Bu protokolün amacı, fare derisinde öldürücü olmayan seviyelerde reaktif oksijen türlerinin (ROS) geçici in vivo üretimini indüklemek ve dokudaki fizyolojik tepkileri daha da teşvik etmektir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare Derisinde Kök Hücre Nişlerinin Uyarılması ve Doku Rejenerasyonu, Değiştirilebilir Protoporfirin IX'a Bağlı Reaktif Oksijen Türlerinin Fotojenerasyonu ile Yerinde
Bu makalede
Özet
Özet
Burada, fare derisinde endojen reaktif oksijen türlerinin (ROS) değiştirilebilir in vivo fotojenerasyonunu indüklemek için bir protokol açıklıyoruz. Bu geçici ROS in situ üretimi, kök hücre nişlerinde hücre proliferasyonunu etkili bir şekilde aktive eder ve yanık iyileşmesinin ve saç folikülü büyüme süreçlerinin hızlanmasıyla güçlü bir şekilde ortaya çıktığı gibi doku yenilenmesini uyarır. Protokol, dokuyu endojen ışığa duyarlılaştırıcı protoporfirin IX'un öncülleri ile tedavi eden ve ayrıca sıkı bir şekilde kontrol edilen fizikokimyasal parametreler altında dokuyu kırmızı ışıkla ışınlayan düzenlenebilir bir fotodinamik tedaviye dayanmaktadır. Genel olarak, bu protokol ROS biyolojisini analiz etmek için ilginç bir deneysel araç oluşturmaktadır.
Giriş
Reaktif oksijen türleri (ROS), moleküler oksijenin su oluşturmak üzere kimyasal indirgenmesinin sonucudur ve singlet oksijen, süperoksit anyonu, hidrojen peroksit ve hidroksil radikali 1,2,3'ü içerir. ROS, son derece kimyasal reaktif yapıları nedeniyle çok kısa bir ömre sahiptir. Aerobik organizmalarda, ROS, mitokondrideki aerobik solunumun (elektron taşıma zinciri) önemli bir sızdıran yan ürünü olarak hücrelerin içinde tesadüfen oluşur. Hücrede yüksek seviyelerde ROS'un geçici olarak birikmesi, proteinlerin, lipitlerin ve şekerlerin geri dönüşümsüz inaktivasyonunu ve DNA mol....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm fare yetiştiriciliği ve deney prosedürleri, hayvan deneyleri ile ilgili yerel, ulusal, uluslararası mevzuat ve yönergelere uygun olarak yürütülmelidir.
1. Saç büyümesinin indüksiyonu, yanık indüksiyonu ve kuyruk derisi epitelindeki uzun süreli BrdU LRC'lerin tanımlanması
NOT: Aşağıda açıklanan deneysel tasarımlar için 10 günlük veya 7 haftalık C57BL/6 fareler, tercihen yavrular kullanın. Tüm deneysel prosedürlerde, hayvanlar% 3 izofluran inhalasyonu ile uyuşturulacak veya belirtildiği gibi servikal çıkık ile ötenazi yapılacaktır.
- İkinci telojen (dinlenme) fazında farelerin arka derisinde saç büyümes....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Fare sırt ve kuyruk derisinde mALA öncüsünün topikal uygulaması, bu bileşiğin mavi ışık (407 nm) uyarımı altında kırmızımsı-pembe floresansı ile gösterildiği gibi, tüm dokuda ve belirgin şekilde kıl folikülünde önemli bir PpIX birikimine neden olur (Şekil 2A, C). Tedavi edilen dokunun daha sonra kırmızı ışıkla (636 nm) 2.5−4 J /cm2'lik bir akıcılıkta ışınlanması, dokuda, özellikle saç folikülünün şişkin bölgesinde geçici ROS üretimini teşvik eder (
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada, fare derisinde fizyolojik etkilerle in vivo endojen ROS üretiminin geçici aktivasyonuna izin veren bir metodoloji sunuyoruz. Metodoloji, endojen ışığa duyarlılaştırıcı PpIX'in kontrollü ve lokal bir stimülasyonunu indüklemek için fotodinamik bir prosedüre dayanmaktadır (Şekil 1B). Bu deneysel yaklaşım, ROS biyolojisini in vivo deneysel sistemlerde incelemek için ilginç bir araçtır ve harici ROS kaynakları (genellikle hidrojen peroksit) kullanan metodolojiler üzerinde önemli bir ilerl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Bu çalışmada açıklanan prosedürlerin tüm ticari uygulamaları, EC, MIC ve JE tarafından yazılan ve ticari kullanım için Derma Innovate SL'ye lisanslanan bir CSIC-UAM patenti (EP2932967A1) ile korunmaktadır. JE ve JJM, Derma Innovate SL'de danışmanlık pozisyonuna sahiptir.
Teşekkürler
Bu çalışma, İspanya'dan Ministerio de Economía y Competitividad (RTC-2014-2626-1'den JE'ye) ve Instituto de Salud Carlos III (PI15/01458'den JE'ye) tarafından verilen hibelerle desteklenmiştir. EC, Atracción de Talento Investigador hibesi 2017-T2/BMD-5766 (Comunidad de Madrid ve UAM) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2′,7′-Diklorofloresan diasetat | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
| 5'-bromo-2'-deoksiuridin | Sigma Aldrich | B5002-500MG | |
| Anti-Bromodeoksiüridin-Floresein | Roche | 11202693001 | |
| Tüy dökücü krem (örn., Veet) | Veet | ||
| Dihidroetidyum | Sigma Aldrich | 37291-25MG | |
| In Vivo görüntüleme sistemi, örneğin, topikal krem şeklinde IVIS Lumina 2 | Perkin Elmer | ||
| mALA, örneğin, METVIX Crema 160 mg/g | Galderma | ||
| Power enerji ölçer (örneğin, ThorLabs Model PM100D) | ThorLabs | ||
| Kırmızı ışık kaynağı, örneğin, 636 nm Aktilite LED lamba | Photocure ASA |
Kaynaklar
- Blázquez-Castro, A. Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology. Redox Biology. 13, 39-59 (2017).
- Valko, M., et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Th....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
