Summary
이 프로토콜은 생물 공학 적 배경이 제한된 사람들이 간단하고 접근 할 수있는 리소 그래피프리 마이크로 패터닝 방법을 소개합니다. 이 방법은 세포 형태를 변조하기 위한 관심있는 모양의 마이크로 패턴 세포 외 매트릭스 단백질에 맞춤형 레이저 컷 스텐실을 활용합니다. 미세 패터킹에 대한 절차는 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포를 사용하여 입증된다.
Abstract
마이크로 패터닝 기술은 세포 생물학에서 세포 모양과 크기를 단일 세포 해상도에서 세포 운명 결정에 미치는 영향을 연구하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 현재 최첨단 단일 셀 마이크로 패터닝 기술은 강력한 기술이지만 숙련 된 엔지니어링 기술과 미세 제작에 대한 특정 시설 지원이 필요한 소프트 리소그래피 및 마이크로 접촉 인쇄를 포함합니다. 이러한 제한은 보다 접근하기 쉬운 기술이 필요합니다. 여기에서는 스텐실 기반 단일 셀 패터닝이라는 간단한 대체 리소그래피 없는 방법을 설명합니다. 우리는 스텐실 설계, 폴리아크릴아미드 하이드로겔 제조, 스텐실 기반 단백질 통합, 세포 도금 및 배양을 포함한 단계별 절차를 제공합니다. 이 간단한 방법은 최대 2,000개의 셀 배열을 패턴화하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 1:1 정사각형에서 7:1 성인 심근세포와 같은 직사각형까지, 뚜렷한 세포 모양을 가진 단일 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)에서 파생된 심근세포의 패터닝을 보여줍니다. 이 스텐실 기반 단일 세포 패터닝은 리소그래피가 없고 기술적으로 견고하며 편리하며 저렴하며 생물 공학적 배경이 제한된 사람들에게 가장 중요한 접근성을 갖추고 있습니다.
Introduction
hiPSCs의 출현 및 상이한 세포 유형으로의 그들의 지시된 분화에 대한 프로토콜의 후속 개발은 특히 환자 유래 iPSC 심근세포(iPSC-CMs)를 사용하여 심근병증1,,2를모델링하기 위해 분자 및 환자 별 수준에서 개발 및 질병을 연구할 수 있게 하였다. 그러나, iPSC 시스템 및 기타 시험관내 모델을 이용한 개발 및 생리학을 연구하는 데 큰 한계는 구조화 된 미세 환경의 부재이다. 이 환경에서 세포는 세포외 매트릭스(ECM)뿐만 아니라 인접 세포의 제약을 받습니다. 이러한 미세 환경의 특정 생화학 적 조성 및 강성은 세포의 공간 분포뿐만 아니라 세포 접착에 관여하는 데 사용할 수있는 요인을 지시합니다. 이것은, 차례차례로, 세포내 신호 통로, 유전자 발현 및 세포 운명 결정에 영향을 미칩니다. 예를 들어, 성인형 로드 형상의 마이크로패턴 iPSC-CM은 현저히 더 나은 수축능력, 칼슘 흐름, 미토콘드리아 조직, 전기생리학, 및 횡-환관 형성3을가지는 것이다. 따라서, 미세 환경의 특성은 세포 기능의 조절에 필수적이다.
이전의 마이크로 패터닝 기법은 포토리소그래피에 크게 의존했습니다(그림1A). 이 기술에서 감광성 폴리머 또는 포토레지스트층은 용액으로부터 평평한 기판상에 스펀되어 약 1 μm 두께의 박막을 형성한다. 다음으로, 자외선(UV) 광은 원하는 패턴을 함유하는 마스크를 통해 포토레지스트에 적용된다. 자외선(UV) 빛에 노출되면 해당 개발자 용액에서 용해도를 수정하여 원하는 패턴을 마스크에서 기판으로 전달하여 포토레지스트를 화학적으로 변화시다. 많은 마이크로 패터닝 방법은 나노미터를 마이크로미터 수준의 제어에 부여하여 세포 패턴의 설계를 제어하기 때문에 포토리소그래피를 통합합니다. 그러나, 포토레지스트의 방적은 불순물에 매우 민감하며, 이는 가장 작은 먼지 입자가 용액을 박막으로 확산하는 것을 방해하기 때문이다. 따라서 포토리소그래피는 오염되지 않은 시설에서 수행되어야 하며, 유지 보수비용이 많이 들고 활용하기 위해서는 특별한 전문 지식이 필요합니다. 또한, 포토리소그래피에 사용되는 화학 물질은 종종 세포에 독성이 있으며 중요한 생체 분자를 변성시킬 수 있습니다. 따라서, 포토리소그래피는 편리한 생물학적 응용을 위한 마이크로패턴의 제조에 중대한 장애물을 제기한다.
1994년 Whitesides와 동료4는 소프트 리소그래피라는 기술 컬렉션을 개척하여 포토리소그래피와 관련된 몇 가지 과제를 극복했습니다. 연질 리소그래피에서 투명한 고무와 같은 재료인 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 만든 미세 구조화된 표면이 ECM 단백질4의패턴을 생성하는 데 사용됩니다. 일반적인 연질 리소그래피 기법에는 마이크로접촉 인쇄 및 미세 유체 패터닝이 포함됩니다. 마이크로 접촉 인쇄, 현재 가장 인기있는 연질 석판화 방법, ECM 단백질로 코팅 PDMS 스탬프는 스탬프에 의해 접촉 된 영역에서 표면에 물질을 전송(그림 1B). 미세 유체 패터닝에서 미세 구조는 스탬프가 기판에 가압될 때, 유체가 원하는 영역으로 전달될 수 있는 마이크로채널 네트워크가 생성되도록 PDMS 표면에 설계된다(도1C)5. 소프트 리소그래피는 포토리소그래피보다 몇 가지 이점을 제공합니다. 마스터 웨이퍼를 마이크로 제작하면, PDMS 스탬프는 클린룸 시설을 더 이상 고용하지 않고도 쉽게 복제할 수 있습니다. 또한, 연질 리소그래피 과정에서 유기 용매의 부재는 일반적으로 세포 배양에 사용되는 폴리스티렌과 같은 고분자 물질의 활용을 허용한다. 마지막으로, 부드러운 석판화 방법을 사용한 미세 패턴화는 평평한 표면에 국한되지 않습니다. 따라서, 부드러운 리소그래피는 포토리소그래피6을통해 마이크로패턴 제작의 접근성과 기능을 증가시킨다. 그러나 소프트 리소그래피에는 상당한 단점이 있습니다. 예를 들어, 포토리소그래피를 사용하는 초기 에칭 단계는 여전히 스탬프를 미세 제작하는 데 필요합니다. 또한, PDMS 스탬프를 이용한 마이크로패터닝은 기판 상에 단백질 전달의 품질에 변화가있다(6). 이러한 불일치를 방지하려면 단백질 전달 동안 PDMS 스탬프에 가해지는 압력의 최적화 및 일관성이 필요하며, 그렇지 않으면 PDMS 금형의 특징 크기의 변형 및 왜곡이 발생할 수 있다6. 또한 소분자 흡수로 인한 PDMS를 반복적으로 사용하는 주요 관심사도7.
소프트 포토리소그래피와 PDMS 스탬프를 사용하지 않으려면, 포토리소그래피 및 연리소그래피와 관련된 많은 장애물을 극복하는 스텐실 기반의 리소그래피 없는 단일 세포 마이크로패터닝 방법을 설명합니다. 이 방법에서 폴리아크릴아미드 하이드로겔은 스텐실 계 ECM 단백질 혼입을 위한 기판으로 사용되어 단일 hiPSC-CM의 선택적 도금을 허용한다. 이 기술은 고전적인 세포 배양 조건에서 사용되는 폴리머 재료와 매우 호환됩니다. 또한 적절한 세척 및 유지 보수를 통해 스텐실은 재사용이 가능하며 미세 제조 공정 중 열화 및 단백질 흡수에 강합니다. 마지막으로, 패터닝 프로세스는 기술적으로 견고하고 저렴하며 사용자 정의 가 가능하며 전문 적인 생명 공학 기술이없는 사람들에게 접근 할 수 있습니다. 이러한 스텐실 기반 마이크로패터닝 기법은 최근 간행물에서 다양한 심근병증8,,9,,10을모델링하는 데 광범위하게 활용되고 있다.
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Protocol
1. 네거티브 패턴 폴리 이미드 기반 스텐실의 제조
- 컴퓨터 지원 설계 소프트웨어(예: AutoCAD, SolidWorks, Onshape, Adobe Illustrator)를 사용하여 .dxf 형식으로패턴(그림 2A)을생성합니다.
- 스텐실의 테두리를 묘사하기 위해 원(지름 = 22mm)을 생성합니다.
- 단색으로 채워진 모양이나 원하는 패턴을 그립니다.
- 스텐실의 앞면을 표시하기 위해 키랄 문자(예: R)를 포함합니다.
참고: 예를 들어, 사각형및 사각형의 배열은 단일 셀 및 셀 쌍 수준에서 iPSC-CM을 패턴화하기 위해 생성됩니다. 설계 파일을 사용할 수 있습니다(추가 파일참조). 미세 가공 분해 분해 능한은 ~10 μm입니다.
- 레이저 컷 폴리이미드 필름및 제작 스텐실에 마이크로 제조 회사에 디자인을 제출(그림 2B,C).
2. 설포-산파(sulfo-SANPAH) 알리쿼트 준비
참고 : 프로토콜은 Fischer 외11에서수정됩니다.
- 방습 판지 샘플 보관 상자(예: 원심분리기 튜브의 경우 10 x 10 공간, 치수: 13.4cm x 13.4cm x 5.1cm)를 사용하십시오. "이름/날짜/설포-SANPAH 40 μL/PBS 1,200 μL로 재구성"이라고 라벨을 붙입니다.
- 50개의 미세원심지 튜브(폴리프로필렌, 1.5mL)에 뚜껑에 'S'를 붙입니다.
- 무수, 여분의 드라이 디메틸 설폭사이드 (DMSO)의 4 mL을 취하고 멸균 15mL 원추 형 튜브에 멤브레인 필터 유닛 (공극 크기 = 0.22 μm)을 사용하여 용액을 멸균 필터.
- 액체 질소 욕조를 준비하고 액체 질소의 증발을 최소화하기 위해 뚜껑으로 덮습니다.
- 여과된 DMSO 의 2 mL에 50 mg의 설포-SANPAH를 용해시.
- 소용돌이는 DMSO에서 설포-SANPAH를 완전히 용해시키기에 잘 한다.
- 설포-SANPAH 용액의 40 μL aliquots를 멸균 1.5 mL 튜브에 분배합니다.
- 튜브를 상자에 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 넣습니다.
- 튜브를 액체 질소로 5분 동안 플래시 동결시.
- 알리쿼트(aliquots)를 -80°C에 보관하십시오.
참고: 이 음표는 효율성 저하 없이 최대 6개월 동안 사용할 수 있습니다. 주식 설포-SANPAH 농도는 25 mg/mL 또는 50.77 mM입니다.
3. 공구의 살균
- 오토클레이브 2개의 집게, 24개의 유리 커버슬립(22 x 22mm, No.1 또는 No.1.5), 면도날 1개, 보풀이 없는 흡수물티슈 3개.
참고 : 12 하이드로 겔 구조를 만들려면 24 개의 유리 커버 립이 필요합니다. 구문당 두 개의 커버슬립이 있어야 합니다. 약간의 여분의 커버를 준비하는 것이 좋습니다입술. - 파라핀 필름 2개(4 x 4인치)를 에탄올 내성 플라스틱 상자(예: 1,000 μL 파이펫 팁 박스)에 넣고 신선한 70% 에탄올로 15분 이상 살균합니다.
4. 폴리 아크릴아미드 하이드로 겔 전구체 용액의 제조
참고 : 프로토콜은 Lee 등에서 수정됩니다.
- 125 mg의 아미노에틸 메타크릴레이트(AEM)를 36.25 mL의 탈이온수에 용해시켜 50 mL 폴리프로필렌 원심분리튜브에 와류를 하여 용해시켰다.
- 10 kPa 폴리아크릴아미드 전구체 용액(8-0.15-15 mM)의 50 mL을 제조하려면, 10 mL의 40% 아크릴아미드 용액, 2% 비스-아크릴아미드 용액의 3.75 mL, 그리고 새로운 50 mofge에서 제조된 AEM 용액의 36.25 mL을 혼합한다.
참고: 전구체 용액의 최종 농도는 8% 아크릴아미드, 0.15% 비스-아크릴아미드 및 15 mM AEM이며, 이는 원자력 현미경검사법에 의해 ~10 kPa 강성을 갖도록 측정되었다. 관심의 조직 적용에 따르면, 하이드로겔의 강성은 40% 아크릴아미드의 비율을 2% 비스-아크릴아미드 용액으로 변경함으로써 변경될 수 있다. 예를 들어, 8% 아크릴아미드-0.08% 비스-아크릴아미드 용액은 3 kPa 하이드로겔을 생성한다; 8% 아크릴아미드-0.48% 비스-아크릴아미드 용액은 38 kPa 하이드로겔을 생성한다; 8 % 아크릴아미드 - 0.48 % 비스 아크릴아미드 용액은 60 kPa 하이드로 겔을 생성합니다. 변비율이 변경된 전구체 솔루션으로 만들어진 하이드로겔의 강성을 확인하는 것이 좋습니다.
5. 광자극제 용액의 준비
- 5% 광이니티액의 1 mL의 경우, 먼저 뚜껑이 있는 1.5 mL 폴리프로필렌 원심분리튜브에 100% 에탄올의 700 μL에 2-메틸프로피오페논 분말을 2-하이드록시-4'----2-하이드록시-4'--50 mg을 용해합니다.
참고 : 2-하이드록시 -4'-(2-하이드록스예톡시)-2-메틸프로피오페논은 물에 용해되지 않습니다. 소용돌이에 의해 에탄올에 분말을 완전히 용해해야합니다. - 2-하이드록시-4'--(2-hydroxyethoxy)-2-메틸프로피오페논을 와류에 의해 에탄올에 완전히 용해한 후, 최종 부피 1 mL에 대해 300 μL의 인산완충식염수(PBS)를 첨가하였다.
참고 : 2-하이드록시 -4'-(2-하이드록스예톡시)-2-메틸프로피오페논 용액의 최종 농도는 5%이다. 포일 된 5 % 광이니에이터 용액은 4 °C에서 4 주 동안 좋습니다.
6. 지하 막 매트릭스 단백질 용액의 준비
참고 : 지하 멤브레인 매트릭스(재료 표)는온도에 민감한 재료입니다. 차가운 파이펫 팁과 튜브뿐만 아니라 얼음 차가운 솔루션으로 얼음에서 작업해야합니다. 지하 멤브레인 매트릭스의 새로운 주식은 밤새 4 °C에서 얼음에 천천히 해동되어야한다.
- 하이드로겔 시공당 지하 막 매트릭스 단백질 용액 200 μL을 준비합니다. 12개의 구조의 경우, 지하 막 매트릭스 단백질 용액의 2.4 mL가 필요합니다. 10% 추가 솔루션 준비(예: 2.6mL).
- 지하 막 매트릭스 단백질 용액의 모든 새로운 배치 / 많은, 희석 비율을 최적화합니다. 처음으로, 세포 패터닝에 가장 적합한 품질을 산출하는 희석 비율을 찾기 위해 1:10, 1:20, 1:40의 희석 비율을 테스트하였다.
참고 : 지하 막 매트릭스 단백질 용액이 너무 점성이있는 경우 스텐실 위에 젤을 형성하고 스텐실을 제거 할 때 벗겨질 가능성이 높습니다. 단백질 용액이 너무 유체인 경우 스텐실의 패턴 구멍을 통해 침투하여 품질이 떨어지는 패터닝을 초래합니다. - 얼음 차가운 덜베코의 수정 된 독수리 중간 / 영양소 혼합물 F-12 (DMEM / F12) 매체 또는 위의 최적화 된 희석 비율로 1 x PBS로 얼음에 지하 막 매트릭스 단백질 스톡 솔루션을 희석하십시오. 예를 들어, 2.4 mL의 DMEM/F12 용지(1:20)에서 스톡 용액 의 120 μL을 희석하고 나중에 사용하기 위해 얼음을 유지합니다.
7. 하이드로 겔 제조
- 생물학적 안전 후드에 UV 벤치 램프(365nm, 4mW/cm2)를놓습니다.
- 3.2단계에서 멸균된 파라핀 필름을 놓고 멸균 조건하에서 완전히 건조시십시오. 파라핀 필름이 완전히 건조되지 않은 경우 진공 흡인 시스템을 사용하여 잔류 액체를 제거하십시오. 각 파라핀 필름에 3.1단계에서 오토클레이브 커버슬립 6개배치합니다.
- 50 mL 폴리프로필렌 원심분리튜브에서 폴리아크릴아미드 전구체 용액(단계 4.2)으로 5% 광이니티에이터 용액(단계 5.2)을 희석하여 UV 가교연결 폴리아크릴아미드 전구체 용액을 준비합니다. UV 가교 가능 폴리아크릴아미드 전구체 용액 5 mL의 경우, 폴리아크릴아미드 전구체 용액 5mL에 50 μL의 5% 광이형성제 용액을 추가하십시오.
- 멸균을 위해 0.22 μm 크기의 50 mL 필터 유닛을 사용하여 7.3 단계에서 전구체 용액을 걸러.
참고: 항상 신선한 전구체 용액을 준비하십시오. - 파라핀 촬영 페트리 접시에 각 22 x 22 mm 유리 커버 슬립에 단계 7.4에서 폴리 아크릴 아미드 전구체 용액의 200 μL을 분배하고 조심스럽게 사이에 용액을 샌드위치 상단에 다른 22 x 22mm 유리 커버 슬립으로 커버(그림 3A).
참고: 파라핀 필름은 유출을 방지하고 커버립 사이에 전구체 용액을 제한하는 데 사용됩니다. - UV 벤치 램프 아래에 7.5 단계에서 커버 슬립 함유 페트리 접시를 놓고 5 분 동안 폴리 아크릴아미드 하이드로 겔을 광중합(그림 3B).
참고: 표면이 흰색이 아닌 경우 표면의 UV 흡광도는 광교차 연결 효율을 감소시킵니다. 백색이 아닌 표면에 백서의 커버리지는 UV 강도 손실을 최소화하는 것이 중요합니다. 자외선으로부터 보호하려면 알루미늄 호일로 램프를 덮고 자외선 차단 고글을 착용하십시오. - 한 덮개를 다른 덮개에서 조심스럽게 분리하여 면도날을 사용하여 레버리지작용(그림 3C).
참고 : 하이드로 겔은 일반적으로 상단 커버 슬립에 충실합니다. 부드러운 하이드로겔에서 커버슬립을 분리할 때는 파손될 가능성이 있으므로 각별한 주의를 기울이시기 합니다. - 일회용 폴리프로필렌 저수지를 PBS로 채웁니다. 하이드로겔 커버슬립 복합체를 PBS 함유 저수지에 옮겨 5분 동안 PBS에서 하이드로겔을 헹구어 보도록 합니다. 헹구고 나면 하이드로겔 구성을 페트리 접시의 파라핀 필름에 다시 놓습니다.
8. 단백질 융합
- 얼음 양동이와 프리쿨 PBS를 준비합니다.
참고: 6개의 하이드로겔의 경우 1,200 μL의 차가운 PBS가 필요합니다. - 설포-산파(1바이알 = 6젤)를 꺼낸다.
참고: 필요한 경우 최적화 후 사용되는 설포-SANPAH의 양을 줄일 수 있습니다. - 1,200 μL의 차가운 PBS를 설포-SANPAH 알리쿼트의 바이알에 넣고 위아래로 파이펫팅하여 섞습니다.
- 페트리 접시에 파라핀 필름상에 설포-SANPAH 200 μL을 분배하고 하이드로겔-커버슬립 복합체와 하이드로겔 접촉 설포-SANPAH(그림3D)를가링한다.
참고: 설포-산파는 가수분해로 인해 물에 매우 취약합니다. 사용 직전에 -80 °C에서 갓 해동하십시오. 남은 것을 다시 사용하거나 다시 얼리지 마십시오. - 하이드로겔을 365nm, 4 mW/cm2에서 UV 램프에 5분 동안 노출하여 설포-SANPAH를 활성화합니다.
참고: 노출 후, 설포-SANPAH는 주황색에서 갈색으로 바뀝니다(그림3E). 하이드로겔이 갈색으로 변하면, 설포-SANPAH의 페닐 아지드 그룹의 성공적인 활성화및 하이드로겔 상에 설포-SANPAH의 혼입을 나타낸다. 설포-SANPAH의 활동이 감소하기 때문에 최대 10 분 이내에 8.6-8.9 단계를 직접 진행하십시오. - 일회용 폴리프로필렌 저수지에 신선한 PBS를 보충하십시오. 설포-SANPAH 활성화 후, 활성화된 하이드로겔을 이송하고 하이드로겔을 PBS 저장소에 빠르게 헹구어 언바운드 설포-SANPAH를 제거한다.
참고: 긴 세척은 낮은 단백질 컨쥬게이션 효율을 초래할 수 있습니다. - 빠른 헹구후, 하이드로겔부착 커버슬립을 페트리 접시의 파라핀 필름에 놓고, 무균 보풀이 없는 물티슈로 하이드로겔을 조심스럽게 두드려 주세요.
참고 : 하이드로 겔 의 상단에 남아있는 PBS는 스텐실을 통해 지하 막 매트릭스 단백질 용액의 누설을 초래할 것이다, 너무 광범위하게 건조스텐실에 너무 높은 준수로 인해 스텐실의 제거시 하이드로 겔의 파열로 이어질 것입니다. - 스텐실을 하이드로겔 위에 놓고 오토클레이브보풀이 없는 물티슈로 두드려 스텐실과 하이드로겔 사이에 단단히밀봉합니다(그림 3F).
- 6.3단계(도 3G)에서 제조된 희석된 지하 막 매트릭스 단백질 용액의 200 μL을 조심스럽게 분배한다(도3G). 인큐베이터 (37 °C)에 밤새 둡니다.
참고 : 스텐실 - 하이드로 겔 접촉이 단단하고 지하 막 매트릭스 단백질 용액 농도가 최적일 때, 지하 막 매트릭스 단백질 용액은 격리되고 스텐실 의 상단에 남아있을 것입니다(그림 3H). 최적화 시 배양 시간을 줄일 수 있습니다. 이론적으로, 그것은 30 분-2 h로 줄일 수 있습니다. - 다음 날, 하이드로겔을 6웰 플레이트에 옮기고 PBS에 완전히 담급전시다.
참고: 하이드로겔이 스텐실에 찢어지거나 달라붙는 것을 방지하기 위해 커버슬립 위에 PBS가 침지된 스텐실을 벗기는 것이 좋습니다. - 하이드로겔을 찢지 않고 오토클레이브 핀셋을 사용하여 스텐실을 조심스럽게 제거하십시오. DMEM으로 잘 다시 중단하고, 패턴 하이드로겔을 인큐베이터에 반납하고, 오염을 테스트하기 위해 밤새 방치하십시오.
- 용지가 선명하게 유지되면 하이드로겔을 셀 도금에 사용할 준비가 된 것입니다. 각 용도에 대해 세포의 부착을 허용하도록 세포 도금 밀도 및 배양 시간을 최적화합니다.
참고 : hiPSC-CM의 단일 세포 패터닝을 위해 하룻밤 동안 종자 및 배양하십시오. 시드에는 30,000개, 60,000개, 90,000개의 셀/웰이 권장됩니다. 너무 많은 세포를 파종하면 패턴당 하나 이상의 셀이 발생합니다. 세포 스트레이너는 세포 파종 전에 비 단일 세포를 변형하는 것이 좋습니다. - 다음 날, 세포 부착 및 확산을 관찰하고 분리 된 세포를 제거하기 위해 미디어를 변경하십시오.
9. 사용된 스텐실 청소
- 사용된 스텐실에서 잔류 매트릭스 단백질을 제거하려면 스텐실을 효소 용액(재료표)에37°C에서 10분 동안 담급니다.
참고: 효소는 사용된 매트릭스 단백질에 따라 선택되어야 합니다. 콜라겐이 풍부한 매트릭스 단백질 용액을 원분으로 사용하십시오. 효소 용액의 10-15 분 초음파 처리도 권장됩니다. - 용액을 흡인하고 10 % 표백제로 보충하십시오. 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.
- PBS로 3x 헹구어.
- 사용할 때까지 70% 에탄올을 4°C에서 보관하십시오.
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Representative Results
사각형 또는 사각형의 배열을 포함하는 스텐실의 제조가 입증되었습니다(그림 4A). 이 프로토콜에 이어, 우리는 패턴매트릭스 단백질 군도(도4B 및 도 5A)및 세포(도4C)를수득하였다. 최적이 아닌 매트릭스 단백질 용액 농도는 최적이 아닌 패터닝으로이어졌다(도 5B). 스텐실의 앞면을 사용하는 것이 중요합니다. 스텐실의 후면을 사용하는 경우, 매트릭스 단백질 의 크기는 레이저 절단의 방향에 의해 증가한다(도 6A,B). 직사각형 패턴의 폭은 크게 변하지않았지만(도 6C),스텐실의 후면을 사용할 때 높이가 현저히 증가하여 의도된 종횡비의 감소를 이끌어냈다(도6D,E). 우리는 실리콘 엘라스토머 기판에 스텐실 기반 패터닝을 적용했습니다(그림 7). 실리콘 탄성중합체 기판상에 패턴화된 심근세포는 저배율에서 심장 트로포닌 T의 면역세포화학에 의해 가시화되었다(도7A)및 육종 단백질 α-액티닌을 고배율로(도7B). 스텐실 기반 패터닝은 또한 서로 다른 강성을 가진 하이드로겔에 두 개의 심근세포 패턴을 나란히 적용할 수 있습니다. 시연으로, 우리는 생리학적으로 관련된 강성에 대한 심근세포 패터닝(도8A)및 병리학적으로 관련된 강성을보여준다(그림 8B).
그림 1: 세 가지 골드 표준 마이크로 패턴화 전략의 회로도. (A)포토리소그래피. (B)마이크로 접촉 인쇄. (C)미세 유체 패터닝. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 스텐실 설계 워크플로우. (A)스텐실의 컴퓨터 지원 설계. (B)레이저 컷 폴리이미드 스텐실의 대표적인 사진. (C)스텐실의 대표적인 현미경 이미지. 노란색 영역은 폴리이미드 스텐실을 나타내고 밝은 파란색 영역은 레이저 컷 구멍의 배열을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 하이드로겔 제조 단계의 사진. (A)폴리아크릴아미드 하이드로겔 제조는 두 개의 커버립 사이에 전구체 용액을 끼우고 끼여 서. (B)UV 벤치 램프 아래 폴리 아크릴아미드 하이드로 겔의 UV 광 가교. UV 램프는 사용자 보호를 위해 알루미늄 호일로 덮여 있습니다. (C)한쪽면에 커버슬립을 분리하여 사진가교 하이드로겔을 회수합니다. (D)하이드로겔 시제는 ECM 단백질 혼입용 하이드로겔을 변형시키기 위해 설포-SANPAH 용액과 접촉한다. UV 활성화 전에 설포-산파는 주황색입니다. (e)UV 활성화 후, 설포-산파H가 갈색으로 변하여 하이드로겔 표면에 활성화되고 통합되었음을 나타낸다. (F)하이드로겔을 무균 보풀이 없는 물티슈로 두드리고 남은 물을 제거한 후, 스텐실을 하이드로겔 위에 놓습니다. (G)지하 막 매트릭스 단백질 용액은 스텐실 하이드로겔 구성물 위에 파이펫을 투과한다. (H)스텐실-하이드로겔 접촉이 성공적으로 단단하면 지하 막 매트릭스 단백질 용액이 위에 유지되고 스며들지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 지하 막 매트릭스 단백질 및 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(hiPSC-CM)의 미세 패터닝은 서로 다른 직사각형 모양을 가진. (A)서로 다른 종횡비의 레이저 컷 직사각형을 포함하는 스텐실의 현미경 이미지(1:1, 4:1, 11:1). (B)하이드로겔 기판상 면역염색 매트릭스 단백질 제도의 대표적인 이미지. (C)핵(청록색) 및 심장 트로포닌 T(마젠타)에 대해 염색된 hiPSC-CM의 대표적인 이미지. 패널 B 및 C의 배율 표시줄 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: ECM 단백질 농도는 적절한 패턴을 생성하는 데 필수적인 역할을 합니다. (a)단일 패턴으로 지하 막 매트릭스 단백질의 매우 균일한 분포를 가진 최적의 농도의 대표적인 이미지. (B)낮은 농도로 인한 최적 매트릭스 단백질 패턴은 밀 배아 애글루틴 염색에 의해 결정된 바와 같이 패턴 내에서 매트릭스 단백질의 패턴 및 낮은 양 내의 매트릭스 단백질의 누설을 야기하였다. 패널 A 및 B의 배율 표시줄 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 스텐실 부작용. (a)스텐실의 전면을 사용했을 때 지하 막 매트릭스 단백질 패턴을 사용하였다. (B)스텐실의 후면을 사용했을 때 지하 막 매트릭스 단백질 패턴을 사용하였다. 정량화(C)폭,(D)높이,(E)직사각형 지하 막 매트릭스 단백질 섬의 종횡비. 그래프는 평균 ± SEM. 통계는 짝이 없는 학생 T 시험에 의해 계산됩니다. n.s. = 중요하지 않습니다. = p < 0.0001. 배율 표시줄 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 실리콘 엘라스토머 기판에 스텐실 기반 패터닝. (A)저배율로 심장 마커, 심장 트로포닌 T(cTnT)에 의해 염색된 실리콘 탄성중합체 기질상에 대한 단세포 패턴 심근세포의 대표적인 이미지. 스케일 바 = 300 μm.(B)고배율에서 육종 단백질 α-액티닌에 의해 염색된 대표적인 단세포 패턴 심근세포. 배율 표시줄 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 다른 강성을 가진 폴리아크릴아미드 하이드로겔에 hiPSC-CM의 미세 패터닝. (A)10 kPa,(B)60 kPa. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 단계 | 관찰된 문제 | 가능한 이유 | 솔루션 |
| 1.1 | 패턴 크기가 예상보다 큽 | 스텐실이 뒤집히게 됩니다. | 스텐실 디자인에 키랄 문자/모양을 포함하여 스텐실의 앞면과 뒷면을 나타냅니다. |
| 8.1 | 스텐실을 벗길 때 하이드로겔 골절 | 스텐실에 하이드로겔 스틱 | 스텐실 청소 |
| 스텐실을 넣기 전에 하이드로겔을 너무 건조시키지 마십시오. | |||
| 8.13 | 셀 부착이 최적이 아닙니다. | 분해 된 설포 -SANPAH | 새로운 설포-산파 사용 |
| 비효율적인 단백질 혼입 | 새로운 ECM 단백질 용액 준비 | ||
| 오래된 ECM 단백질 용액 | |||
| 8.13 | 셀 패터닝이 최적이 아닙니다. | 지하 막 매트릭스 단백질 용액 유출 | 하이드로겔에 지하 막 매트릭스 단백질 용액의 분포를 검사하기 위해 형광 공형 항체 IgG 항체 또는 밀 배아 응집틴을 사용하여 면역 염색을 수행 |
| 8.13 | 하나의 슬롯에 두 개 이상의 셀 | 단일 셀 현탁액에 포함되지 않음 | 40-70 μm 셀 스트레이너를 사용하여 단일 세포 현탁액을 갖습니다. |
| 시딩 밀도가 최적이지 않음 | mL당 30k ~ 90k의 시딩 밀도 최적화 |
표 1: 문제 해결 지침. 빈번한 문제, 가능한 이유 및 잠재적인 해결 방안이 논의됩니다.
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Discussion
우리는 부착 세포의 효과적인 패터닝을 가능하게 하는 리소그래피 없는 스텐실 기반 마이크로패터닝 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에서는 생리학적 또는 병리학적으로 관련된 조직 강성 또는 실리콘 기반 탄성중합체 기질을 가진 폴리아크릴아미드 하이드로겔의 미세 패턴화 지하 막 매트릭스 단백질 섬에 의해 서로 다른 길이 대 폭 비율로 hiPSC-CM의 패터닝을 시연합니다. 이 방법은 포토리소그래피 및 미세 제작 기술에 대한 배경 지식이 거의 없는 연구자들을 포함하여 모든 연구자들에게 비교적 간단하고 접근성이 높습니다. 설명된 방법은 부드러운 리소그래피를 사용하여 스탬프를 생성하고 마이크로 접촉 인쇄 기술에 관련된 관심 기판으로 단백질을 전송하는 것과 관련된 중요한 문제를 우회합니다. 이 프로토콜은 1) 비용 효율적인 방식으로 관심 영역과 모양의 사용자 정의 설계된 스텐실을 만드는 워크플로우를 제공합니다. 2) 관심의 강성을 가진 하이드로겔 기판을 제조; 및 3) 하이드로겔 기판에 ECM 단백질을 효율적으로 컨쥬게이트한다.
전통적인 연질 리소그래피 방법은 실리콘 계 재료 및 유리 커버립13,,14와같은 상이한 물질의 기판에 삼각형 및 별을 포함한 ECM 단백질의 다양한 모양을 패터닝하는 데 사용되어 왔다. 이 연구에서는 심근세포의 생리학적 및 병리학적으로 관련된 모양을 감안할 때 직사각형 패턴만 을 보여줍니다. 우리는 다른 복잡한 모양의 스텐실 기반 패터닝이 형상의 가장 작은 특징이 해상도 (~10 μm)를 초과하지 않는 한 작동 할 수 있다고 믿습니다. 기판 재료에 관해서는, 스텐실 계 패터닝이 하이드로겔에 적용될 수 있음을 입증한다(도2, 도 3, 도 4, 도 5,도 6 및 도 6)또는 실리콘 계 탄성중합체 기질(도7). Figure 6 제시된 방법은 폴리이미드 계 스텐실과 이러한 기판 사이의 단단한 밀봉이 이루어지지 않기 때문에 조직 배양 플라스틱 및 유리 커버슬립과 같은 폴리이미드 물질에 최소한의 접착제로 기판에서 작동하지 않는다. 밀폐를 위해서는 추가적인 표면 수정이 필요합니다. 마지막으로, 이 방법은 상이한 강성을 가진 하이드로겔(즉, 10 kPa, 60 kPa)에 대한 세포 쌍 패턴을 안정적으로 생성하는데 사용될 수 있음을보여준다(그림 8).
프로토콜에서 가장 중요한 단계는 ECM 단백질 농도의 최적화(프로토콜 섹션 6)입니다. 이 단계의 목적은 스텐실의 구멍을 통해 스며드는 단백질 용액을 억제할 수 있을 정도로 점성이 있는 ECM 단백질의 최적 농도를 찾는 것이지만, 너무 농축되지는 않지만, 겔화를 피하기 위한것이다(도 5). 이러한 스텐실 계 방법은 ECM 단백질의 종류를 제한하지 않는다. 점성이 있는 ECM 단백질 용액은 스텐실 의 상단에 머무를 가능성이 더 높지만, 점성 단백질을 덜 사용할 수도 있습니다. 한 가지 요구 사항은 스텐실 및 PA 하이드로겔의 표면이 상대적으로 안정적인 소수성 계면을 형성할 만큼 충분히 건조되어 있는지 확인하는 것입니다. 본 데모에서, 지하 막 매트릭스 단백질은 점성이 있고 hiPSC-CM배양에 적합하기 때문에 사용되었다. 그러나, 다른 ECM 단백질은 아마도 사용될 수 있다(예를 들어, 피브로넥틴, 젤라틴, 콜라겐, 라미닌).
주어진 각 적용에 대한 ECM 단백질 용액의 최적화 뿐만 아니라, 스텐실과 하이드로겔 표면 사이에 적절한 밀봉을 생성하는 것은 ECM 단백질을 가진 정확한 패턴을 얻기 위해 매우 중요하다. 과도한 건조는 하이드로겔의 파열로 이어질 수 있기 때문에 스텐실을 과도하게 건조시키지 않는 것이 필수적입니다. 이 단계 (즉, 하이드로 겔에 스텐실을 배치하고 나중에 부드럽게 피글링)은 몇 가지 연습이 필요합니다. 주어진 각 조건에 대한 최적의 처리 절차를 수립하면 하이드로겔이 스텐실에 달라붙는 것을 피할 수 있습니다. 이 최적화를 통해 레이저 절단의 결함으로 인한 서브마이크론 스케일 레이저 화상은 하이드로겔 손상과 관련하여 기술에 실질적으로 영향을 미치지 않습니다.
또 다른 중요한 단계는 하이드로겔 기판 에 스텐실을 배치할 때 스텐실의 전면을 사용하는 것입니다. 우리는 각 측면의 사용이 아마도 레이저 절단으로 인해 기판에 영향을 미친다는 것을 발견했습니다(그림 6). 처음으로 특정 크기 또는 모양의 셀을 패터닝할 때 권장 사항 중 하나는 최적화 스텐실을 생성하는 것입니다. 스텐실 설계 피쳐가 최종 패턴 셀 크기와 반드시 일치하지는 않습니다. 피쳐 크기의 그라데이션이 포함된 최적화 스텐실을 생성하는 것이 좋습니다. 문제 해결에 도움이 되는 잠재적인 문제와 가능한 해결 방법을 나열하는 표를준비했습니다(표 1).
이 원고에 언급 된 동일한 마이크로 제작 회사를 사용할 필요는 없습니다. 스텐실의 정확한 생성키는 레이저의 빔 직경과 스텐실 필름의 두께, 우리의 경우 폴리이미드 (50 μm)입니다. 우리는 적절한 레이저가 장착 된 레이저 실험실이 몇 단계의 스텐실을 생성 할 수 있다고 생각, 레이저 강도를 최적화, 정렬, 및 기타 변수. 우리는 단지 하나의 회사와 함께 일했지만, 정밀 레이저 절단을 수행하는 많은 사용 가능한 회사가있다.
이 메서드의 제한은 해결입니다. 포토리소그래피는 나노 스케일 분해능을 달성할 수 있지만, 스텐실 기반 패터닝 해상도는 폴리이미드 스텐실의 레이저 절단 해상도로 제한되며, 현재까지 는 보통 몇 미크론(~10 μm)의 규모로 진행됩니다. 그럼에도 불구하고, 평균 세포 크기가 10 μm 이상임을 감안할 때, 해상도는 일반적으로 임의의 단일 세포 패터닝에 적용가능하다.
요약하면, 이 방법은 세포-ECM 상호 작용을 연구하고, 세포 구조-기능 상관 관계 및 기타 여러 응용 프로그램을 검사하기 위한 다양한 플랫폼을 제공합니다. 우리는 이 프로토콜이 많은 생물 의학 연구자에게 유익하고 단세포 연구를 촉진할 것이라는 점을 믿습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 스탠포드 아동 건강 연구소 (CHRI)와 건강의 국립 연구소 (1F32HL142205-01)에서 S.L에 박사 후 펠로우십에 의해 지원되었다, NIH 이사의 개척자 상 (LM012179-03), 미국 심장 협회 설립 조사자 상 (17EIA33410923), 스탠포드 심장 혈관 연구소, 호프만과 슈로퍼 재단, 그리고 심장 혈관 의학의 스탠포드 부서, S.M.W에 의학부 , 국립 보건원 (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL113968) 및 담배 관련 질병 연구 프로그램 (TRDRP 27IR-0012) J.C.W, 미국 심장 협회 (AHA) 박사 후 펠로우십 상 (18POST34030106) H.Y. 우리는 마이크로 패턴 hiPSC-CM의 공초점 화상 진찰의 지원에 스탠포드 신경 과학 현미경 검사법 서비스에서 박사 앤드류 올슨 에게 감사드립니다. 우리는 폴리 아크릴아미드 하이드로 겔 코팅 커버 슬립에 iPSC-CM의 첫 번째 스텐실 디자인, 제조, 단일 세포 마이크로 패터닝, 단일 세포 마이크로 패턴 iPSC-CM의 sarcomere 구조의 예비 공초점 이미징에 대한 H.Y.에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder) | Sigma-Aldrich | 516155 | |
| Acrylamide solution 40% (solution) | Sigma-Aldrich | A-4058-100mL | |
| Bench UV lamp 365 nm | UVP | UVP 95-0042-07, XX-15L | |
| BioFlex culture plate | FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC | 6-well plate with silicon elastomer substrate | |
| Bis-acrylamide solution 2% (solution) | Sigma-Aldrich | M1533-25mL | |
| Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm | Sigma | CLS285522 | |
| Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder) | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | basement membrane matrix protein solution |
| Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics | Acros Organics | 326881000 | |
| Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane | Millipore | SLGV013SL | |
| Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm) | Fisher Scientific | SCGP00525 | |
| Stencils | Potomac | custom design | |
| Sulfo-SANPAH | ThermoFisher Scientific | 22589 | |
| TrypLE Select 10x | ThermoFisher Scientific | A1217702 | Enzyme used for stencil cleaning |
References
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