Summary
De opsono-therapietrouwtest is een alternatieve methode voor de opsono-fagocytische moordtest om de opsonische functies van antilichamen in de ontwikkeling van vaccins te evalueren.
Abstract
De opsono-therapietrouwtest is een functionele test die de aanhechting van bacteriële pathogenen aan professionele fagocyten opsomt. Omdat therapietrouw noodzakelijk is voor fagocytose en doden, is de test een alternatieve methode voor opsono-fagocytische moordtests. Een voordeel van de opsono-adherence-test is de optie om geïnactiveerde pathogenen en zoogdiercellijnen te gebruiken, waardoor standaardisatie in meerdere experimenten mogelijk is. Het gebruik van een geïnactiveerde ziekteverwekker in de test vergemakkelijkt ook het werken met bioveiligheidsniveau 3 infectieuze agentia en andere virulente pathogenen. In ons werk werd de opsono-therapietrouwtest gebruikt om het functionele vermogen van antilichamen te beoordelen, van sera van dieren die zijn geïmmuniseerd met een vaccin op basis van miltvuurcapsules, om hechting van vaste Bacillus-antracis aan een muismacrofaagcellijn, RAW 264.7, te induceren. Geautomatiseerde fluorescentiemicroscopie werd gebruikt om beelden vast te leggen van bacillen die zich aan macrofagen hechten. Verhoogde therapietrouw was gecorreleerd met de aanwezigheid van anti-capsule antilichamen in het serum. Niet-menselijke primaten die hoge serum anti-capsule antilichaamconcentraties vertoonden, werden beschermd tegen miltvuuruitdaging. Zo kan de opsono-therapietrouwtest worden gebruikt om de biologische functies van antigeenspecifieke antilichamen in sera op te helderen, om de werkzaamheid van vaccinkandidaten en andere therapeutische middelen te evalueren en om te dienen als een mogelijke correlaat van immuniteit.
Introduction
Herkenning, therapietrouw, internalisering en afbraak van een ziekteverwekker zijn integraal onderdeel van fagocytose1, een saillant pad in de gastheer aangeboren immuunrespons die voor het eerst werd beschreven door Ilya Metchnikoff in 18832,3. Fagocytische leukocyten, evenals andere cellen van het immuunsysteem, zijn zeer discriminerend in hun selectie van doelen; zij zijn in staat onderscheid te maken tussen "infectieuze niet-zelf" en "niet-infectieuze zelf" door middel van pathogene geassocieerde moleculaire patronen door hun repertoire van patroonherkenningsreceptoren (PRR's)4,5. Gastheerherkenning van een ziekteverwekker kan ook optreden met de binding van gastheeropsonines, zoals complement en antilichamen6. Dit proces, opsonisatie genaamd, bedekt de ziekteverwekker met deze moleculen en verbetert de internalisatie bij binding aan opsonische receptoren (bijv. complement- en Fc-receptoren) op fagocytische cellen6. Om een ziekteverwekker zich aan een fagocyten te laten hechten, is collectieve binding van meerdere receptoren met hun cognate liganden noodzakelijk. Alleen dan kan aanhankelijkheid cascades in de hostcel activeren en ondersteunen om internalisatie te starten6.
Vanwege het belang van fagocytose bij het opruimen van pathogenen en het voorkomen van infectie, hebben extracellulaire pathogenen tal van manieren ontwikkeld om dit proces te ondermijnen om hun overleving te verlengen. Een strategie van belang is de productie van een anionische polymere (bijv. polysacharide of polyaminozuur) capsule die anti-fagocytisch is vanwege zijn lading, slecht immunogeen is en moleculen op de bacteriële envelop afschermt van PRR 's6,7. Pathogenen zoals Cryptococcus neoformans en Streptococcus pneumoniae hebben capsules die zijn samengesteld uit saccharidepolymeren, terwijl Staphylococcus epidermidis en sommige Bacillus-soorten poly-ɣ-glutaminezuur (PGGA)7,8produceren . Maar andere ziekteverwekkers produceren capsules die lijken op het niet-infectieuze zelf. Streptococcus pyogenes en een pathogene stam van B. cereus hebben bijvoorbeeld een hyaluronzuurcapsule die niet alleen anti-fagocytisch is, maar die ook niet als vreemd kan worden herkend door het immuunsysteem9,10.
Vervoeging van capsule naar dragereiwitten zet ze om van arme, T-onafhankelijke antigenen in zeer immunogene T-afhankelijke antigenen die hoge serumanticapsuleantilichaamtiters kunnen induceren11,12. Deze strategie wordt gebruikt voor gelicentieerde vaccins tegen S. pneumoniae, Haemophilus influenzaeen Neisseria meningitides11. De opsonische activiteiten van anticapsuleantilichamen zijn gewoonlijk geëvalueerd door opsono-fagocytische moordtests (OPKA)13,14,15,16. Deze tests testen of functionele antilichamen fagocytose en doden kunnen veroorzaken14. Het gebruik van OPKA met infectieuze pathogenen, zoals Tier 1 Biological Select Agents and Toxins (BSAT), waaronder B. anthracis17,is echter gevaarlijk en brengt veiligheidsrisico's met zich mee; deze tests vereisen een uitgebreide behandeling van een selecte agent. Het hanteren van bepaalde agenten kan alleen worden uitgevoerd in beperkte bioveiligheidsniveau 3 (BSL-3) laboratoria; het werk in deze gebieden vereist langdurige operationele procedures vanwege de vele veiligheidsmaatregelen die moeten worden gevolgd. BSL-3 laboratoria zijn ook meestal niet uitgerust met de gespecialiseerde apparatuur die wordt gebruikt voor OPKA-werk, zoals microscopen en cytometers. Zo ontwikkelden we een alternatieve test op basis van het gebruik van geïnactiveerde bacteriën18,19. We noemen dit een opsono-adherence assay (OAA) die niet afhankelijk is van internalisatie en doden als testoutputs; in plaats daarvan wordt therapietrouw van geïnactiveerde geïnactiveerde pathogenen gebruikt als een index van fagocytose. Mechanistisch gezien is OAA een geschikt substituut omdat therapietrouw a priori optreedt en nauw verweven is met internalisatie en intracellulair doden. Vanuit bioveiligheidsperspectief heeft OAA de voorkeur omdat het een minimale behandeling van een infectieus agens vereist, experimenteel van kortere duur is dan OPKA en kan worden uitgevoerd in BSL-2-laboratoria nadat een voorraad van de geïnactiveerde ziekteverwekker is geproduceerd en overgedragen.
We demonstreren het gebruik van OAA om de opsonische functie van anticapsuleantilichamen te onderzoeken die worden aangetroffen in sera van niet-menselijke primaten (NHP's) gevaccineerd met een capsuleconjugaat [d.w.z. PGGA van B. anthracis geconjugeerd aan het buitenste membraaneiwitcomplex (OMPC) van Neisseria meningitides]20. Serum opsonized bacillen werden geïncubeerd met een aanhankelijkheid muis macrofaag cellijn, RAW 264.7. Na fixatie werden de celmonolaag en aanhankelijke bacillen in beeld gesteld door fluorescentiemicroscopie. Bacteriële hechting nam toe toen de bacillen werden geïncubeerd met serum van NHP's gevaccineerd met de capsuleconjugaat in vergelijking met controleserum20. Therapietrouw gecorreleerd met survival of the anthrax challenge20,21. Zo kenmerkte het gebruik van OAA de functie van anticapsuleantilichamen en vergemakkelijkte het testen van onze vaccinkandidaat aanzienlijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In overeenstemming met de Dierenwelzijnswet, het beleid van de Openbare Gezondheidsdienst en andere federale wet- en regelgeving met betrekking tot dieren en dierproeven, werd het hier beschreven onderzoek uitgevoerd in het kader van een door de Institutional Animal Care and Use Committee goedgekeurd protocol. De faciliteit waar dit onderzoek is uitgevoerd is geaccrediteerd door de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International en houdt zich aan principes die zijn vermeld in de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, National Research Council, 201124.
1. Cultuur en onderhoud van de cellijn, RAW 264.7
OPMERKING: De volgende procedures moeten worden uitgevoerd met aseptische technieken.
- Verhit foetaal runderserum (FBS) gedurende 30 minuten in een waterbad van 56 °C om het complement te inactiveren.
OPMERKING: De inactiveringstijd van 30 min begint wanneer FBS 56 °C bereikt. Om de temperatuur te controleren, verwarmt u een vergelijkbaar volume water in een bekerglas in hetzelfde waterbad. Zodra het water 56 °C bereikt, begint u met het aftellen van 30 minuten voor FBS. Als alternatief is FBS dat warmte-geïnactiveerd is ook commercieel beschikbaar. - Bereid medium voor op RAW 264,7 cellen door 90% DMEM te combineren met hoge glucose en 10% warmte geïnactiveerde FBS (v/v). Voeg L-glutamine toe aan een uiteindelijke concentratie van 6 mM.
OPMERKING: DMEM met hoge glucose is geformuleerd met 4 mM L-glutamine. Het aanvullen van L-glutamine tot 6 mM bevordert consistente celgroei. 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine kunnen worden toegevoegd om besmetting te voorkomen. Een andere gemeenschappelijke murine cellijn, J774A.1, kan ook worden gebruikt en wordt gekweekt onder vergelijkbare omstandigheden. - Ontdooi een bevroren flesje cellen in een waterbad van 37 °C en haal het uit het bad zodra het smelt. Voeg inhoud aseptisch toe aan 5 ml compleet medium in een conische buis. Keer de conische buis twee keer om en draai gedurende 5 minuten met 300 x g naar pelletcellen.
- Aspirate medium met behulp van een steriele Pasteur pipet bevestigd aan een vacuüm om het vriesmiddel te verwijderen. Resuspend celkorrel in 5 ml vers medium.
- Breng suspensie over in een met weefselkweek behandelde kolf of schaal. Voeg voldoende medium toe om de bodem van de kolf volledig te bedekken en wervelen om cellen gelijkmatig te verdelen. Geef het passagenummer aan dat begint met "1".
- Incubeer cellen bij 37 °C in aanwezigheid van 5% CO2 en vochtigheid tot 95% tot 100% samenvloeiing wordt bereikt. Controleer dagelijks cellen onder de microscoop vanaf de tweede dag van incubatie. Laat de cellen niet >100% samenvloeiing bereiken, omdat dit ervoor zorgt dat de cellen opstijgen en afsterven.
OPMERKING: De tijd die nodig is om de samenvloeiing te bereiken, hangt af van het aantal levende cellen dat is verguld en het groeigebied van de kolf. Het is dus verstandig om de cellen dagelijks te controleren. - Subcultuurcellen door de celvoorraad in vers medium te schrapen en te verdunnen, waardoor ten minste twee dagen groei tussen schrapingen mogelijk is. Verhoog het passagenummer met 1 bij elke subcultuur.
OPMERKING: Het passeren en onmiddellijk schrapen de volgende dag zal resulteren in een sneller verlies van algemene celaanhanging in de loop van de tijd. RAW 264.7-cellen mogen alleen worden gebruikt tot ongeveer passage 15. - Om RAW 264.7-cellen te borduren voor de OAA-test, vervangt u deze door vers medium en gebruikt u een celschraper om cellen voorzichtig van de kolf te schrapen. Pipetteer op en neer om de celklompen op te breken voor gemakkelijker celtelling.
OPMERKING: De traditionele methode voor het subcultureren van RAW 264.7 is door schrapen. In onze ervaring zorgt het gebruik van trypsine ervoor dat RAW 264.7 cellen na verloop van tijd sneller hechting verliezen dan bij schrapen. - Als u cellen wilt tellen, verdunt u gelijke volumes cellen en probeert u een blauwe oplossing. Laad 10 μL op een hemocytometer. Observeer en tel het aantal levende cellen dat de kleurstof uitsluit met behulp van een omgekeerde samengestelde microscoop met een 10x objectieve lens.
- Plaat 1,4 x 104 levensvatbare cellen per put in een 96 put 0,15 μm dikke glazen platte bodemplaat (plaat #1). Laat cellen 3 dagen groeien. Vervang het verbruikte medium één dag voordat u OAA uitvoert.
OPMERKING: Na 3 dagen incubatie moet het aantal cellen ongeveer 5 x 104/well zijn.
2. Bacteriële cultuur en preparaten
OPMERKING: De bacteriesoort die in dit protocol wordt gebruikt, is een ingekapselde virulente stam, B. anthracis Ames. Alle manipulaties met deze soort vereisen passende bioveiligheids- en veiligheidsmachtigingen en moeten worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast van klasse II of klasse III in een BSL-3-laboratorium. Volg de institutionele werkingsprocedures voor BSL-3-werk en voor het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen bij het omgaan met bacteriën.
- Bereid brain heart infusie (BHI) bouillon voor door 37 g BHI-poeder op te lossen in 1 L water en autoclaaf bij 121 °C gedurende 15 minuten. Bewaar bouillon op omgevingstemperatuur.
- Bereid 8% natriumbicarbonaatoplossing in water en steriliseer met een filterspuit van 0,20 μm. Bewaar de oplossing bij 4 °C en gebruik deze binnen 1 dag.
- Meng 8 g voedingsbouillon, 3 g gistextract en 15 g agar in 1 L water om NBY-agarplaten te bereiden. Autoclaaf bij 121 °C gedurende 15 min. Giet in petrischaaltjes en laat stollen. Bewaar platen op 4 °C.
OPMERKING: NBY-agarplaten mogen worden gemaakt met of zonder natriumbicarbonaat. De toevoeging van natriumbicarbonaat aan bouillon en agarplaten induceert de groei van mucoïde kolonies bestaande uit ingekapselde bacillen. De uiteindelijke concentratie natriumbicarbonaat in zowel vloeibare als vaste media is 0,8%. - Bereid kweekbouillon voor B. anthracis door 50% autoclaved BHI bouillon, 40% FBS en 10% natriumbicarbonaatoplossing (v/v) te mengen.
OPMERKING: Deze bouillon is geformuleerd om korte ketens van ingekapselde bacillen te produceren. - Bereid een hoofdplaat van B. anthracis voor door deze te strepen voor isolatie op een NBY-agarplaat van een sporenbouillon een dag voordat je in bouillon cultivert. Incuberen bij 37 °C.
- Ent 30 ml kweekbouillon in een geventileerde kolf van 250 ml met verschillende kolonies B. anthracis.
OPMERKING: Een specifieke volume-oppervlakteverhouding van bouillon, zoals hier gespecificeerd, is nodig om maximaal ingekapselde bacillen te produceren. - Schud de bouillonkweek bij 125 tpm, 37 °C met 20% CO2 en vochtigheid gedurende 18-24 uur.
OPMERKING: Het kweken van B. antracis bij temperaturen van meer dan 37 °C kan de productie van capsules remmen. - Gebruik negatieve kleuring met India inkt om voldoende inkapseling te garanderen en dat bacillen in korte ketens (1–5 bacillen/ketting) zijn voorafgaand aan fixatie (zie rubriek 3).
- Om kolonievormende eenheden (CFU) te bepalen, verdunt u serieel 100 μL cultuur 1:10 in Fosfaat Gebufferde Zoutoplossing (PBS) oplossing en plaatkweekverdunningen op schapenbloed agarplaten. Incubeer gedurende 12-18 uur bij 37 °C. Tel CFUs en bepaal het aantal bacteriën per ml cultuur.
OPMERKING: Tellen kan ook met behulp van een hemocytometer onder de microscoop nadat de bacteriën zijn bevestigd. Dit wordt echter niet aanbevolen omdat de bacillen moeilijk te zien zijn onder lage vergroting. - Voeg 16% paraformaldehyde (PF) toe aan het volledige volume van de bacteriecultuur bij een uiteindelijke concentratie van 4% PF om de bacillen te fixeren. Roer langzaam op een shaker bij omgevingstemperatuur gedurende 7 dagen.
OPMERKING: Zeven dagen incubatie in 4% PF is gebaseerd op de usamriid institutionele standaard operationele procedure voor het bevestigen van vegetatieve bacillen. - Om het fixatief te verwijderen en te testen op steriliteit, wast u driemaal 4 ml (10% volume) vaste bacteriële suspensie in een conische buis van 50 ml door centrifugeren bij ≥3000 x g gedurende 45 minuten en met behulp van een 30 ml / was met PBS. Bewaar het resterende monster in 4% PF bij 4 °C.
OPMERKING: Na het pelleten is de bacteriële pellet pluizig vanwege de aanwezigheid van een capsule. Zorg ervoor dat u de pellet niet stoort tijdens het wassen. Het is noodzakelijk om alle fixatieven te verwijderen, zodat het de levensvatbaarheidstests niet verstoort. Verhoog indien nodig het aantal wasbeurten. - Voor levensvatbaarheidstests inent u 40 ml van een bacterieel groeimedium (bijv. BHI-bouillon) met 4 ml gewassen suspensie (≤ 10% bouillonvolume) en incubeert u gedurende 7 dagen bij 37 °C. Controleer de optische dichtheid bij 600 nm voor en na 7 dagen om troebelheid te meten.
- Na 7 dagen incubatie in bouilloncultuur, plaat ≥ 100 μL bouillon op een agarplaat en nog eens 7 dagen incuberen. Als er geen toename van troebelheid en geen groei op platen wordt gezien, wordt de oorspronkelijke cultuur als steriel beschouwd en kan deze worden overgebracht naar een BSL-2-laboratorium.
OPMERKING: Het Federal Select Agent Program22 mandateert dat geïnactiveerde B. antracis alleen kan worden overgedragen vanuit BSL-3-laboratoria na het aantonen van volledige steriliteit van het monster. Levensvatbaarheidstests voor geïnactiveerde B. anthracis bestaan uit het cultiveren van 10% van het monster in bouillon gedurende 7 dagen, gevolgd door cultiveren op vast medium gedurende nog eens 7 dagen22,23. Volg de institutionele richtlijnen om goedkeuring voor overdracht te ontvangen zodra de steriliteit is vastgesteld.
3. Negatieve kleuring en lichte microscopie om inkapseling en bacillenketens te observeren
- Meng 5 μL bacteriële suspensie met 2 μL India inkt op een microscoop dia. Plaats een 1 of 1,5 μm dik afdekglas op de ophanging zonder bellen te creëren.
OPMERKING: Nagellak kan worden gebruikt om het afdekglas op de glijbaan af te dichten. - Observeer de bacteriële suspensie met een 40x tot 100x olie objectieve lens op een lichtmicroscoop. Zorg ervoor dat de bacillen worden ingekapseld door een spelingszone (capsule sluit India-inkt uit) rond elke bacterie te observeren en dat de bacillenketens kort zijn.
4. FITC-etikettering van bacteriën
- Los fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) op in dimethylsulfoxide in een concentratie van 2 mg/ml.
- Meet het volume van geïnactiveerde bacteriële voorraad.
- Was de bouillon 3x in PBS om het fixatief te verwijderen.
- Voeg FITC-oplossing toe bij een uiteindelijke concentratie van 75 μg/ml. Roer het mengsel langzaam gedurende 18-24 uur bij 4 °C.
- Was de bacteriën driemaal door te pelleten op ≥3000 x g, 45 min en gebruik 30 ml PBS/wash om overtollige FITC te verwijderen. Zorg ervoor dat de pluizige pellet niet wordt verstoord tijdens het wassen. Resuspend de bacillen in PBS in hetzelfde startvolume.
- Aliquot en bewaar de bacillen in microbuisjes bij -20 °C tot gebruik. Vries/ontdooi bacillen niet meerdere keren, omdat de bacillen de capsule kunnen verliezen.
5. Bacteriële opsonisatie
- Warmte inactiveert een klein volume test sera (van NHP's) bij 56 °C gedurende 30 minuten in een hitteblok.
- Ontdooi en was FITC-gelabelde bacteriën met PBS 2x door 3-5 min. te pelleten op 15000 x g. Resuspend in PBS in hetzelfde startvolume.
- In een 96 goed ronde bodemplaat (plaat #2), serieel verdunde test sera in celmedium. Voeg in nog eens 96 goed ronde bodemplaat (plaat #3) 10 μL verdunde testsera toe aan elke put.
OPMERKING: In elke plaat werden PBS en normale apensera opgenomen in plaats van verdunde testsera als negatieve controles. We kozen ook één testserum als een positieve controle om een standaardcurve te genereren om alle tests op verschillende dagen te normaliseren. Het serum van de positieve controletest werd willekeurig gekozen omdat het overvloedig was. - Voeg #3 toe om 10 μL vers gereconstitueerde babykonijncomplement toe te voegen.
OPMERKING: Gooi de resterende babykonijncomplement na reconstitutie weg; niet opnieuw invriezen en ontdooien. - Om #3 te platen, voeg het juiste volume fitc-gelabelde bacillen toe voor een multipliciteit van infectie van 1:20. Voeg bijvoorbeeld het volume toe dat 5 x 104 x 20 bacillen bevat voor 5 x 104 cellen. Vul elke put af in plaat #3 met het juiste volume celmedium tot een totaal van 105 μL.
OPMERKING: Plaat #1, die cellen bevat, ontvangt 100 μL aan geïnsoniseerde bacteriën met de resterende 5 μL als leegtevolume. We hebben elke verdunning van de test sera in tweevoud getest. - Incubateer plaat #3 bij 37 °C gedurende 30 minuten in aanwezigheid van 5% CO 2 metvochtigheid om bacillen te optimaliseren.
6. Hechtingstest en fluorescerende etikettering van zoogdiercellen
- Onderhoud alle reagentia voor gebruik op 37 °C.
- Plaats plaat #1, die hechtcellen bevat, op een hitteblok van 37 °C.
- Gebruik een multichannel pipettor om verbruikt medium uit putten te verwijderen en snel te vervangen door 100 μL aan gesoniseerde bacteriën van plaat #3. Zorg ervoor dat er tijdens het pipetten geen bellen in de putten zijn gegenereerd. Incubatieplaat #1 bij 37 °C met 5% CO2 en vochtigheid gedurende 30 minuten voor hechting.
- Was elke put 5x met 150 μL PBS bovenop een hitteblok van 37 °C om niet-vastgemaakte bacillen te verwijderen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de cellen niet per ongeluk worden verspreid tijdens het wassen. - Verdun 16% PF met PBS 1:4 om 4% PF te maken. Fixeer cellen met 4% PF gedurende 1 uur door 150 μL aan elke put toe te voegen. Was cellen 2x met PBS.
- Meng 2 μL HCS (high-content screening) Orange Cell Stain in 10 ml PBS. Voeg 150 μL van deze kleuringsoplossing toe aan vaste cellen en incubeer gedurende 30 minuten bij omgevingstemperatuur.
- Was putten 2x met PBS.
- Bewaren bij 4 °C tot microscopie.
7. Microscopie
OPMERKING: Over het algemeen zal een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop met hoge doorvoer de beeldvorming voor de OAA vergemakkelijken. Als er geen geautomatiseerd systeem beschikbaar is, kunnen fluorescerende beelden van aanhang bacillen handmatig worden genomen21. In deze studie20werden aanhankelijke bacillen en celmonolagen in beeld gesteld met behulp van het Zeiss 700 laserscanmicroscopiesysteem met gespecialiseerde apparatuur; ons systeem bestond uit de Zeiss Axio Observer Z1 omgekeerde microscoop uitgerust met een geautomatiseerd podium, de Definite Focus module, 40 x NA 0.6 objectief, Axio Cam HRc camera en Zen 2012 (Blue Edition) software. De verkregen beelden zijn widefield-afbeeldingen, geen confocale afbeeldingen. Het volgende protocol is bedoeld als een basismicroscoopopstelling die van toepassing is op een verscheidenheid aan geautomatiseerde microscopiesystemen.
- Incubeer plaat #1 bij omgevingstemperatuur gedurende 30 minuten. Zet de microscoop en aanverwante apparatuur aan.
OPMERKING: Acclimatisatie bij omgevingstemperatuur voorkomt dat condensvorming zich tijdens de beeldvorming op de glasplaat vormt. Bovendien voorkomt het defocusing als gevolg van temperatuurverschuiving. - Plaats de plaat op het podium en focus op de cellen met behulp van helder veld- of fasecontrast.
- Selecteer 96 goed formaat als de plaatinstelling. Selecteer kanaalinstellingen.
OPMERKING: Fitc's piek excitatie en emissie golflengte zijn 495/519 nm; de HCS oranje celbeits is 556 en 572 nm. Afhankelijk van de filters die beschikbaar zijn op de microscoop kunnen andere fluorforen worden gebruikt. - Selecteer de instelling voor de tegelmodus. Geef het aantal te verkrijgen afbeeldingen aan.
OPMERKING: Met de tegelfunctie u meerdere locaties in een voorbeeldput vastleggen en kan worden ingesteld om een afbeelding in een betegeling of een willekeurige indeling te verkrijgen. We hebben 10 willekeurige gebieden per put in beeld gemaakt. - Verander de acquisitiemodus in "zwart-wit" of "monochroom" en binning ≥ 2x2.
OPMERKING: Het instellen van de binning van 1x1 naar 2x2 of 4x4 zou de microscopiesnelheid verhogen, maar zou ook resulteren in een lagere resolutie van de afbeelding. Voor OAA is het voldoende om deze instellingen te gebruiken, omdat de test zowel de macrofagen als de hechtende bacteriën opsomt. - Schakel de autofocus- of scherpstelmodule in. Geef aan hoe vaak de autofocusfunctie moet worden uitgevoerd. Schakel de Z-stackfunctie in, indien beschikbaar. Geef het aantal Z-stacks aan dat de dikte van de celmonolaag en aanhangbacilillen zal vastleggen.
OPMERKING: Het aantal gekozen Z-stacks verhoogt de microscopietijd, maar zorgt ervoor dat bij elke Z-stack een afbeelding met de juiste focus wordt gemaakt. - Wijs een bestandsmap aan om afbeeldingen in op te slaan. Voer het geautomatiseerde beeldvormingsprogramma uit.
8. Gegevensverzameling en -analyse
- Tel het aantal aanhankelijke bacillen en zoogdiercellen per afbeelding. Tel elke keten van bacillen als één bacterie.
- Plot de bacillen/cellen van het positieve controletestserum en titer (bijv. 1:10 verdunning is 10 titereenheden) om een standaardcurve te genereren in een geschikt statistiekenprogramma.
- Analyseer het positieve controletestserum met behulp van niet-lineaire regressiecurvefit. Analyseer vervolgens de resterende monsters met behulp van de standaardcurve van het positieve controletestserum om de overeenkomstige titers te bepalen.
OPMERKING: Het is meestal het meest nauwkeurig om de monsterverdunningen in de buurt van het midden van de standaardcurve te kiezen bij het bepalen van titers. - Bereken het geometrische gemiddelde van de monsters van elke vaccingroep. Bereken de P-waarden van log getransformeerde titers met het minste significante verschil ANOVA-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze sectie toont representatieve micrografen verzameld tijdens een OAA-experiment, samen met resultaten waaruit blijkt dat de OAA kan worden gebruikt om de biologische functie van antilichamen te onderzoeken. Hier werd de test met succes gebruikt om de werkzaamheid van een miltvuurvaccinkandidaat te evalueren. Het is van cruciaal belang om de toestand van inkapseling op de bacillen te verifiëren, omdat weinig tot geen inkapseling ervoor zorgt dat ze zich hechten aan gastheercellen, wat een hoge achtergrond oplevert. Figuur 1 is een afbeelding van B. anthracis Ames negatief bevlekt met India inkt om inkapseling te onderzoeken. OAA vereist dat meerdere aangrenzende gezichtsvelden worden verlicht en als confocale microscopie wordt gebruikt, meerdere stapels of secties. Het is dus noodzakelijk om te controleren of de bacillen niet te zwak zijn of te snel fotobleken. Figuur 2 is een afbeelding van de bacillen gelabeld met FITC. Figuur 3 toont maximale projectiebeelden van B. antracis Ames die aan de celmonolagen zijn bevestigd. Dit zijn representatieve gezichtsvelden die zijn geteld en gescoord voor de OAA. De toename van de aanhechting van bacillen geïncubeerd met PGGA-OMPC antiserum is te wijten aan de aanwezigheid van anti-capsule antilichamen die de bacillen opsoniseerden. Figuur 4 laat zien dat de serumtiters van NHP's die zijn gevaccineerd met 10 en 50 μg PGGA-OMPC significant hoger zijn dan de titers voor OMPC en PGGA alleen.
Figuur 1. Een india inktbeeld van vaste B. anthracis Ames. Let op de spelingszone rond de bacillen als gevolg van de aanwezigheid van capsule. Staaf = 10 μm. De foto is gemaakt op het EVOS FL geautomatiseerde microscopie systeem met 100 x 1.4 numerieke diafragma (NA) olie objectieve lens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Afbeeldingen van FITC gelabeld vaste B. anthracis Ames. (Links) Differentiële interferentie contrast beeld; fluorescerend beeld pseudo-gekleurd in groen (midden); samengevoegd (rechts). Staaf = 10 μm. Confocale beelden zijn gemaakt op de Zeiss 700 LSM Confocal Microscopy met 40 x 1.3 NA olie objectieve lens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Fluorescerende beelden van B. anthracis Ames hielden vast aan RAW 264.7 cel monolagen. De bacillen werden gevaccineerd en versterkt met (A) 10 μg PGGA-OMPC, (B) 50 μg PGGA-OMPC, (C) 50 μg PGGA alleen, of (D) OMPC alleen. Groen = B. antracis Ames, rood = RAW 264,7 cellen. Staaf = 20 μm. Brede veldbeelden zijn gemaakt op de Zeiss Axio Observer Z1 microscoop met 40 x 0,6 objectief objectief en de Axio Cam HRc camera. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Opsono-therapie titers van NHP's gevaccineerd met 10 μg PGGA-OMPC, 50 μg PGGA-OMPC, 50 μg PGGA alleen, of OMPC alleen. De geometrische middelen van 5 dieren per groep worden in kaart gebracht. Foutbalken geven SEM aan. *p ≤ 0,001 in vergelijking met PGGA alleen. De p-waarden werden berekend met behulp van ANOVA met LSD posthoc-test. De gegevens zijn oorspronkelijk gepubliceerd in Chabot, et al., 201620. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het is aangetoond dat vaccins op basis van capsules effectief zijn tegen talrijke bacteriële pathogenen, en velen zijn gelicentieerd voor gebruik bij mensen25,26,27. Deze vaccins werken door antilichamen te genereren die gericht zijn op de capsule en veel van deze studies gebruiken de OPKA om de opsono-fagocytische functies van de antilichamen13,14,16,28,29aan te tonen . Vanwege bioveiligheidsproblemen en voor het gemak van het werk, ontwikkelden we een OAA om antilichamen te evalueren van dieren die zijn gevaccineerd met B. antracietcapsuleconjugaten. De aanwezigheid van capsule op B. anthracis voorkomt hechting en fagocytose30, maar opsonisatie van bacillen met sera van gevaccineerde dieren induceert gehechtheid aan macrofagen20,21.
Voor OAA wordt de aanhankelijkheidsactiviteit, niet internalisatie en doden, gebruikt om opsonische activiteit te kwantificeren. Dit bood de OAA verschillende voordelen. We waren in staat om paraformaldehyde gedood, fluorescerend gelabeld ingekapselde bacillen te gebruiken in plaats van levende organismen. Veranderingen aan het bacteriële oppervlak door aldehydefixatie en fluorescerende etikettering veranderden de algehele hechting van de bacterie aan de macrofagen niet; vaste en gelabelde bacillen waren niet meer aanhangend dan levende bacillen (gegevens niet weergegeven). De mate van inkapseling kan variëren van cultuur tot cultuur en de algehele naleving beïnvloeden, ondanks vergelijkbare groeiomstandigheden. Het gebruik van een enkele geïnactiveerde bacteriële voorraad maakt standaardisatie dus mogelijk over experimenten die op verschillende dagen en in verschillende sets experimenten worden uitgevoerd. Dit was waardevol voor het vergelijken van sera van de 20 NHP's die in dit werk worden gebruikt en sera die zullen worden gegenereerd in onze komende studies. Ten slotte zijn de meeste macrofagen, waaronder RAW 264.7-cellen, gevoelig voor het miltvuur letale toxine geproduceerd door de levende ziekteverwekker31, waardoor het gebruik van levende bacillen inherent problematischis .
Het gebruik van RAW 264.7 cellen vergemakkelijkte ook standaardisatie. We gebruikten aanvankelijk een veelgebruikte cellijn in OPKA, HL-60 cellen. We vonden echter problemen bij het differentiëren ervan met granulocyten met dimethyl-formamide, zoals gemeld door anderen28,32. RAW 264.7 cellen hebben het voordeel dat ze niet chemisch gedifferentieerd hoeven te worden en aanhankelijk zijn en dus beter vatbaar zijn voor op microscopie gebaseerde OAA. Deze cellijn is gebruikt in talrijke fagocytosestudies met intracellulaire pathogenen33,34, evenals B. anthracis31. Het gebruik van RAW 264.7 cellen, die zijn afgeleid van de muis, is ook voordelig omdat muis Fc receptoren zijn promiscue in hun bindende specificiteit voor IgG afgeleid van andere soorten35. Dit stelde ons in staat om de anti-capsule antilichamen van NHP's te evalueren met een murine cellijn.
Miltvuur, hoewel zeldzaam, is endemisch in sommige regio's van de wereld en de VS. Een zorg is dat de gebruikte FBS, afkomstig uit de VS, al anticapsuleantilichamen kan bevatten als gevolg van blootstelling van het dier aan B. antracissporen of andere PGGA-producerende microben in de bodem. Om dit probleem aan te pakken, werd de FBS-partij die we gebruikten vooraf getest. We ontdekten dat de toevoeging van warmte-geïnactiveerde FBS de therapietrouw wel deed toenemen in vergelijking met DMEM alleen (gegevens niet getoond). Het verhoogt echter de therapietrouw niet in vergelijking met warmte geïnactiveerde normale sera van cavia, aap, muis of mens (gegevens niet getoond). De FBS-partij die we gebruikten, bevatte dus geen anticapsuleantilichamen als gevolg van blootstelling. Bovendien zou het ook geen anticapsuleantilichamen bevatten als gevolg van het vaccineren van het dier met de niet-ingekapselde B. anthracis Sterne, een stam die niet de pXO2-plasmide mist die nodig is voor de productie van capsules. De geteste FBS-partij werd gebruikt voor alle daaropvolgende OAA.
Een beperking van de techniek is de taak van het tellen van bacillen en cellen door laboratoriumpersoneel, wat enorm veel tijd en moeite kostte. Dit kan worden gecorrigeerd met behulp van software die dit type analyse heeft; deze software was op dat moment niet beschikbaar voor ons. Omdat handmatig tellen echter noodzakelijk was, was een kritieke stap het verwijderen of afspoelen van vreemde en niet-gehechte bacillen om de taak te vergemakkelijken. Het was ook noodzakelijk om reagentia te testen die leidden tot lagere achtergrondgeluiden. OAA vereist een bron van aanvulling omdat het opsonisatieverbetert 36. Daarom hebben we een verscheidenheid aan complementbronnen getest, waaronder cavia-, mens- en babykonijncomplement. We kozen babykonijncomplement voor onze test omdat we ontdekten dat het geen zwakke, multispecifieke activiteiten heeft tegen heterofiele antigenen, het wordt vaak gebruikt in OPKA-studies14,15,37en het is gemakkelijk commercieel beschikbaar.
We vinden de OAA kwantitatief en zeer reproduceerbaar. We gebruiken het als aanvulling op studies met ligandbindende tests zoals ELISA's, die alleen de totale IgG-niveaus kwantificeren, maar geen onderscheid maken tussen functionele en niet-functionele antilichamen. OAA kan worden gebruikt als aanvulling op andere functionele tests (bv. serumbactericide activiteit en toxineneutralisatietests) om de verschillende functionaliteit van vaccingegenereerde antilichamen aan te tonen16,38. De ontwikkeling van OAA heeft ons repertoire van immunogeniciteitsstudies verhoogd om vaccins en therapieën te evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen commerciële of andere associatie die een belangenconflict kan vormen.
Acknowledgments
J. Chua, D. Chabot en A. Friedlander ontwierpen de procedures beschreven in het manuscript. J. Chua en T. Putmon-Taylor voerden de experimenten uit. D. Chabot voerde data-analyse uit. J. Chua schreef het manuscript.
De auteurs bedanken Kyle J. Fitts voor uitstekende technische assistentie.
Het werk werd ondersteund door de Defense Threat Reduction Agency grant CBM. VAXBT.03.10.RD.015, plannummer 921175.
Meningen, interpretaties, conclusies en aanbevelingen zijn die van de auteurs en worden niet noodzakelijkerwijs onderschreven door het Amerikaanse leger. De inhoud van deze publicatie weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs de standpunten of het beleid van het Ministerie van Defensie, noch impliceert het vermelden van handelsnamen, commerciële producten of organisaties goedkeuring door de Amerikaanse overheid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) | Corning, Corning, NY | 431222 | |
| 10 mL syringe (Luer-Lok tip) | BD, Franklin Lakes, NJ | 302995 | |
| 15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) | In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA | P96-1-N | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 15710 | |
| 75 cm sq. tissue culture treated flask | Corning, Corning, NY | 430641 | |
| Agar (powder) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Baby Rabbit Complement | Cedarlane Labs, Burlington, NC | CL3441 | |
| Bacto Yeast Extract | BD, Sparks, MD | 288620 | |
| BBL Brain Heart Infusion (BHI) | BD, Sparks, MD | 211059 | |
| Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates | Remel, Lenexa, KS | R01198 | |
| Cell scraper | Sarstedt, Newton, NC | 83.183 | |
| Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) | Corning, Corning, NY | 3596 | |
| Cover glass | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 72200-10 | |
| Difco Nutrient Broth | BD, Sparks, MD | 234000 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11965-092 | contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AMAFD1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SH30071.03 | not gamma irradiated, not heat inactivated |
| Fluorescein isothiocyanate | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | F143 | |
| HCS Cell Mask Orange Cell Stain | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | H32713 | |
| hemocytometer (Improved Neubauer) | Hausser Scientific, Horsham, PA | 3900 | |
| India Ink solution | BD, Sparks, MD | 261194 | |
| L- glutamine (200 mM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA | 25030081 | supplement medium with additional 2mM L-glutamine |
| Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) | Nikon Instruments, Melville, NY | TE2000 | |
| PBS without Calcium or Magnesium | Lonza, Walkersville, MD | 17-516F | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SV30010 | |
| petri dishes (100 x 15 mm) | Falcon, Corning, Durham, NC | 351029 | for agar plates |
| RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) | ATCC, Manassas, VA | ATCC TIB-71 | |
| Slides | VWR, Radnor, PA | 16004-422 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5761 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8154 | |
| Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) | Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY | 4109001865956000 |
References
- Walters, M. N., Papadimitriou, J. M. Phagocytosis: a review. CRC Critical Reviews in Toxicology. 5 (4), 377-421 (1978).
- Metschnikoff, E. Untersuchurgen uber die intracellulare Verdauung, bei wirbellosen Thieren. Arbeiten aus dem Zoologischen Instituten der Universität Wien. 5, 144 (1883).
- Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
- Janeway, C. A. The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunology Today. 13 (1), 11-16 (1992).
- Kumagai, Y., Akira, S. Identification and functions of pattern-recognition receptors. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (5), 985-992 (2010).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review of Pathology. 7, 61-98 (2012).
- Candela, T., Fouet, A. Poly-gamma-glutamate in bacteria. Molecular Microbiology. 60 (5), 1091-1098 (2006).
- Kocianova, S., et al. Key role of poly-gamma-DL-glutamic acid in immune evasion and virulence of Staphylococcus epidermidis. Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 688-694 (2005).
- Rothbard, S. Protective effect of hyaluronidase and type-specific anti-M serum on experimental group A Streptococcus infection in mice. Journal of Experimental Medicine. 88 (3), 325-342 (1948).
- Oh, S. Y., Budzik, J. M., Garufi, G., Schneewind, O. Two capsular polysaccharides enable Bacillus cereus G9241 to cause anthrax-like disease. Molecular Microbiology. 80 (2), 455-470 (2011).
- Knuf, M., Kowalzik, F., Kieninger, D. Comparative effects of carrier proteins on vaccine-induced immune response. Vaccine. 29 (31), 4881-4890 (2011).
- Wang, T. T., Lucas, A. H. The capsule of Bacillus anthracis behaves as a thymus-independent type 2 antigen. Infection & Immunity. 72 (9), 5460-5463 (2004).
- Vogel, L., et al. Quantitative flow cytometric analysis of opsonophagocytosis and killing of nonencapsulated Haemophilus influenzae by human polymorphonuclear leukocytes. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1 (4), 394-400 (1994).
- Salehi, S., Hohn, C. M., Penfound, T. A., Dale, J. B. Development of an Opsonophagocytic Killing Assay Using HL-60 Cells for Detection of Functional Antibodies against Streptococcus pyogenes. mSphere. 3 (6), 00617-00618 (2018).
- Wang, Y., et al. Novel Immunoprotective Proteins of Streptococcus pneumoniae Identified by Opsonophagocytosis Killing Screen. Infection & Immunity. 86 (9), (2018).
- Humphries, H. E., et al. Seroprevalence of Antibody-Mediated, Complement-Dependent Opsonophagocytic Activity against Neisseria meningitidis Serogroup B in England. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (5), 503-509 (2015).
- List of Tier 1 BSAT. , Available from: www.selectagents.gov/ohp-app1.html (2017).
- Jansen, W. T., et al. Use of highly encapsulated Streptococcus pneumoniae strains in a flow-cytometric assay for assessment of the phagocytic capacity of serotype-specific antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 5 (5), 703-710 (1998).
- Wang, T. T., Fellows, P. F., Leighton, T. J., Lucas, A. H. Induction of opsonic antibodies to the gamma-D-glutamic acid capsule of Bacillus anthracis by immunization with a synthetic peptide-carrier protein conjugate. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (3), 231-237 (2004).
- Chabot, D. J., et al. Protection of rhesus macaques against inhalational anthrax with a Bacillus anthracis capsule conjugate vaccine. Vaccine. 34 (34), 4012-4016 (2016).
- Chabot, D. J., et al. Efficacy of a capsule conjugate vaccine against inhalational anthrax in rabbits and monkeys. Vaccine. 30 (5), 846-852 (2012).
- Revised FSAP Policy Statement: Inactivated Bacillus anthracis and Bacillus cereus Biovar anthracis. , Available from: www.selectagents.gov/policystatement_bacillus.html (2017).
- Chua, J., et al. Formaldehyde and Glutaraldehyde Inactivation of Bacterial Tier 1 Select Agents in Tissues. Emerging Infectious Diseases. 25 (5), 919-926 (2019).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Eighth Edition). , Available from: https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
- Durando, P., et al. Experience with pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (conjugated to CRM197 carrier protein) in children and adults. Clinical Microbiology and Infection. 19, Suppl 1 1-9 (2013).
- Adams, W. G., et al. Decline of childhood Haemophilus influenzae type b (Hib) disease in the Hib vaccine era. JAMA. 269 (2), 221-226 (1993).
- Balmer, P., Borrow, R., Miller, E. Impact of meningococcal C conjugate vaccine in the UK. Journal of Medical Microbiology. 51 (9), 717-722 (2002).
- Chen, M., et al. Induction of opsonophagocytic killing activity with pneumococcal conjugate vaccine in human immunodeficiency virus-infected Ugandan adults. Vaccine. 26 (38), 4962-4968 (2008).
- Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (146), e59400 (2019).
- Ezzell, J. W., Welkos, S. L. The capsule of Bacillus anthracis, a review. Journal of Applied Microbiology. 87 (2), 250 (1999).
- Hanna, P. C., Acosta, D., Collier, R. J. On the role of macrophages in anthrax. Proceedings of the National Academies of Sciences of the United States of America. 90 (21), 10198-10201 (1993).
- Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
- Chua, J., Deretic, V. Mycobacterium tuberculosis reprograms waves of phosphatidylinositol 3-phosphate on phagosomal organelles. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36982-36992 (2004).
- Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infection & Immunity. 85 (1), (2017).
- Ober, R. J., Radu, C. G., Ghetie, V., Ward, E. S. Differences in promiscuity for antibody-FcRn interactions across species: implications for therapeutic antibodies. International Immunology. 13 (12), 1551-1559 (2001).
- Sorman, A., Zhang, L., Ding, Z., Heyman, B. How antibodies use complement to regulate antibody responses. Molecular Immunology. 61 (2), 79-88 (2014).
- Henckaerts, I., Durant, N., De Grave, D., Schuerman, L., Poolman, J. Validation of a routine opsonophagocytosis assay to predict invasive pneumococcal disease efficacy of conjugate vaccine in children. Vaccine. 25 (13), 2518-2527 (2007).
- Wolf, J. J. Special Considerations for the Nonclinical Safety Assessment of Vaccines. , Elsevier. 243-255 (2013).
