la pression intracrânienne induite par l’inflation d’un cathéter ballon inséré sous le crâne. Une pression intracrânienne accrue imite le mécanisme physiologique de la BD en bloquant la perfusion du crérebrum, du cervelet et du tronc cérébral5,,6. Pour garantir une perfusion suffisante des organes périphériques, la mesure de la pression artérielle est obligatoire pendant la procédure. Le cathéter utilisé à cette fin sert en même temps à l’administration saline afin de stabiliser la pression artérielle par substitution de liquide. Comme BD est accompagné d’arrêt de la respiration spontanée, une ventilation suffisante doit être assurée. Une couverture électrique maintient la température corporelle physiologique du noyau.
En résumé, ce modèle permettra des études approfondies sur l’influence des dommages induits par le BD, sur la migration de leucocyte7, l’activation de compliment8, la blessure de réperfusion ischémique9, et d’autres facteurs.
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Protocol
Des expériences sur les animaux ont été réalisées conformément aux Principes de soins aux animaux de laboratoire formulés par la National Society for Medical Research et le Guide for the Care and Use of Laboratory Animals préparés par l’Académie nationale des sciences et publiés par les National Institutes of Health (NiH Publication no 86-23, révisé en 1985). Toutes les expériences ont été approuvées par le Ministère autrichien de l’éducation, de la science et de la culture (BMWF-66.011/0071-II/3b/2012).
1. Cathétérisme artérielle
- Anesthésiez la souris avec une injection intraperitonéale de kétamine et de xylazine10 et un analgésique selon la pratique locale (par exemple la buprénorphine). Pincer les membres postérieurs avec des forceps pour confirmer la profondeur correcte de l’anesthésie.
REMARQUE : Pour cette étude, des souris mâles de C57BL/6N à l’âge de 8 à 12 semaines ont été employées (poids 20-25 g). Les auteurs ont testé le MÂLE BALB/c du même âge sans succès, mais n’ont pas essayé d’autres souches (voir Discussion). - Retirer les cheveux dans les régions d’intérêt (tête, cou) à l’aide d’un rasoir électrique. Assurez-vous qu’il n’y a plus de cheveux lâches pour prévenir la contamination des plaies. Par la suite désinfecter le champ chirurgical avec 70% d’éthanol/chlorhexidine/ bêtadine et placer la souris supine avec la tête face au chirurgien.
- Faire une incision cervicale de milieu de ligne avec des ciseaux disséquants.
- Disséquez les glandes sous-consommées et le tissu musculaire du cou et séparez-les afin d’exposer l’artère carotide commune. Utilisez surtout la dissection émoussée par le forceps.
- Placez trois 8-0 ligatures de soie sous l’artère carotide commune droite.
- Placez une pince sur la ligature proximal et apportez la tension dans l’artère de sorte que le flux est suspendu.
- Fermez la ligature la plus distale.
- Insérez le cathéter artériel à travers un petit trou de peau préformé sur l’aspect crânien de l’incision. Presser et déformer le lumen du cathéter s’il semble trop grand pour réduire le flux sanguin. Fixez avec les trois ligatures.
- Fixer le cathéter à la peau pour éviter la dislocation. Faites-le en utilisant une suture (p. ex. 5-0 monofilament, non absorbable) qui relie le cathéter à la peau dans la zone du trou de peau préformé.
2. Trachéostomie
- Disséquez la musculature pré-trachéale à l’aide de forceps.
- Place deux 8-0 ligatures de soie sous la trachée.
- Trachéotomiser à l’aide de micro ciseaux aussi proximally que possible pour éviter une ventilation unilatérale. Utilisez une ligne de coupe horizontale entre deux cartilages trachéaux.
- Insérez le tube de ventilation et fixez-les avec les deux ligatures préparées.
REMARQUE : L’extrémité proximale de la trachée n’a pas besoin d’être ligate. - Fermez la peau avec une suture en cours d’exécution (p. ex., 6-0 monofilament, non absorbable).
- Ventiler la souris avec une fréquence de 150/min et un volume de marée de 200 ll.
3. Induction de mort cérébrale
- Disposer la souris à la position encline.
- Retirez la peau du crâne à l’aide de ciseaux chirurgicaux et de forceps pour tenir la peau.
- Percer un trou de forage de calibre 1 mm paramédicalement au-dessus du cortex pariétal gauche. Arrêtez de forer avant de percer l’os compact intérieur et le mater dura.
- Pénétrer le pont de tissu final du crâne à l’aide de forceps émoussés, en enlevant les bords tranchants.
- Insérez le cathéter de ballon, de sorte qu’il soit entièrement dans la cavité crânienne. Assurez-vous que le ballon est préremmité avec saline et tout l’air est évacué.
- Commencer l’inflation à 0,1 mL/min sur une période de 10 à 15 min (volume total de 0,8 à 1,2 ml) à l’aide d’une pompe à seringue.
REMARQUE : La souris exposera le myoclonus, la mydriasis, l’activité de saisie et les halètements agonals. - Prononcez le cerveau de la souris mort une fois que la queue de la souris est devenue raide et érigée.
REMARQUE : BD est confirmé par un pic de tension artérielle initial caractéristique (réflexe de crachage), l’absence de réflexes de tige de cerveau et de respiration spontanée. Les tests réguliers d’apnée doivent être évités pendant les expériences, car les souris peuvent devenir instables circulatoires en raison d’un manque d’oxygène. - Arrêtez l’inflation du cathéter ballon.
- Placez une couverture chauffante sur la souris pour éviter l’hypothermie.
4. Pendant la période BD
- Surveillez et documentez régulièrement la tension artérielle. Exclure les souris avec une phase hypotensive prolongée (pression artérielle moyenne [MAP] 'lt; 50 mmHg pour 'gt;30 min).
- Infuser 0,1 mL de saline toutes les 30 minutes pour stabiliser la pression artérielle de la souris.
REMARQUE : Au total, 0,8 ml de saline a été administrée à chaque souris dans cette étude. - Après 4 h de durée BD, récoltez des organes/tissus de souris. Exclure la souris de l’expérience si le cœur de la souris ne bat pas à la fin de l’expérience.
5. Procédure Sham
- Effectuer les étapes 1.1-3.3.
REMARQUE : N’ouvrez pas l’os compact intérieur. N’insérez pas ou ne gonflez pas un cathéter ballon. - Restez près de la souris et observez continuellement l’animal. Pincer à plusieurs reprises les membres postérieurs avec des forceps pour confirmer la profondeur correcte de l’anesthésie. Appliquer une anesthésie supplémentaire sous-cutanée (environ 1/2 de la dose de départ) si la souris montre des signes d’éveil, qui, selon notre expérience, se produit environ après 2-3 h post-anesthésie.
- Appliquer la même quantité de saline intraveineuse que chez les souris BD.
REMARQUE : La fausse souris retrouvera la respiration spontanée après l’arrêt de la ventilation. La souris BD ne le fera pas. Les tests d’apnée doivent être effectués lors de l’établissement du modèle, mais pendant les expériences, il doit être évité en raison d’un stress physiologique inutile.
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Representative Results
Le modèle murine BD a été réalisé avec succès plus de 100 fois avec un taux de réussite de plus de 90%. En outre, la transplantation d’organes post-interventionnels du cœur et du rein a été exécutée en toute sécurité7.
BD induit une variété de changements pathophysiologiques qui peuvent être étudiés plus en plus loin en utilisant ce modèle. Comme le montre la figure 1, la pression artérielle montre un pic hypertendu initial suivi d’une phase hypotensive prolongée. Pour éviter les effets physiologiques néfastes de l’hypotension, les souris avec une pression artérielle insuffisante prolongée (MAP 'lt; 50 mmHg pendant plus de 30 min) ont été exclues.
Une autre observation bien établie est que l’induction de BD mène à l’activation du système immunitaire. Après 4 h de la durée BD augmentation spécifique à l’organe des marqueurs immunitaires au niveau de l’ARNm(figure 2) ainsi que la migration des cellules immunitaires a été observée7.
Figure 1 : Mesure invasive de la pression artérielle moyenne (MAP) suivant l’induction de BD ou la procédure de faux. Au moment où l’induction de BD, la pression artérielle était significativement plus élevée chez les animaux BD (carrés blancs) que chez les animaux fictifs (carrés noirs) qui est expliquée par la tempête de cytokine bien décrite; par la suite, la normalisation des niveaux de pression artérielle est devenue évidente suivie d’une période de baisse des niveaux de pression à partir de 90 min d’induction de BD (n - 19 animaux/groupe - SD). Des différences statistiquement significatives ont été testées avec aNOVA bidirectionnel et le bonferroni après le test; Pp 'lt; 0.01,'p 'lt; 0.001. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : L’induction de BD active le système immunitaire et cause des dommages directs aux organes avant la transplantation. Nous montrons des résultats représentatifs du récepteur 1 déclencheur naturel de cytotoxicité (NCR1 aussi NK-p46), qui augmente dans les reins en conséquence de BD au niveau de l’ARNm. Aucun changement n’a été observé dans les foies ou les cœurs. Les données sont présentées comme moyennes ' SE de n '7'8 animaux/groupe. Des différences statistiquement significatives entre BD et sham ont été testées à l’aide du test anti-mann-Whitney; pp 0,0037. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
BD, un facteur de risque pour la qualité d’allogreffe chez les donneurs multi-organes, implique une pléthore de changements pathophysiologiques, qui ne peuvent être suffisamment évalués qu’à l’aide de modèles in vivo. Les changements hémodynamiques, la tempête de cytokine, les changements hormonaux et leur impact ultime sur la qualité et la survie de greffe d’organe ne peuvent pas être analysés in vitro4. La majorité de la transplantation de base ainsi que la recherche immunologique dépend des outils diagnostiques sophistiqués, qui ne sont largement disponibles que dans les modèles de souris. Modèles de souris ont déjà conduit à une variété de nouvelles idées dans la recherche liée à BD7,8,9.
Alors qu’au XXe siècle, les premiers modèles de recherche BD ont été développés chez les babouins, les chiens et les porcs11,12, ce n’est qu’en 1996 que le premier modèle de rat a été décrit13. Il a fallu encore 14 ans jusqu’à ce qu’un modèle murin de BD a été publié pour la première fois par le groupe de Vienne en 20106. Bien que chaque étape individuelle ne soit pas difficile pour un microchirurgien formé, le modèle décrit ici demeure fragile et peut prendre quelques semaines à s’établir.
Les étapes critiques de ce protocole sont les suivantes. Utilisez des éléments jetables stériles (en particulier le cathéter artériel et les tubes de connexion) pour éviter une stimulation immunitaire non désirée. Évitez toute perte de sang que la phase hypotensive peut devenir incontrôlable. Utilisez de petites canules pour la mesure de la pression artérielle ou réduisez les lumen pour éviter le reflux sanguin. Fixer le tube de ventilation ainsi que la canule artérielle pour éviter la dislocation lors de la rotation de la souris ou pendant l’activité de saisie. Le forage ne doit pas être tranchant et ne doit pas être trop grand. Le cathéter ballon doit être en contact avec le trou de forage. Sinon, le tissu cérébral peut dépasser et entraver l’élévation prévue dans la pression intra-crânienne. Pendant la période BD, administrer le liquide intraveineux régulièrement. Si les souris deviennent hypotendues trop tôt dans le processus (MAP 'lt; 50 mmHg après 2-3 h), la réanimation liquide supplémentaire est peu susceptible de fournir un entretien soutenu de la pression artérielle.
La plupart des problèmes se sont produits pendant l’induction de BD par l’intermédiaire du cathéter de ballon lui-même ou sont devenus évidents au cours de la période BD. Le point final commun de toutes les inexactitudes sera l’hypotension malgré l’administration fluide. Selon la stabilité de la pression artérielle, la durée BD peut être prolongée ou raccourcie. Dans la littérature, différentes périodes allant de 3 à 6 h ont été mises enœuvre 6,7,8. Le succès de l’induction BD peut également varier entre les différentes souches de souris. Bien que les variantes anatomiques entre les souches de souris devraient être limitées, nous n’avons pas été en mesure d’établir le même modèle chez les souris BALB/c. Bien que l’effort a été limité à seulement quelques souris et aucune autre souche n’a été testée, nous recommandons l’utilisation de C57BL/6, qui a été utilisé dans la plupart des recherches précédentes8,9. Les auteurs n’ont aucune explication satisfaisante pourquoi le modèle n’a pas fonctionné dans la souche BALB/c. Une seule publication a jusqu’à présent démontré un modèle BD utilisant de grandes (35 g) femelles of-1 souris6.
En résumé, le modèle de souris décrit ici représente un outil précieux pour étudier une multitude de changements pathophysiologiques causés par BD. Bien que difficile, le modèle peut être optimisé dans un délai raisonnable et effectué d’une manière normalisée avec un taux de réussite élevé.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
N.a.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arterial catheter (BD Neoflon 26G) | BD | 391349 | |
| Blood Pressure Transducers (APT300) | Harvard Apparatus Inc. | 73-3862 | |
| Fogarty Arterial Embolectomy Catheter N° 3 | Edwards Lifesciences Corporation | 120403F | |
| Forceps | FST | 11271-30 | |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus Inc. | 55-7020 | |
| Ketansol | Graeub | 6680110 | |
| Micro scissor | FST | 15018-10 | |
| Needle holder | FST | 12060-02 | |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8698H | |
| Pump 11 Elite Infusion Only Single | Harvard Apparatus Inc. | 70-4500 | |
| Scissor | FST | 14075-11 | |
| Stereotactic microscope | Olympus | SZX7 | |
| Transpore Tape | 3M | 1527-1 | |
| Underpads | Molinea.A | 274301 | |
| Ventilator for mice (MiniVent Model 845) | Harvard Apparatus Inc. | 73-0043 | |
| Xylasol | Graeub | 7630109 |
References
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