De opsono-therapietrouwtest is een alternatieve methode voor de opsono-fagocytische moordtest om de opsonische functies van antilichamen in de ontwikkeling van vaccins te evalueren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Opsono-Adherence Assay om functionele antilichamen te evalueren in vaccinontwikkeling tegen Bacillus anthracis en andere ingekapselde pathogenen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De opsono-therapietrouwtest is een functionele test die de aanhechting van bacteriële pathogenen aan professionele fagocyten opsomt. Omdat therapietrouw noodzakelijk is voor fagocytose en doden, is de test een alternatieve methode voor opsono-fagocytische moordtests. Een voordeel van de opsono-adherence-test is de optie om geïnactiveerde pathogenen en zoogdiercellijnen te gebruiken, waardoor standaardisatie in meerdere experimenten mogelijk is. Het gebruik van een geïnactiveerde ziekteverwekker in de test vergemakkelijkt ook het werken met bioveiligheidsniveau 3 infectieuze agentia en andere virulente pathogenen. In ons werk werd de opsono-therapietrouwtest gebruikt om het functionele vermogen van antilichamen te beoordelen, van sera van dieren die zijn geïmmuniseerd met een vaccin op basis van miltvuurcapsules, om hechting van vaste Bacillus-antracis aan een muismacrofaagcellijn, RAW 264.7, te induceren. Geautomatiseerde fluorescentiemicroscopie werd gebruikt om beelden vast te leggen van bacillen die zich aan macrofagen hechten. Verhoogde therapietrouw was gecorreleerd met de aanwezigheid van anti-capsule antilichamen in het serum. Niet-menselijke primaten die hoge serum anti-capsule antilichaamconcentraties vertoonden, werden beschermd tegen miltvuuruitdaging. Zo kan de opsono-therapietrouwtest worden gebruikt om de biologische functies van antigeenspecifieke antilichamen in sera op te helderen, om de werkzaamheid van vaccinkandidaten en andere therapeutische middelen te evalueren en om te dienen als een mogelijke correlaat van immuniteit.
Inleiding
Herkenning, therapietrouw, internalisering en afbraak van een ziekteverwekker zijn integraal onderdeel van fagocytose1, een saillant pad in de gastheer aangeboren immuunrespons die voor het eerst werd beschreven door Ilya Metchnikoff in 18832,3. Fagocytische leukocyten, evenals andere cellen van het immuunsysteem, zijn zeer discriminerend in hun selectie van doelen; zij zijn in staat onderscheid te maken tussen "infectieuze niet-zelf" en "niet-infectieuze zelf" door middel van pathogene geassocieerde moleculaire patronen door hun repertoire van patroonherkenningsreceptoren (PRR's)
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
In overeenstemming met de Dierenwelzijnswet, het beleid van de Openbare Gezondheidsdienst en andere federale wet- en regelgeving met betrekking tot dieren en dierproeven, werd het hier beschreven onderzoek uitgevoerd in het kader van een door de Institutional Animal Care and Use Committee goedgekeurd protocol. De faciliteit waar dit onderzoek is uitgevoerd is geaccrediteerd door de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International en houdt zich aan principes die zijn vermeld in de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, National Research Council, 201124.
1. Cultuur en onder....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Deze sectie toont representatieve micrografen verzameld tijdens een OAA-experiment, samen met resultaten waaruit blijkt dat de OAA kan worden gebruikt om de biologische functie van antilichamen te onderzoeken. Hier werd de test met succes gebruikt om de werkzaamheid van een miltvuurvaccinkandidaat te evalueren. Het is van cruciaal belang om de toestand van inkapseling op de bacillen te verifiëren, omdat weinig tot geen inkapseling ervoor zorgt dat ze zich hechten aan gastheercellen, wat een hoge achtergrond oplevert.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het is aangetoond dat vaccins op basis van capsules effectief zijn tegen talrijke bacteriële pathogenen, en velen zijn gelicentieerd voor gebruik bij mensen25,26,27. Deze vaccins werken door antilichamen te genereren die gericht zijn op de capsule en veel van deze studies gebruiken de OPKA om de opsono-fagocytische functies van de antilichamen13,14,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen commerciële of andere associatie die een belangenconflict kan vormen.
Dankbetuigingen
J. Chua, D. Chabot en A. Friedlander ontwierpen de procedures beschreven in het manuscript. J. Chua en T. Putmon-Taylor voerden de experimenten uit. D. Chabot voerde data-analyse uit. J. Chua schreef het manuscript.
De auteurs bedanken Kyle J. Fitts voor uitstekende technische assistentie.
Het werk werd ondersteund door de Defense Threat Reduction Agency grant CBM. VAXBT.03.10.RD.015, plannummer 921175.
Meningen, interpretaties, conclusies en aanbevelingen zijn die van de auteurs en worden niet noodzakelijkerwijs onderschreven door het Amerikaanse leger. De inhoud van deze publicatie w....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.20 µm spuitfilter (25mm, geregenereerde cellulose) | Corning, Corning, NY | 431222 | |
| 10 mL spuit (Luer-Lok tip) | BD, Franklin Lakes, NJ | 302995 | |
| 15µ 96 wel zwarte platen (plaat #1 voor beeldvorming) | In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA | P96-1-N | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 15710 | |
| 75 cm vierkante weefselkweek behandelde fles | Corning, Corning, NY | 430641 | |
| Agar (poeder) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Baby Rabbit Complement | Cedarlane Labs, Burlington, NC | CL3441 | |
| Bacto Yeast Extract | BD, Sparks, MD | 288620 | |
| BBL Brain Heart Infusion (BHI) | BD, Sparks, MD | 211059 | |
| Blood Agar (TSA met schapenbloed) platen | Remel, Lenexa, KS | R01198 | |
| Celschraper | Sarstedt, Newton, NC | 83.183 | |
| Costar 96 wel celkweek platen (platen #2 & 3 voor verdunning) | Corning, Corning, NY | 3596 | |
| Dekglas | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 72200-10 | |
| Difco Nutrient Broth | BD, Sparks, MD | 234000 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), hoge glucose | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11965-092 | bevat 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescentiemicroscoop) | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AMAFD1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SH30071.03 | niet gamma bestraald, niet hitte geïnactiveerd |
| Fluoresceïne isothiocyanate | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | F143 | |
| HCS Cell Mask Orange Celkleuring | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | H32713 | |
| hemocytometer (Verbeterde Neubauer) | Hausser Scientific, Horsham, PA | 3900 | |
| India Ink oplossing | BD, Sparks, MD | 261194 | |
| L- glutamine (200 mM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA | 25030081 | supplementmedium met extra 2mM L-glutamine |
| Nikon Eclipse TE2000-U (invers samengesteld microscoop) | Nikon Instruments, Melville, NY | TE2000 | |
| PBS zonder Calcium of Magnesium | Lonza, Walkersville, MD | 17-516F | |
| Penicilline-Streptomycine Oplossing, 100x | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SV30010 | |
| petrischalen (100 x 15 mm) | Falcon, Corning, Durham, NC | 351029 | voor agar platen |
| RAW 264.7 macrofaag cel lijn (Tib47) | ATCC, Manassas, VA | ATCC TIB-71 | |
| Glijbanen | VWR, Radnor, PA | 16004-422 | |
| Natriumbicarbonaat | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5761 | |
| Trypan Blauw Oplossing (0,4%) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8154 | |
| Zeiss 700 Laser Scanning Microscopie (confocale microscoop) | Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY | 4109001865956000 |
Referenties
- Walters, M. N., Papadimitriou, J. M. Phagocytosis: a review. CRC Critical Reviews in Toxicology. 5 (4), 377-421 (1978).
- Metschnikoff, E. Untersuchurgen uber die intracellulare Verdauung, bei wirbellosen Thieren. Arbeiten aus dem Zoolo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
