Engineering van intracellulaire eiwitsensoren in zoogdiercellen

Marina Duhkinova; Claudia Crina; Ron Weiss; Velia Siciliano

doi:10.3791/60878

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Engineering van intracellulaire eiwitsensoren in zoogdiercellen

2.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60878

⸱

28 april 2020

Marina Duhkinova¹ , Claudia Crina¹ , Ron Weiss² , Velia Siciliano¹

¹Istituto Italiano di Tecnologia, ²Synthetic Biology Center, Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het engineeren van genetisch gecodeerde intracellulaire eiwitsensor-actuator(en). Het apparaat detecteert specifiek doeleiwitten via intracellulaire antilichamen (intrabodies) en reageert door gentranscriptionele output in te schakelen. Er is een algemeen raamwerk gebouwd om intrabodies snel te vervangen, waardoor een snelle detectie van elk gewenst eiwit mogelijk is, zonder de algemene architectuur te wijzigen.

Samenvatting

Eiwitten kunnen functioneren als biomarkers van pathologische aandoeningen, zoals neurodegeneratieve ziekten, infecties of metabole syndromen. Het manipuleren van cellen om deze biomarkers te detecteren en erop te reageren, kan helpen bij het begrijpen van moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan pathologieën, en bij het ontwikkelen van nieuwe celgebaseerde therapieën. Hoewel er verschillende systemen zijn ontwikkeld die extracellulaire eiwitten detecteren, ontbrak er een modulair raamwerk dat gemakkelijk opnieuw kan worden ontworpen om verschillende intracellulaire eiwitten te detecteren.

Hier beschrijven we een protocol om een modulair genetisch platform te implementeren dat intracellulaire eiwitten detecteert en een specifieke cellulaire respons activeert. Het apparaat werkt op intracellulaire antilichamen of kleine peptiden om met hoge specificiteit het eiwit van interesse te detecteren, waardoor de transcriptionele activering van outputgenen wordt geactiveerd via een op TEV-protease (TEVp) gebaseerde activeringsmodule. TEVp is een viraal protease dat selectief korte verwante peptiden splitst en veel wordt gebruikt in de biotechnologie en synthetische biologie vanwege zijn hoge orthogonaliteit ten opzichte van de splitsingsplaats. In het bijzonder hebben we apparaten ontwikkeld die eiwitbiomarkers van virale infecties en genetische ziekten herkennen en erop reageren, waaronder gemuteerde huntingtine-, NS3-serine-protease-, Tat- en Nef-eiwitten om respectievelijk de ziekte van Huntington, het hepatitis C-virus (HCV) en het humaan immunodeficiëntievirus (HIV) infecties te detecteren. Belangrijk is dat het systeem met de hand kan worden aangepast voor het gewenste functionele resultaat van input-output, zoals fluorescerende uitlezingen voor biosensoren, stimulatie van antigeenpresentatie voor immuunrespons of initiatie van apoptose om ongezonde cellen te elimineren.

Inleiding

De studie en modulaties van cellulaire responsen via controleerbare gemanipuleerde gencircuits zijn belangrijke doelen in de synthetische biologie ^1,2,3 voor de ontwikkeling van prospectieve instrumenten met relevante biologische of medische toepassingen bij kanker 4, infecties⁵, stofwisselingsziekten⁶ en immunologie⁷.

Het herprogrammeren van celfuncties als reactie op specifieke signalen vereist het ontwerp van slimme i....