Summary
Este protocolo introduz um método de micropadronização livre de litografia que é simples e acessível para aqueles com um fundo de bioengenharia limitado. Este método utiliza estêncil personalizado de corte a laser para micropadrão proteínas de matriz extracelular em uma forma de interesse para modulação de morfologias celulares. O procedimento de micropadronização é demonstrado usando cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas.
Abstract
As técnicas de micropadronização têm sido amplamente utilizadas na biologia celular para estudar efeitos do controle da forma e do tamanho das células na determinação do destino celular na resolução de uma única célula. As técnicas atuais de micropadronização de células únicas de última geração envolvem litografia suave e impressão de micro-contato, que é uma tecnologia poderosa, mas requer habilidades de engenharia treinadas e certo suporte de instalações na microfabricação. Essas limitações requerem uma técnica mais acessível. Aqui, descrevemos um método alternativo sem litografia: padronização de células simples baseadas em estêncil. Fornecemos procedimentos passo a passo, incluindo design de estêncil, fabricação de hidrogel de poliacrilamida, incorporação de proteína à base de estêncil e revestimento celular e cultura. Este método simples pode ser usado para padronizar uma matriz de até 2.000 células. Demonstramos a padronização de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos únicos (hiPSC) com formas celulares distintas, de um quadrado de 1:1 a um retângulo adulto semelhante a cardiomiócitos de 7:1. Esta padronização de células únicas baseada em estêncil é livre de litografia, tecnicamente robusta, conveniente, barata e, mais importante, acessível àqueles com um fundo de bioengenharia limitado.
Introduction
O advento dos hiPSCs e o subsequente desenvolvimento de protocolos para sua diferenciação direcionada em diferentes tipos celulares permitiram estudar o desenvolvimento e a doença em nível molecular e específico do paciente, especificamente utilizando cardiomiócitos iPSC derivados do paciente (iPSC-CMs) para modelar cardiomiopatias1,2. No entanto, uma grande limitação ao estudo do desenvolvimento e fisiologia utilizando o sistema iPSC e outros modelos in vitro é a ausência de um microambiente estruturado. In situ, as células são submetidas às restrições da matriz extracelular (ECM), bem como das células vizinhas. A composição bioquímica particular e a rigidez desses microambientes ditam a distribuição espacial das células, bem como os fatores disponíveis para o engajamento na adesão celular. Isso, por sua vez, influencia caminhos de sinalização intracelular, expressão genética e determinação do destino celular. Por exemplo, o iPSC-CM micropadronizado em forma de haste adulta tem uma capacidade de contração significativamente melhor, fluxo de cálcio, organização mitocondrial, eletrofisiologia e formação transversal-túbula3. Assim, as propriedades do microambiente são integrais na regulação das funções celulares.
As técnicas anteriores de micropadronização se baseavam fortemente na fotolitografia (Figura 1A). Nesta técnica, uma camada de polímero fotossensível, ou fotoresist, é girada sobre um substrato plano da solução para formar uma película fina de cerca de 1 μm de espessura. Em seguida, a luz ultravioleta (UV) é aplicada na fotoresiste através de uma máscara contendo o padrão desejado. A exposição à luz ultravioleta (UV) altera quimicamente a fotoresiste modificando sua solubilidade em sua respectiva solução de desenvolvedor, transferindo o padrão desejado da máscara para o substrato. Muitos métodos de micropadronização incorporam a fotolitografia, pois confere nanômetro ao controle de nível de micrômetro sobre o design dos padrões celulares. No entanto, o giro da fotoresistência é altamente sensível às impurezas, porque as menores partículas de poeira interromperão a propagação da solução em um filme fino. A fotolitografia deve, portanto, ser realizada em instalações não contaminadas, que são caras para manter e requerem especial perícia para utilizar. Além disso, os produtos químicos usados na fotolitografia são muitas vezes tóxicos para as células e podem desnaturar biomoléculas importantes. Assim, a fotolitografia coloca obstáculos significativos à fabricação de micropadrões para aplicações biológicas convenientes.
Em 1994, Whitesides e colegas4 superaram alguns dos desafios associados à fotolitografia ao pioneirismo de uma coleção de técnicas chamada litografia suave. Na litografia macia, uma superfície microestruturada feita com polidimetilsiloxano (PDMS), um material transparente, semelhante à borracha, é usada para gerar um padrão de proteínas ECM4. Técnicas litográficas macias comuns incluem impressão de microcontato e padronização microfluida. Na impressão por microcontato, atualmente o método litográfico macio mais popular, um selo PDMS revestido com proteínas ECM transfere o material para uma superfície nas áreas contatadas pelo selo(Figura 1B). Na padronização microfluida, as microestruturas são projetadas em uma superfície PDMS de tal forma que quando o selo é pressionado para um substrato, uma rede de microcanais, através da qual os fluidos podem ser entregues às áreas desejadas, é criada (Figura 1C)5. A litografia suave oferece vários benefícios sobre a fotolitografia. Uma vez que um wafer mestre é microfabricado, os selos PDMS podem ser facilmente replicados sem maior emprego de instalações de quarto limpo. Além disso, a ausência de solventes orgânicos no processo de litografia macia permite a utilização de materiais poliméricos como o poliestireno, normalmente utilizado na cultura celular. Finalmente, a micropadronização usando métodos litográficos macios não se restringe a superfícies planas. Assim, a litografia suave aumenta a acessibilidade e funcionalidade da fabricação de micropadrões sobre a fotolitografia6. No entanto, a litografia suave tem desvantagens significativas. Por exemplo, um passo inicial de gravação, usando fotolitografia, ainda é necessário para microfabricar o selo. Além disso, a micropadronização utilizando um selo PDMS está sujeita a variações na qualidade da transferência de proteínas para o substrato6. Evitar essas discrepâncias requer otimização e consistência na pressão aplicada ao selo PDMS durante a transferência de proteínas, caso contrário, a deformação e distorção dos tamanhos de recurso dos moldes PDMS podem ocorrer6. Há também uma grande preocupação em usar repetidamente o PDMS devido à absorção de pequenas moléculas7.
Para evitar o uso de selos de fotolitografia macia e PDMS, descrevemos um método de micropadronização de células únicas sem litografia, baseado em estêncil, livre de litografia, que supera muitos dos obstáculos associados à fotolitografia e à litografia suave. Neste método, um hidrogel de poliacrilamida é usado como substrato para incorporação de proteína stencil à base de ECM, permitindo o revestimento seletivo de hº-CMs únicos. Esta técnica é altamente compatível com materiais poliméricos usados em condições clássicas de cultura celular. Além disso, com a limpeza e manutenção adequadas, os estêncil são reutilizáveis e resistentes à degradação e absorção de proteínas durante o processo de microfabricação. Finalmente, o processo de padronização é tecnicamente robusto, barato, personalizável e acessível àqueles sem habilidades especializadas em bioengenharia. Esta técnica de micropadronização baseada em estêncil tem sido amplamente utilizada em nossas publicações recentes modelando cardiomiopatias variadas8,9,10.
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Protocol
1. Fabricação de estêncil à base de poliimida padrão negativo
- Gerar um padrão(Figura 2A)no formato .dxf usando software de design auxiliado por computador (por exemplo, AutoCAD, SolidWorks, Onshape, Adobe Illustrator).
- Gerar um círculo (diâmetro = 22 mm) para delinear a borda do estêncil.
- Desenhe uma forma sólida ou o padrão desejado.
- Inclua uma letra quiral (por exemplo, R) para marcar o lado frontal dos estêncil.
NOTA: Como exemplo, uma matriz de quadrados e retângulos é gerada para padronizar iPSC-CMs em níveis de uma única célula e par de células. Os arquivos de design estão disponíveis (consulte Arquivos Suplementares). O limite de resolução de microfabricação é de ~10 μm.
- Submeta o design a uma empresa de microfabricação para filme de poliimida a laser e fabricar estêncil(Figura 2B,C).
2. Preparação das alíquotas sulfo-SANPAH
NOTA: O protocolo é modificado a partir de Fischer et al.11.
- Use uma caixa de armazenamento de amostra de papelão resistente à umidade (por exemplo, 100 bem, 10 x 10 espaços para tubos de centrífuga, dimensões: 13,4 cm x 13,4 cm x 5,1 cm). Rotule-o como "nome/data/sulfo-SANPAH 40 μL/reconstituído com 1.200 μL de PBS".
- Etiqueta50 tubos de microcentrifugação (polipropileno, 1,5 mL) com um 'S' na tampa.
- Pegue 4 mL de sulfóxido de dimetila anidro,extra seco (DMSO) e filtro estéril a solução usando uma unidade de filtro de membrana (tamanho dos poros = 0,22 μm) em um tubo cônico estéril de 15 mL.
- Prepare um banho de nitrogênio líquido e cubra com a tampa para minimizar a evaporação do nitrogênio líquido.
- Dissolver 50 mg de sulfo-SANPAH em 2 mL do DMSO filtrado.
- O vórtice bem para dissolver totalmente o sulfo-SANPAH no DMSO.
- Distribua as alíquotas de 40 μL da solução sulfo-SANPAH em tubos estéreis de 1,5 mL.
- Transfira os tubos para a caixa.
- Congele os tubos em nitrogênio líquido por 5 min.
- Armazene as alíquotas a -80 °C.
NOTA: As alíquotas podem ser usadas por até 6 meses sem eficiência reduzida. A concentração de sulfo-SANPAH é de 25 mg/mL ou 50,77 mM.
3. Esterilização de ferramentas
- Autoclave dois fórceps, 24 tampas de vidro (22 x 22 mm, nº 1 ou nº 1.5), uma lâmina de barbear e três lenços absorventes sem fiapos.
NOTA: Para fazer 12 construções de hidrogel, são necessárias 24 tampas de vidro. Deve haver dois coverslips por construção. É aconselhável preparar alguns deslizamentos de cobertura sobressalentes. - Coloque duas peças de filme de parafina (4 x 4 polegadas) em uma caixa de plástico resistente ao etanol (por exemplo, uma caixa de ponta de pipeta de 1.000 μL) e esterilize-as em etanol fresco por pelo menos 15 min.
4. Preparação da solução precursora do hidrogel de poliacrilamida
NOTA: O protocolo é modificado a partir de Lee et al.12.
- Dissolver 125 mg de metacrilato de aminoetila (AEM) em 36,25 mL de água deionizada em um tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mL por vórtice.
- Para preparar 50 mL de solução precursora de poliacrilamida de 10 kPa (8-0,15-15 mM), misture 10 mL de solução de 40% de acrilamida, 3,75 mL de solução de 2% de bis-acrilamida e 36,25 mL da solução AEM preparada na etapa 4.1 em um novo tubo de polipropileno centrípileo de 50 mL.
NOTA: A concentração final da solução precursora é 8% de acrilamida, 0,15% de bis-acrilamida e 15 mM AEM, que foi medida para ter ~10 kPa de rigidez por microscopia de força atômica. De acordo com as aplicações teciduais de interesse, a rigidez do hidrogel pode ser alterada alterando a razão da acrilamida de 40% para a solução de 2% de bis-acrilamida. Por exemplo, 8% de solução de acrilamida -0,08% de bis-acrilamida produz hidrogéis de 3 kPa; 8% de solução de acrilamida -0,48% bis-acrilamida produz 38 hidrogéis kPa; 8% de solução de acrilamida -0,48% de bis-acrilamida produz hidrogéis de 60 kPa. É aconselhável confirmar a rigidez dos hidrogéis feitos a partir das soluções precursoras com proporções alteradas.
5. Preparação da solução fotoinitada
- Para 1 mL de solução fotoiniciada de 5%, primeiro dissolva 50 mgs de 2-hidroxi-4'-(2-hidroxyethoxy)-2-metilpropiophenone em pó de 700 μL de 100% de etanol em um tubo de centrífuga de polipropileno de 1,5 mL com tampa.
NOTA: 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-metilpropiophenonenoa não é solúvel em água. Certifique-se de dissolver totalmente o pó no etanol, vórticendo. - Depois de dissolver completamente o 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-metilpropiophenone no etanol por vórtice, adicione 300 μL de solução salina tamponada por fosfato (PBS) para um volume final de 1 mL.
NOTA: A concentração final da solução 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-metilpropiophenone é de 5%. A solução fotoinciador de 5% frustrada é boa para 4 semanas a 4 °C.
6. Preparação da solução proteica da matriz da membrana do porão
NOTA: A matriz da membrana do porão(Table of Materials)é um material sensível à temperatura. Certifique-se de trabalhar no gelo com pontas e tubos de pipeta refrigeradas, bem como soluções geladas. Um novo estoque de matriz de membrana de porão deve ser descongelado lentamente no gelo a 4 °C durante a noite.
- Prepare 200 μL de solução de proteína de membrana de porão por construção de hidrogel. Para 12 construções, são necessários 2,4 mL de solução proteica de membrana de porão. Prepare 10% de solução extra (por exemplo, 2,6 mL).
- Para cada novo lote/lote de solução de proteína de membrana de membrana de porão, otimize a razão de diluição. Pela primeira vez, teste as razões de diluição de 1:10, 1:20, 1:40 para encontrar a razão de diluição que produz as melhores qualidades para a padronização celular.
NOTA: Se a solução de proteína da matriz da membrana do porão for muito viscosa, ela formará um gel em cima do estêncil, e é mais provável que se descasque ao remover o estêncil. Se a solução proteica for muito fluida, ela penetrará através dos orifícios padrão dos estêncil, o que resultará em uma padronização de má qualidade. - Diluir a solução de proteína da matriz da membrana do porão no gelo com a mistura de proteína salina/nutriente salina de Dulbecco Modificada F-12 (DMEM/F12) ou 1x PBS para a razão de diluição otimizada acima. Por exemplo, diluir 120 μL da solução de estoque em 2,4 mL de mídia DMEM/F12 (1:20) e manter no gelo para uso posterior.
7. Fabricação de hidrogel
- Coloque uma lâmpada de banco UV (365 nm, 4 mW/cm2) em uma capa de segurança biológica.
- Coloque as pelídeas de parafina esterilizadas a partir do passo 3.2 e seque completamente em condições estéreis. Se as películas de parafina não estiverem completamente secas, use um sistema de aspiração a vácuo para remover qualquer líquido residual. Coloque seis tampas autoclaved do passo 3.1 em cada filme de parafina usando os fórceps autoclaved.
- Prepare a solução precursora de poliacrilamida uv-crosslinkable diluindo a solução fotoinitatória de 5% (etapa 5.2) com solução precursora de poliacrilamida (etapa 4.2) em um tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mL. Para 5 mL de solução precursora de poliacrilamida uv-crosslinkable, adicione 50 μL de solução fotoinitada de 5% a 5 mL de solução precursora de poliacrilamida.
- Filtrar a solução precursora da etapa 7.3 usando uma unidade de filtro de 50 mL com um tamanho de poros de 0,22 μm para esterilização.
NOTA: Prepare sempre uma nova solução precursora. - Dispense 200 μL de solução precursora de poliacrilamida do passo 7.4 em cada deslizamento de tampa de vidro de 22 x 22 mm na placa de Petri filmada parafina e cubra cuidadosamente com outro deslizamento de cobertura de vidro de 22 x 22 mm na parte superior para sanduíche a solução no meio(Figura 3A).
NOTA: A filme de parafina é usada para evitar derramamentos e para limitar a solução precursora entre as tampas. - Coloque a placa de Petri contendo deslizamento de cobertura do passo 7.5 sob a lâmpada de banco UV e fotopolimerize os hidrogéis de poliacrilamida por 5 min(Figura 3B).
NOTA: Se a superfície não for branca, a absorção UV da superfície reduz a eficiência de photocrosslinking. A cobertura do papel branco na superfície não branca é importante para minimizar a perda de intensidade UV. Para proteger contra radiação UV, cubra a lâmpada com papel alumínio e use óculos de proteção UV. - Desgrudar cuidadosamente uma tampa da outra usando uma lâmina de barbear por ação de alavancagem(Figura 3C).
NOTA: O hidrogel geralmente gruda na tampa superior. Preste atenção extra ao separar o deslizamento de cobertura do hidrogel macio, pois é provável que quebre. - Encha um reservatório descartável de polipropileno com PBS. Transfira os compostos de deslizamento de hidrogel em um reservatório contendo PBS para enxaguar os hidrogéis em PBS por 5 min. Depois de enxaguar, coloque a construção de hidrogel de volta no filme de parafina na placa de Petri.
8. Conjugação de proteínas
- Prepare um balde de gelo e pbs pré-cool.
NOTA: Para seis hidrogéis, são necessários 1.200 μL de PBS frio. - Tire a alíquota sulfo-SANPAH (1 frasco = 6 géis).
NOTA: Se necessário, a quantidade de sulfo-SANPAH utilizada pode ser reduzida após a otimização. - Adicione 1.200 μL de PBS frio em um frasco de alíquota sulfo-SANPAH e misture encanando para cima e para baixo.
- Dispense 200 μL de sulfo-SANPAH na película de parafina na placa de Petri e cubra com o composto de hidrogel com hidrogel entrando em contato com sulfo-SANPAH (Figura 3D).
NOTA: Sulfo-SANPAH é muito suscetível à água devido à hidrólise. Descongele recentemente a partir de -80 °C logo antes do uso. Não reutilize ou congele novamente as sobras. - Exponha o hidrogel à lâmpada UV a 365 nm, 4 mW/cm2 por 5 min para ativar sulfo-SANPAH.
NOTA: Após a exposição, o sulfo-SANPAH mudará de laranja para marrom (Figura 3E). Se o hidrogel ficar marrom, indica ativação bem sucedida do grupo de azida fenil de sulfo-SANPAH e incorporação de sulfo-SANPAH no hidrogel. Proceder diretamente com as etapas 8.6-8.9 dentro de um máximo de 10 minutos, pois a atividade do sulfo-SANPAH diminuirá. - Reponha um reservatório descartável de polipropileno com PBS fresco. Após a ativação sulfo-SANPAH, transfira os hidrogéis ativados e enxágue rapidamente os hidrogéis em um reservatório PBS para remover sulfo-SANPAH não atado.
NOTA: Uma lavagem longa pode resultar em baixa eficiência de conjugação de proteínas. - Depois de uma lavagem rápida, coloque as tampas de hidrogel no filme de parafina nas placas de Petri e cuidadosamente dab os hidrogéis com lenços sem fiapos estéreis.
NOTA: O restante da PBS no topo do hidrogel resultará em vazamento da solução de proteína da matriz da membrana do porão através do estêncil, e a secagem muito extensiva levará à ruptura do hidrogel após a remoção do estêncil devido à alta adesão ao estêncil. - Coloque o estêncil sobre os hidrogéis e a dab com lenços livres de fiapos autoclavos para garantir uma vedação apertada entre o estêncil e o hidrogel(Figura 3F).
- Dispense cuidadosamente 200 μL da solução de proteína da matriz de membrana do porão diluída preparada a partir da etapa 6.3 (Figura 3G) em cima. Deixe durante a noite na incubadora (37 °C).
NOTA: Quando o contato estêncil-hidrogel é apertado e a concentração da solução de proteína da membrana do porão é ótima, a solução de proteína da membrana do porão será seqüepara e permanecerá em cima do estêncil(Figura 3H). O tempo de incubação pode ser reduzido após a otimização. Teoricamente, pode ser reduzido para 30 min-2 h. - No dia seguinte, transfira os hidrogéis para uma placa de 6 poços e mergulhe-os totalmente em PBS.
NOTA: Recomenda-se retirar o estêncil com imersão PBS sobre o deslizamento de cobertura para evitar rasgar e grudar o hidrogel no estêncil. - Remova cuidadosamente o estêncil usando pinças autoclaved sem rasgar o hidrogel. Ressuspensa bem com o DMEM, devolva os hidrogéis padronizados para a incubadora e deixe-os durante a noite para testar qualquer contaminação.
- Se a mídia permanecer clara, os hidrogéis estão prontos para serem usados para chapeamento celular. Otimizar a densidade de chapeamento celular e o tempo de incubação para permitir a adesão das células para as respectivas aplicações.
NOTA: Para padronização de células únicas de hiPSC-CMs, sementes e incubar durante a noite. Os seguintes números de células são recomendados para semeação: 30.000, 60.000 e 90.000 células/bem. Semeader muitas células leva a mais de uma célula por padrão. Recomenda-se um coador celular para escoar células não únicas antes da semeada celular. - No dia seguinte, observe o apego celular e a propagação, e mude a mídia para se livrar das células separadas.
9. Limpeza dos estêncil usados
- Para remover proteínas de matriz residual nos estêncil usados, mergulhe os estêncil na solução enzimática(Tabela de Materiais)por 10 minutos a 37 °C.
NOTA: A enzima deve ser selecionada dependendo das proteínas matriciais utilizadas. Para solução de proteína matricial rica em colágeno, use colagemnase. Recomenda-se também uma ultrassonação de 10 a 15 min em solução enzimática. - Apiratee a solução e reponha com 10% de alvejante. Incubar por 10 min em temperatura ambiente.
- Enxágüe 3x com PBS.
- Guarde em 70% de etanol a 4 °C até o uso.
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Representative Results
Foi demonstrada a fabricação de estêncil contendo uma matriz de quadrados ou retângulos (Figura 4A). Seguindo este protocolo, obtivemos ilhas de proteína matricial padronizadas (Figura 4B e Figura 5A) e células(Figura 4C). A concentração de solução de proteína matricial subótima levou a uma padronização subótima(Figura 5B). É fundamental usar a parte frontal do estêncil. Se for utilizada a parte traseira do estêncil, o tamanho das ilhas de proteína satricia aumenta devido à direção do corte a laser(Figura 6A,B). Embora a largura dos padrões retangulares não tenha aumentado significativamente(Figura 6C),a altura aumentou significativamente ao usar a parte traseira do estêncil, levando a uma redução na razão de aspecto pretendida(Figura 6D,E). Aplicamos padronagem à base de estêncil aos substratos de elastômero de silício(Figura 7). Os cardiomiócitos padronizados nos substratos de elastômeros de silício foram visualizados pela imunocitoquímica da troponina cardíaca T em baixa ampliação(Figura 7A)e proteína sarcomérica α-actinina em alta ampliação(Figura 7B). A padronização à base de estêncil também pode ser aplicada ao padrão dois cardiomiócitos lado a lado em hidrogéis com diferentes rigidezs. Como demonstração, mostramos a padronização cardiomiocito sobre rigidez fisiologicamente relevante(Figura 8A)e rigidez patologicamente relevante(Figura 8B).
Figura 1: Esquema de três estratégias de micropadronização padrão-ouro. Fotolitografia.A (B) Impressão de microcontato. (C) Padronização microfluida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fluxo de trabalho de estêncil de projeto. (A)O design assistido por computador do estêncil. (B) Uma fotografia representativa de um estêncil de poliimida cortado a laser. (C) Uma imagem microscópica representativa de um estêncil. A área amarela representa o estêncil de poliimida, enquanto a área azul clara representa uma série de buracos cortados a laser. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Fotografias de etapas de fabricação de hidrogel. (A) Fabricação de hidrogel de poliacrilamida, sanduiche a solução precursora entre duas tampas. (B) Foto-crosslinking UV de hidrogéis de poliacrilamida sob a lâmpada de banco UV. A lâmpada UV é coberta com papel alumínio para proteção do usuário. (C) O hidrogel foto-crosslinked é recuperado desacoplado por um deslizamento de cobertura de um lado. (D) A construção de hidrogel está em contato com a solução sulfo-SANPAH para modificar o hidrogel para incorporação de proteínas ECM. Antes da ativação uv, o sulfo-SANPAH é laranja. (E) Após a ativação uv, o sulfo-SANPAH fica marrom, indicando que está ativado e incorporado na superfície do hidrogel. (F) Depois de colocar o hidrogel com lenços umedecidos estéreis livres de fiapos para remover o excesso de água, o estêncil é colocado sobre o hidrogel. (G)A solução de proteína da matriz da membrana porão é pipetada sobre os construtos de estêncil-hidrogel. (H)Se o contato estêncil-hidrogel for apertado com sucesso, a solução de proteína da matriz da membrana do porão permanecerá em cima e não se infiltrará. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Micropadronização de proteínas da matriz de membrana do porão e cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco induzidas pelo homem (hiPSC-CMs) com diferentes formas retangulares. (A) Imagens microscópicas de estêncil contendo retângulos cortados a laser com diferentes proporções (1:1, 4:1, 11:1). (B) Imagens representativas de ilhas de proteína matricial imunossacada em substratos de hidrogel. (C) Imagens representativas de hiPSC-CMs manchados para núcleos (ciano) e troponina cardíaca T (magenta). Barra de escala = 20 μm para os painéis B e C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: A concentração de proteína scm desempenha um papel essencial na geração de padrões adequados. (A) Imagem representativa de uma concentração ótima com distribuição muito homogênea de proteínas da matriz de membrana de porão nos padrões únicos. (B) Padrões de proteínas matriciais subótimos devido à baixa concentração, o que causou vazamento de proteína sacada fora dos padrões e baixas quantidades de proteínas matriciais dentro dos padrões determinados pela coloração de aglutinina germes de trigo. Barra de escala = 20 μm para os painéis A e B. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Efeito colateral estêncil. (A)Padrões de proteína da matriz da membrana do porão quando foi utilizada a parte frontal do estêncil. (B)Padrões de proteína da matriz da membrana do porão quando foi utilizada a parte traseira do estêncil. Quantificação da largura(C) de largura,(D) altura,(E) proporção de ilhas de proteína sitangular da membrana do porão. Gráfico é plotado média ± SEM. As estatísticas são calculadas pelo teste T do aluno não pareado. n.s. = não significativo. = p < 0,0001. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Padronização à base de estêncil no substrato de elastômeros de silício. (A) Uma imagem representativa de cardiomiócitos padronizados por células únicas em substratos de elastômeros de silício manchados pelo marcador cardíaco, troponina cardíaca T (cTnT), em baixa ampliação. Barra de escala = 300 μm.(B) Um cardiomiócito de padrão unicelular representativo manchado por proteína sarcomérica α-actinina em alta ampliação. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Micropadronização de hiPSC-CMs em hidrogéis de poliacrilamida com diferentes rigidez. (A) 10 kPa, (B) 60 kPa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Passo | Problema observado | Possível razão | Solução |
| 1.1 | O tamanho do padrão é maior do que o esperado | Estêncil é virado | Inclua uma letra/forma quiral no design de estêncil para indicar a parte frontal e traseira dos estêncil |
| 8.1 | Fraturas de hidrogel ao descascar estêncil | Hidrogel gruda em estêncil | Limpeza de estêncil |
| Não seque muito hidrogel antes de colocar estêncil | |||
| 8.13 | O acessório celular é subótimo | Sulfo-SANPAH degradado | Use o novo sulfo-SANPAH |
| Incorporação de proteínas ineficientes | Prepare nova solução de proteína ECM | ||
| Solução antiga de proteína ECM | |||
| 8.13 | A padronização celular é subótima | Solução de proteína de matriz de membrana de porão transborda | Realizar imunocoloração usando anticorpo anti-mouse conjugado com fluoroforo ou aglutinina de germe de trigo para examinar a distribuição da solução de proteína da matriz da membrana do porão em hidrogel |
| 8.13 | Mais de uma célula em um slot | Não em suspensão de célula única | Use o filtro de células de 40-70 μm para ter suspensão celular única |
| Densidade de semeada não é a ideal | Otimizar a densidade de semeadedededeiro de 30 k a 90 k por mL |
Tabela 1: Diretrizes de solução de problemas. Problemas frequentes, possíveis razões e possíveis soluções são discutidos.
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Discussion
Descrevemos um método de micropadronização baseado em estêncil livre de litografia que permite padronização eficaz de células aderentes. Neste protocolo, demonstramos a padronização de hiPSC-CMs em diferentes relações comprimento-largura por micropadronização de ilhas de proteína de membrana de porão em hidrogéis de poliacrilamida com rigidez tecidual fisiologicamente ou patologicamente relevante ou substratos de elastômeros à base de silício. Este método é relativamente simples e altamente acessível a qualquer pesquisador, incluindo aqueles que têm pouca experiência em técnicas de fotolitografia e microfabricação. O método descrito contorna desafios significativos associados à geração de selos usando litografia macia e transferência de proteínas de moldes de selos para substratos de interesse envolvidos na técnica de impressão de microcontato. Este protocolo fornece um fluxo de trabalho para 1) criar estêncil personalizado com uma área e forma de interesse de forma econômica; 2) fabricar um substrato de hidrogel com a rigidez de interesse; e 3) conjugar eficientemente proteínas ECM no substrato de hidrogel.
Métodos tradicionais de litografia macia têm sido usados para padronizar várias formas de proteínas eCM, incluindo triângulos e estrelas em substratos de diferentes materiais, como materiais à base de silício e tampas de vidro13,14. Neste estudo, demonstramos apenas padrões retangulares dada a forma fisiológica e patologicamente relevante dos cardiomiócitos. Acreditamos que a padronização baseada em estêncil de outras formas complexas pode funcionar desde que a menor característica da forma não vá além da resolução (~10 μm). Em relação aos materiais de substrato, demonstramos que a padronização baseada em estêncil pode ser aplicada em hidrogel (Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6 e Figura 8) ou substrato de elastômero à base de silício(Figura 7). O método apresentado não funciona em substratos com adesão mínima a materiais de poliimida, como plásticos de cultura tecidual e tampas de vidro, pois a vedação apertada entre o estêncil à base de poliimida e esses substratos não é alcançada. Para permitir uma vedação apertada, é necessária uma nova modificação de superfície. Por fim, mostramos que o método pode ser usado para produzir de forma confiável padrões de pareamento celular em hidrogéis com diferentes rigidezs (ou seja, 10 kPa, 60 kPa) (Figura 8).
No protocolo, o passo mais crítico é a otimização da concentração de proteína scm (seção de protocolo 6). O objetivo desta etapa é encontrar a concentração ideal da proteína ECM que é viscosa o suficiente para inibir a solução proteica para infiltrar através dos orifícios do estêncil, mas não muito concentrado, para evitar a gelação(Figura 5). Este método baseado em estêncil não restringe o tipo de proteína ECM. Embora a solução viscosa da proteína ECM seja mais propensa a permanecer no topo do estêncil, uma proteína menos viscosa também pode ser usada. Um requisito é certificar-se de que as superfícies do estêncil e do hidrogel PA estejam secas o suficiente para formar uma interface hidrofóbica relativamente estável. Nesta demonstração, utilizou-se a proteína da matriz da membrana do porão por ser viscosa e adequada para a cultivo de hiPSC-CMs. No entanto, outras proteínas de ECM podem ser usadas (por exemplo, fibronectina, gelatina, colágeno, lamina).
Além da otimização da solução proteica ECM para cada aplicação dada, gerar uma vedação adequada entre o estêncil e a superfície do hidrogel é crucial para obter um padrão preciso com a proteína ECM. Como a secagem excessiva pode levar ao rompimento do hidrogel, é essencial não secar demais o estêncil. Essas etapas (ou seja, colocar o estêncil no hidrogel, bem como gentilmente pealing-lo depois) requerem alguma prática. Estabelecer um procedimento ideal de manuseio para cada condição dada também evitará ter a vara de hidrogel nos estêncil. Com esta otimização, queimaduras a laser em escala submicrona causadas por falhas no corte do laser não afetarão substancialmente a técnica em relação aos danos causados pelo hidrogel.
Outro passo importante é usar a frente do estêncil ao colocar o estêncil no substrato hidrogel. Descobrimos que o uso de cada lado tem um efeito sobre o substrato, presumivelmente devido ao corte a laser (Figura 6). Uma recomendação ao padronizar células em tamanho ou forma específicas pela primeira vez é gerar um estêncil de otimização. Os recursos de design de estêncil não correspondem necessariamente aos tamanhos finais das células padronizadas. Recomendamos gerar um estêncil de otimização que contenha um gradiente de tamanhos de recursos. Preparamos uma tabela listando possíveis problemas e possíveis soluções para ajudar na solução de problemas (Tabela 1).
Não é necessário usar a mesma empresa de microfabricação mencionada neste manuscrito. As chaves para a geração precisa do estêncil são o diâmetro do feixe do laser e a espessura da película de estêncil, no nosso caso, poliimida (50 μm). Acreditamos que um laboratório de laser equipado com um laser apropriado poderia gerar o estêncil com alguns passos, otimizando a intensidade do laser, alinhamento e outras variáveis. Embora tenhamos trabalhado apenas com uma empresa, existem muitas empresas disponíveis que realizam cortes a laser de precisão.
Uma limitação para este método é a resolução. Embora a fotolitografia possa alcançar resolução nanoescala, a resolução de padronização baseada em estêncil está limitada à resolução do corte a laser dos estêncil de poliimida, que até hoje é geralmente na escala de alguns mícrons (~10 μm). No entanto, dado que o tamanho médio da célula é superior a 10 μm, a resolução é geralmente aplicável a qualquer padronização de células únicas.
Em resumo, este método fornece plataformas versáteis para estudar interações célula-ECM, examinar correlação estrutura celular-função e muitas outras aplicações. Acreditamos que este protocolo beneficiará muitos pesquisadores biomédicos e facilitará estudos de células únicas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por bolsa de pós-doutorado do Stanford Child Health Research Institute (CHRI) e National Institute of Health (1F32HL142205-01) para S.L, o NIH Office of Director's Pioneer Award (LM012179-03), o American Heart Association Established Investigator Award (17EIA3410923), o Stanford Cardiovascular Institute, a Hoffmann and Schroepfer Foundation, e a Divisão de Medicina Cardiovascular de Stanford, Departamento de Medicina da S.M.W. , prêmios do Instituto Nacional de Saúde (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) e Programa de Pesquisa de Doenças Relacionadas ao Tabaco (TRDRP 27IR-0012) para J.C.W, o American Heart Association (AHA) Postdoctoral Fellowship Award (18POST34030106) para H.Y, e a bolsa Hengstberger para T.S. Agradecemos ao Dr. Andrew Olsen do Serviço de Microscopia da Neurociência de Stanford pelo apoio à imagem confocal do hiPSC-CM micropadronizado. Agradecemos a H.Y. pelo primeiro desenho de estêncil, fabricação, micropadronização de células únicas de iPSC-CM na cobertura revestida de hidrogel poliacrilamida, e imagem confocal preliminar da estrutura sarcomere de células únicas micropadronizadas iPSC-CMs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder) | Sigma-Aldrich | 516155 | |
| Acrylamide solution 40% (solution) | Sigma-Aldrich | A-4058-100mL | |
| Bench UV lamp 365 nm | UVP | UVP 95-0042-07, XX-15L | |
| BioFlex culture plate | FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC | 6-well plate with silicon elastomer substrate | |
| Bis-acrylamide solution 2% (solution) | Sigma-Aldrich | M1533-25mL | |
| Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm | Sigma | CLS285522 | |
| Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder) | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | basement membrane matrix protein solution |
| Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics | Acros Organics | 326881000 | |
| Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane | Millipore | SLGV013SL | |
| Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm) | Fisher Scientific | SCGP00525 | |
| Stencils | Potomac | custom design | |
| Sulfo-SANPAH | ThermoFisher Scientific | 22589 | |
| TrypLE Select 10x | ThermoFisher Scientific | A1217702 | Enzyme used for stencil cleaning |
References
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