Summary
We beschrijven protocollen voor het beoordelen van de mate van transductie door cel-penetrerende peptiden met behulp van ex vivo imaging systemen, gevolgd door paraffine inbedding, sectie, en confocale fluorescerende microscopie met behulp van cardiale targeting peptide als voorbeeld. In ons protocol kan één dier worden gebruikt om beide soorten beeldvormingsbeoordeling van dezelfde organen te verkrijgen, waardoor het aantal dieren dat nodig is voor studies met de helft wordt gehalveerd.
Abstract
Sinds de eerste beschrijving van eiwittransductiedomeinen, ook bekend als celindringende peptiden, meer dan 25 jaar geleden, is er grote belangstelling geweest voor de ontwikkeling van deze peptiden, met name celspecifieke, als nieuwe vectoren voor het leveren van diagnostische en therapeutische materialen. Ons verleden werk met faag display geïdentificeerd een nieuwe, niet-natuurlijke voorkomende, 12 aminozuur-lange peptide dat we noemde cardiale targeting peptide (CTP) vanwege zijn vermogen om normaal hartweefsel transduceren in vivo met piekopname gezien in zo weinig als 15 min na een intraveneuze injectie. We hebben gedetailleerde biodistributiestudies uitgevoerd door CTP te injecteren met fluorofofine5.5, waardoor het gedurende verschillende perioden kan circuleren en meerdere organen euthanaseren, bevestigen en doorsneed, bevestigt en doorsneed, gevolgd door fluorescerende microscopiebeeldvorming. In deze publicatie beschrijven we deze processen en ex vivo beeldvorming van geoogste organen met behulp van een in vivo beeldvormingssysteem in detail. Wij bieden gedetailleerde methodologieën en praktijken voor het uitvoeren van transductie en biodistributiestudies met CTP als voorbeeld.
Introduction
Het celplasmamembraan is een semipermeabele barrière die essentieel is voor celintegriteit en overleving en dient om het binnenste van de cel te reguleren door de beweging van stoffen in de cel te controleren. Hoewel het van vitaal belang is om te overleven, vormt het ook een barrière voor de levering van lading aan de cel. In 1988, de trans-activator van transcriptie (Tat) eiwit van de menselijke immunodeficiëntie virus werd aangetoond dat gekweekte cellen in te voeren en te bevorderen virale genexpressie1,2, met de domeinen die verantwoordelijk zijn voor deze transduction beperkt tot een arginine en lysine rijke 13-aminozuur regio van de derde helix3 Deze werden dus genoemd cel penetrating peptiden (CPPs). Dit werd gevolgd door onderzoek waaruit blijkt dat het vermogen van de Tat peptide om functionele β-galactosidase te dragen in meerdere celtypes4. Sinds de eerste beschrijving is het aantal cel-doordringende peptiden drastisch toegenomen. Deze transductiedomeinen zijn van nature voorkomende of synthetische korte peptiden, meestal 6−20 aminozuren lang, die in staat zijn om functionele ladingen over celmembranen te vervoeren. Deze ladingen kunnen variëren van andere kleine peptiden, full-length eiwitten, nucleïnezuren, nanodeeltjes, virale deeltjes, fluorescerende moleculen, en radio-isotopen5. De eerste beschreven CSP's waren niet celsp specifiek, waarbij Tat werd opgenomen door meerdere celtypen en zelfs de bloed-hersenbarrière4kruist, waardoor het therapeutisch potentieel werd beperkt. Om celspecifieke CSP's te identificeren, hebben onderzoekers faagweergave uitgevoerd met behulp van grote, commercieel beschikbare faagbibliotheken6. Ons eigen werk met behulp van een combinatorische in vitro en in vivo faagdisplay methodologie leidde tot de identificatie van een CPP genaamd cardiale targeting peptide (CTP)7, een 12-aminozuur, niet-natuurlijke voorkomende peptide (NH2-APWHLSSQYSRT-COOH) dat het hart richt met piekopname op 15 minuten na een intranaveneuze injectie8. Met behulp van immunofluorescente colocalisatie met actine, een intracellulaire marker, en uitsluiting van laminine, een celmembraan marker, toonden we aan dat CTP is geïnternaliseerd in muis cardiomyocyten na een intraveneuze injectie7. Bovendien hebben we geïncubeerd menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide kloppen cardiomyocyten met dual-label CTP, gelabeld met 6-carboxyfluorescein op zijn C-terminus en rhodamine op zijn N-terminus door middel van een ester koppeling die alleen kon worden losgelijmd door intracellulaire esterases. Snelle accumulatie van rhodamine in het verslaan van cardiomyocyten werd waargenomen binnen 15 min op confocale microscopie8.
In dit artikel presenteren we twee gratis methodologieën die kunnen worden gebruikt om biodistributie bij te houden en weefselspecifieke internalisering van CCP's te bevestigen met CTP als voorbeeld. Voor deze methodologieën werd CTP gesynthetiseerd, fluorescerend gelabeld op het N-eindpunt met cyanine5.5 (CY5.5), en amide-afgetopt op de C-terminus voor een grotere peptide stabiliteit. De twee gebruikte methoden zijn in vivo fluorescerende optische beeldvormingssystemen en fluorescerende microscopie van weefselsecties. Beide methoden zijn zeer nuttig bij het bestuderen van biodistributie, opname en eliminatie van fluorescerend gelabelde CCP's. Het voordeel van het beoordelen van biodistributie met behulp van deze methoden ten opzichte van andere, zoals single-photon emissie tomografie (SPECT) of positron emissie tomografie (PET), is dat er geen noodzaak voor de tijd-intensieve radio-etikettering van CSP's in vergelijking met fluorescerende etikettering, dat is relatief eenvoudig en in routinegebruik op alle peptide synthese faciliteiten. Het gebruik van in vivo beeldvorming produceert snel biodistributiegegevens in de context van een levend systeem, terwijl sectioning meer diepgaande informatie biedt over peptide opname en lokalisatie binnen cellen via het behoud van morfologische details. Dit protocol kan worden toegepast op een breed scala van organen en weefsels, zoals het hart, long, lever, nier, hersenen, milt, maag, dikke darm, dunne darm, skeletspieren, bot, teelballen / eierstokken, en ogen.
Protocol
Het Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Pittsburgh keurde alle in deze publicatie gespecificeerde dierprotocollen goed voordat een van deze dierproeven werd onder controle.
OPMERKING: Dit protocol beschrijft hoe ex vivo biodistributiestudies uit te voeren met behulp van ex vivo optische fluorescerende beeldvorming, gevolgd door in vivo biodistributiestudies door de organen in te bedden in paraffine, secties en het uitvoeren van fluorescerende microscopie. Hoewel CTP als voorbeeld wordt gebruikt, kan deze methode worden toegepast op elke fluorescerende CPP.
1. In vivo beeldvorming
- Synthetiseer CTP met behulp van vaste fase synthese technieken9,10 van een peptide synthese faciliteit met behulp van L-aminozuren met een N-terminus gelabeld met Cy5.5 en C-terminus amide-afgetopt voor meer stabiliteit.
OPMERKING: Alle gesynthetiseerde CCP's moeten worden gekarakteriseerd met behulp van high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) en/of matrix assisted laser desorptie/ionisatie (MALDI) voorafgaand aan gebruik11. - Maak een 1 mM of 10 mM voorraadoplossing van CTP in dimethylsulfoxide (DMSO), aliquot, en bewaar bij -80 °C, licht-beschermd.
LET OP: Peptiden worden geleverd als gelyofiel poeder. Lyophilized poeder kan op lange termijn (6 maanden-2 jaar) worden opgeslagen in -20 °C, lichtbeschermd, en onder hygroscopische omstandigheden. Wanneer aliquoted in DMSO en opgeslagen, vries-dooi cycli moeten worden vermeden. - Weeg en verdoof 6 weken oude CD1-vrouwelijke muizen met behulp van 2 μL/g weefselgewicht van een ketamine/xylazine-oplossing (100 mg/kg ketamine en 20 mg/kg xylazine) toegediend intramusculair (achterbeen) of intraperitoneally (kwadrant linksonder).
OPMERKING: Ketamine/xylazine-oplossingen moeten vers worden gemaakt op de dag van gebruik. Ongebruikte ketamine/xylazine moet op passende wijze worden verwijderd en de hoeveelheden moeten worden gebruikt ten opzichte van de in een logboek verwijderde hoeveelheden, aangezien ketamine een gereguleerde stof is. Voldoende niveau van anesthesie zal worden bereikt in 5−7 min, zoals beoordeeld door gebrek aan respons op een teen snufje. - Bereken een dosis Cy5,5-CTP van 10 mg/kg, verdun met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot niet meer dan 200 μL en injecteer retro-orbitaal of via staartaderinjectie met behulp van een insulinespuit (figuur 1A).
- Laat peptide circuleren voor de vooraf gespecificeerde tijd, variërend van 15 min-6 uur.
- Euthanaserië de muis met behulp van de hoge CO2 inhalatie methode zoals gespecificeerd door de Institutional Animal Care and Use Committee en open de borstholte met behulp van schaar (Figuur 1B).
- Gebruik een schaar om een kleine inkeping in de laterale, vrije wand van het rechteratrium te plaatsen en 3 mL van 10% gebufferd formalinefosfaat te injecteren met behulp van een 26 G naald voor het dubbele doel van perfusie vaststelling van de organen van de muis en spoelen rode bloedcellen (Figuur 1C).
- Ontleden hart, long, lever, nieren, milt, dikke darmen, dunne darmen, blaas, eierstokken / teelballen, en de hersenen en plaats in individuele putten van een 12 put plaat voor ex vivo optische beeldvorming(Figuur 1D).
- Start de software voor het verkrijgen van afbeeldingen en klik op de knop Initialiseren om het systeem voor te bereiden op beeldvoorbeelden. Open de imaging wizard, selecteer fluorescentie, filter paar, selecteer dan de Cy5.5 kleurstof uit de lijst van kleurstoffen toe te passen 580 nm excitatie en 620 nm emissiefilters. Selecteer handmatige instellingen voor belichtingsparameters en stel de podiumpositie in op B, stel de belichtingstijd in op 1 seconde, stel de F/stop in op 8 en stel de binning in op klein.
LET OP: De excitatie-emissiefilters variëren afhankelijk van het gebruikte etiket. De excitatie en emissie van het gebruikte etiket kan handmatig worden ingevoerd voor de software om excitatie- en emissiefilters toe te wijzen. Zorg ervoor dat de tellingen tussen de 600-60.000 liggen om verzadiging te voorkomen. Afhankelijk van het systeem dat wordt gebruikt, is automatische acquisitieoptimalisatie mogelijk. Als het systeem compensatie heeft om afbeeldingen te vergelijken die zijn verkregen met verschillende instellingen, kunnen de automatische instellingen worden gebruikt. Als er geen compensatie beschikbaar is, moeten instellingen worden bepaald, opgeslagen en consistent worden gebruikt voor verschillende monsters. - Wanneer het systeem volledig is geïnitialiseerd, schik de organen van belang in een 12 put plaat en plaats het binnen van de optische beeldvormingskamer, ervoor te zorgen dat de monsters zijn gerangschikt zoals gewenst voor de beelden. Selecteer acquire en selecteer vervolgens een opslaglocatie voor de afbeeldingen. Informatie over de muis kan worden geschreven in het pop-upvenster met afbeeldingslabels bewerken.
- Verwijder na beeldvorming de monsters uit de kamer en bewaar in 10% gebufferd formaline fosfaat in een volume dat ten minste 20 keer het volume van het weefsel in scintillatiefrugnen met lichte bescherming bij kamertemperatuur (RT) opslaat.
- Kwantificeer de beelden door eenheden in te stellen op Radiant Efficiency en selecteer vervolgens de 4x3 ROI en pas ze aan om elk goed in één vierkant van de ROI gelijkmatig te passen, gevolgd door te klikken op maat. Open het tabblad RENDEMENT van het raster, selecteer exporteren en sla de metingen op als een .cvs-bestand.
2. Histologie
OPMERKING: Volg stap 1.1−1.8 om verschillende organen te verkrijgen. Als alternatief kunnen dezelfde organen die werden afgebeeld onmiddellijk in formaline worden geplaatst en worden gebruikt voor secties zoals hieronder beschreven.
- Bewaar elk orgaan afzonderlijk in 10% gebufferd formaline fosfaat voor een minimum van 48 uur voor verwerking voor histologie.
- Wanneer de organen na 48 uur voldoende zijn bevestigd, breng je de organen over in weefselverwerking en insluit cassettes en plaats je in een weefselverwerkingsmachine (figuur 1E).
- Stel de verwerkingsmachine om het weefsel te dehydrateren in 70% ethanol gedurende 30 minuten, gevolgd door 80% ethanol gedurende 30 min, 95% ethanol voor 30 min, 95% ethanol voor 30 min, 100% ethanol voor 15 min, 100% ethanol voor 20 minuten, en tenslotte 100% ethanol voor 20 min.
- Maak het weefsel in xyleen 2x, met 30 min voor elke xyleenbehandeling.
- Infiltreer het gerooide weefsel met paraffinewas 4x bij 60 °C gedurende 30 minuten bij elke behandeling.
- Insluiten in paraffine met behulp van metalen mallen. Vul de mal met gesmolten paraffine (bewaard op 65 °C), en breng over op een koude plaat. Als de paraffine aan de onderkant van de mal begint te stollen, plaats het orgaan in de paraffine (Figuur 1F).
- Plaats een gelabelde cassette op de top van de mal als een backing en overvulling met gesmolten paraffine. Laat afkoelen tot het stevig is. Bewaar het blok vervolgens 's nachts in een vriezer van -20 °C, waardoor de was verder kan krimpen voor een gemakkelijke verwijdering uit de mallen.
LET OP: De blokken kunnen nu bij RT worden opgeslagen met lichtbescherming. - Bereid een waterbad van 38 °C met gedestilleerd water. Stel de microtome in met een bladhoek van 6° en een sectiedikte van 10 μm.
- Monteer de weefselblokken in het microtome en begin met snijden totdat delen met weefsel zijn verkregen. Plaats vervolgens de blokken 5 min naar beneden in het water of totdat het weefsel wat vocht heeft geabsorbeerd (bijvoorbeeld wanneer een dunne witte omtrek van het weefsel in het blok verschijnt [Figuur 1G]).
LET OP: Het mes moet regelmatig worden vervangen om de kwaliteit van de secties te garanderen. - Plaats het weefsel op een plat ijsblok gedurende 10 minuten en breng het terug naar het microtome in dezelfde oriëntatie als in stap 2.9. Begin met het nemen van secties en laat afgekapte secties lange linten van elk 6−10 secties vormen. Gooi suboptimale paraffinelinten weg tot een lint van hoge kwaliteit van voldoende lengte om een dia te bedekken wordt geproduceerd. Optimaliseer de sectie door het aanpassen van snijsnelheden, weefselhydratisatie, en water bad temperatuur om te voorkomen dat scheren of rimpeling van de weefselsecties.
OPMERKING: Secties met gaten waar weefsel uitviel, scheurt in het weefsel, of strakke rimpels en plooien in het weefsel moeten worden weggegooid. - Kies voorzichtig het kwaliteitslint naar keuze met stompe randkrachten en drijf op het oppervlak van het waterbad van 38 °C. Laat de secties op het oppervlak zitten totdat ze gladstrijken, waarbij ze niet te lang worden gelaten om te voorkomen dat de paraffine uiteenvalt en de sectie uit elkaar scheurt.
- Drijf de afgeplatte delen op het oppervlak van schone glazen glijbanen. Plaats de glijbanen 30 minuten in een oven van 65 °C om de was te smelten.
LET OP: Deze dia's kunnen bij RT worden opgeslagen met lichtbescherming. - Deparaffinize de dia's in xyleen 3x, 10 min voor elke behandeling.
- Rehydraateer het weefsel in 100% ethanol gedurende 5 min, gevolgd door 95% ethanol gedurende 5 min, 70% ethanol voor 5 min, 50% ethanol gedurende 5 minuten, en tenslotte 1x tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) voor 5 min(figuur 1H). Laat de glijbanen 's nachts drogen.
LET OP: Deze dia's kunnen op lange termijn bij RT worden opgeslagen, zolang ze licht beveiligd zijn. - Monteer de dia's met coverslips met behulp van 125 μL montagemedia met 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), een nucleaire fluorescerende sonde(figuur 1I). Droge glijbanen 's nachts bij RT, licht-beschermd.
LET OP: Gedroogde glijbanen kunnen op lange termijn worden opgeslagen bij 4 °C, lichtbeschermd. - Beelddia's met fluorescerende microscopie.
OPMERKING: Verzadigde afbeeldingen moeten worden vermeden, omdat ze niet kwantitatief nuttig zijn. Het aanpassen van de belichtings- en gain-instellingen kan worden verlaagd om verzadiging te voorkomen. Zorg ervoor dat u dezelfde instellingen gebruikt voor de met vergelijkingsvoorbeelden. Vermijd het bleken van het weefsel door de blootstellingstijden te beperken.
Representative Results
Met behulp van dit protocol behandelden we drie muizen met een dosis Cy5.5-CTP van 10 mg/kg via een retro-orbitale injectie(figuur 1A). Nadat het peptide gedurende 15 minuten had laten circuleren, werden de muizen geëuthanaseerd met behulp van een CO2-kamer, de borst opende via een midden-sternotomie-incisie, werd het rechteratrium gejat en werden de muizen perfusie vastgesteld met 3 mL van 10% fosfaatgebufferd formaline(figuur 1B,C). Na fixatie werden het hart, de longen, de lever, de nier, de milt en de hersenen ontleed en in een 12 putplaat voor ex vivo optische fluorescerende beeldvorming(figuur 1D en figuur 2A) geschikt. Drie controlemuizen zonder injecties werden ook geperfuseerd, ontleed en afgebeeld(figuur 1B−D en figuur 2B). De fluorescentie gegevens verkregen voor elke set organen kan worden vergeleken als gevolg van de tellingen worden omgezet in stralende efficiëntie, de relatieve fluorescentie-eenheid van de imaging software. Deze gegevens kunnen worden gekwantificeerd om zowel kwalitatieve beelden als kwantitatieve gegevens voor elk orgaan in kwestie(figuur 2C) op verschillende tijdstippen voor biodistributiestudies te leveren. De autofluorescentie van verschillende organen in reactie op verschillende opwindingsgolflengten wordt aangetoond in figuur 3A−E. Kortere excitatiegolflengten, zoals verbeterde groene fluorescerende eiwitten (EGFP), worden geassocieerd met hogere autofluorescentie, vooral in lever en hersenen, dan ver-rood (Cy5.5) of in de buurt van infrarood (Cy7) excitatie golflengten (Figuur 3). De afgebeelde organen werden vastgesteld in 10% fosfaat gebufferd formaline bij RT voor een minimum van 48 uur, gevolgd door een overdracht naar weefsel verwerking en inbedden cassettes (Figuur 1E). De organen werden verwerkt en geparaffiniseerd in een weefselverwerkingsmachine, geplaatst in mallen gevuld met paraffine, bevroren op een -20 °C stadium, en 's nachts opgeslagen bij -20 °C (figuur 1F). De monsters werden geneued (figuur 1G) en behandeld met oplossingsuitwisselingen om het weefsel te hydrateren (figuur 1H). De geprepareerde glijbanen werden vervolgens gemonteerd met DAPI fluorescerende montagemedium(figuur 1I). Eenmaal droog, meestal 's nachts, werden de dia's afgebeeld met behulp van fluorescerende microscopie. Representatieve beelden van elk orgaan van een muis worden weergegeven in figuur 4A. De beelden van verschillende organen werden verkregen met behulp van identieke instellingen om vergelijking tussen muizen mogelijk te maken, en om kwantificering mogelijk te maken (figuur 4B).
Figuur 1: Het oogsten van muisorganen voor ex vivo optische fluorescerende beeldvorming en secties. (A) Wild type muis geïnjecteerd retro-orbitaal met CTP-Cy5.5. (B) Muis ontleed met borst geopend, rechter atrium geknipt, voor perfusie fixatie. (C) Hart geïnjecteerd met 3 mL van 10% gebufferd formaline fosfaat voor perfusiefixatie van het dier. (D) Organen van belang geoogst en gerangschikt in een 12 put plaat voor fluorescerende optische beeldvorming. (E) Hart geladen in een cassette en verwerkt met behulp van een tissue processor. (F) Hart ingebed in paraffine. (G) Hart doorsneden op een microtome. (H) Dia's gedeparaffiniseerd door middel van een reeks van uitwisselingen van oplossingen. (I) Secties gemonteerd met coverslips met behulp van DAPI. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Representatieve beelden van behandelde en controleorganen. (A) Organen van een muis behandeld met 10 mg/kg CTP-Cy5.5. (B) Organen van een onbehandelde controlemuis. (C) Kwantificering van fluorescentie voor elke reeks organen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Onbehandelde muisorganen afgebeeld op verschillende excitatie-emissiegolflengten om aan te tonen hoe langere golflengten minder autofluorescentie produceren. A) Cy7: 740−790. (B) Cy5.5: 660−710. CC) Cy5: 620−670. (D) Cy3: 520−570. (E) EGFP: 480−520. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Transductie van hart, long, lever en nier na intraveneuze injectie bij muizen. Wild type muizen werden geïnjecteerd met 10 mg/kg Cy5.5-CTP, of een willekeurig peptide (RAN-Cy5.5), en geëuthanaseerd op de aangegeven tijdstippen. (A) Piektransductie van hartweefsel werd gezien op 15 min met een gestage afname van de fluorescentie na verloop van tijd. Sommige capillaire opname werd opgemerkt in de longen met robuuste transductie in de lever en bij de nierglomerulaire haarvaten, de laatste impliceert een niermechanisme van uitscheiding. (B) Kwantificering van fluorescerende intensiteit toont een aanzienlijk verhoogde hartopname van CTP-Cy5.5 ten opzichte van RAN-Cy5.5. Schaalbalk = 500 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Zahid et al.8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Diermodellen zijn essentieel voor de ontwikkeling van preklinische geneesmiddelen in elke fase van het proces, van de identificatie van nieuwe CSP's, biodistributiestudies, mechanisme van transductie, tot het uiteindelijk testen op de werkzaamheid van de geleverde lading met behulp van deze nieuwe CSP's als vectoren. Er zijn veelgebruikte methoden beschikbaar om biodistributie te beoordelen, zoals histologie, nucleaire geneeskunde beeldvorming (SPECT en PET), en in vivo optische beeldvorming12. Nucleaire beeldvormingsmethoden kunnen omslachtig zijn vanwege de beperkte beschikbaarheid van kleine dierspect- en PET-systemen, evenals de mogelijkheid om radiolabel-drug conjugaten te produceren, waarvoor de expertise van een radiochemicus vereist is. Fluorescerende labels zijn daarentegen veel eenvoudiger en kunnen kosteneffectief zijn om mee te werken. Het protocol beschreven in dit document maakt een snelle analyse van de biodistributie met behulp van meerdere methoden. Ex vivo hele orgaan fluorescerende optische beeldvorming zorgt voor de onmiddellijke vergelijking van fluorescentie over verschillende weefsels en behandelingsgroepen en kan orgaanopname en tijd om de opname in orgaan van belang op een semikwaansmanier te identificeren. Kwantitatieve weefsel histologie vereist uitgebreidere verwerking voor de behandeling, sectie, beeld, en analyseren van weefsels, maar het biedt meer gegevens op microscopisch niveau en is een huidige standaard techniek. Het is de moeite waard op te merken dat directe, kwantitatieve vergelijking over de twee technieken niet mogelijk is, omdat de autofluorescentie gezien met elke techniek voor verschillende organen en excitatie golflengtes aanzienlijk varieert.
Een belangrijk onderdeel van dit protocol is het selecteren van de juiste fluorofolaat om kandidaat-CPS te labelen voor experimenten. Een potentieel probleem is spectra overlap, die problematisch kan zijn wanneer meerdere fluoroforen nodig zijn. De DAPI tl-montagemedia en Cy5.5 hebben geen overlappende spectra. Voor bepaalde toepassingen waar meerdere fluoroforen nodig zijn, moet echter zorgvuldig worden overwogen om het risico op spectrale overlap te nemen. Afhankelijk van het systeem dat wordt gebruikt, kan de fluorofoforselectie beperkt zijn. Daarom is kennis van de mogelijkheden van het systeem essentieel. Fluorescerende optische systemen worden het best gebruikt met ver-rode of nabij-infrarood fluoroforen als gevolg van de hoge weefselabsorptie van kortere golflengten13. Fluoroforen in het bereik van verbeterde groene fluorescerende eiwitten hebben een belangrijke beperking, omdat er significante orgaanautofluorescentie gezien op zijn excitatie golflengte, met name in de hersenen en leverweefsel. Afhankelijk van de omstandigheden van een experiment, kunnen sommige fluoroforen het best worden vermeden. Sommige in water oplosbare organische fluoroforen hebben een sterke interactie met lipide bilayers, die valse positieven kunnen veroorzaken. Daarom is het raadzaam om stappen te ondernemen om te bepalen of een fluorofof heeft sterke affiniteit met het weefsel van belang14. Een andere factor om te overwegen is het selecteren van de juiste methode van fluorofoof vervoeging, die een belangrijke parameter kan zijn die de resultaten beïnvloedt. CPS kunnen fluorescerend worden gelabeld op het N- of C-eindpunt door middel van een covalente binding tussen het N-eindpunt van het peptide en de carboxylgroep van de kleurstof zoals Cy5.5-NHS. Er moet voor worden gezorgd, omdat het mechanisme voor transductie van de meeste CCP's niet in detail wordt begrepen en vervoeging aan de ene kant het opnamemechanisme meer dan aan de andere kant kan beïnvloeden. Een andere mogelijkheid voor het labelen van CCP's is door het biotineyleren van het N-eindpunt voor vervoeging tot fluorescerend gelabeld streptavidin. Met behulp van deze strategie heeft het gemak van het toestaan van verschillende fluorescerende streptavidin conjugaten worden gebruikt. Een mogelijke beperking van deze strategie is echter dat een biotine-streptavidin-complex een grote constructie is, die mogelijk de transductie zou kunnen verstoren.
Fluorescerende optische beeldvormingssystemen zijn een effectieve strategie voor het efficiënt vergelijken van fluorescentie tussen verschillende organen en behandelingen, maar zijn niet in staat om een kwantitatieve maatstaf van absolute concentraties in weefsel te produceren. Dit is te wijten aan lichtverstrooiingseffecten in het weefsel, die verder worden verergerd door de natuurlijk voorkomende variëteit in weefselgroottes en -dichtheden, en verschillen in vasculariteit, met variabele fluorescentieverstrooiing. Weefsel autofluorescentie kan ook een factor zijn, als gevolg van natuurlijk voorkomende biochemische bronnen zoals collageen, of voedingsbronnen zoals chlorofyl in voedsel13.
Histologie is de meest gebruikte methode voor het meten van biodistributie en kan mogelijk worden gebruikt om de opname in verschillende weefsels in de loop van de tijd nauwkeurig te meten en te vergelijken. Lichtverstrooiingsproblemen worden vermeden met behulp van deze methode omdat alle weefsels zijn doorsneden tot dezelfde dikte15. Een groot voordeel van deze methode is de mogelijkheid om extra fluorescerende labels postssecties voor immunohistochemie op te nemen. Hoewel de toevoeging van een andere fluorofofoër beeldvorming uitdagender zou kunnen maken, kan het gebruik van fluorescerende etiketten nuttig zijn voor de lokalisatie van een CPP aan bepaalde intracellulaire compartimenten, zoals lysosomen of mitochondriën. Een antilichaam kan worden gebruikt in een confocale microscopie experiment om te bepalen of een getransduceerde kandidaat CPP colocalizes met een structuur van belang, die het potentieel van een CPP als een leveringsagent kan aantonen. Een beperking van deze methode is dat de voorbereiding van dia's uit orgaanmonsters tijdrovend, arbeidsintensief en vatbaar voor menselijke fouten12,15kan zijn . Bij beeldvorming dia's, zorg moet worden genomen om niet beeld dezelfde locatie te lang om te voorkomen dat fotobleaching. Sommige fotobleaching zal onvermijdelijk zijn, afhankelijk van de gevoeligheid van de fluorofof. Bij elke stap van dit protocol moet worden gezorgd voor zorg om de monsters te beschermen tegen omgevingslicht en ze goed op te slaan16. Wij raden aan dia's op te slaan bij 4 °C, lichtbeschermd, voor toekomstige beeldvorming.
Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor het meten van de biodistributie van een kandidaat-CPP die gespecialiseerde apparatuur nodig heeft en vergelijkbare resultaten kan opleveren, hoewel ze complexere CPP-etikettering vereisen. Het in dit document beschreven protocol maakt gebruik van twee compatibele methoden om biodistributiegegevens efficiënt te produceren in de context van een levend systeem, terwijl het mogelijk wordt om meer diepgaande informatie over de internalisatie van peptide in cellen uit hetzelfde monster te verkrijgen, waardoor het aantal dieren dat nodig is voor een studie met de helft wordt gehalveerd. Deze methoden werden gebruikt om de bovenstaande gegevens te genereren, waaruit blijkt dat beide methoden achtereenvolgens kunnen worden gebruikt in hetzelfde dier, en de kwaliteit van de gegevens gegenereerd door elk. Onze resultaten benadrukken ook het onvermogen om de resultaten direct te correleren tussen de twee technieken op een kwantitatieve manier.
Disclosures
M.Z. en Paul D. Robbins (Universiteit van Minnesota, Minnesota, MN, DE V.S.) houden een octrooi op het gebruik van hart richtend peptide als hartvector (Hart-specifiek eiwit richtend domein, U.S. Octrooi Serial Nr. 9.249.184). M.Z. is ook Chief Scientific Officer en zit in de Raad van Bestuur van de startup Vivasc Therapeutics Inc. en heeft er een aanzienlijk toekomstig eigen vermogen in.
Acknowledgments
M.Z. en K.S.F. worden ondersteund door American Heart Association Scientist Development Award 17SDG33411180, en door een subsidie toegekend in het kader van de Pitt Innovation Challenge (PInCh®), via het Clinical and Translational Science Institute aan de Universiteit van Pittsburgh.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | ThermoFisher | SF100-4 | |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | ThermoFisher | BP2471-1 | |
| 12-well Cell Culture Plate | ThermoFisher | 353043 | |
| 1x TBS Solution | 10x TBS is diluted 1:10 with deionized water. This solution can be stored at room temperature. | ||
| 20 mL Scintillation Vials | Wheaton | 334173 | |
| 26G Needles | Becton Dickinson | 305110 | |
| 28G 0.5ml Insulin syringes | Becton Dickinson | 329461 | |
| 3mL Syringe | Becton Dickinson | 309657 | |
| CD1 Mice | Charles River | 022 | 6 to 12 week old albino, female mice |
| Cover Glass | ThermoFisher | 12-544-14 | |
| Cy5.5-CTP-amide | Prepared by peptide synthesis, conjugated with Cy5.5 fluorophore, and purified using HPLC. Lyophilized powder is reconstituted in DMSO at 10mM concentration. After reconstituting, store at -80 °C. | ||
| Dapi Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 99150-20 | |
| Ethanol | |||
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Ketamine HCl 100mg/mL | KetaVed | NDC 50989-161-06 | |
| Ketamine/Xylazine Solution | Ketamine HCl is mixed with Xylazine 1:1 to produce a stock solution containing 50mg/mL ketamine and 10mg/mL Xylazine. This solution is made fresh before each use. | ||
| Leica RM2235 Rotary Microtome | Leica | RM2235 | |
| Microscope Slides | ThermoFisher | B9992000TN | |
| Paraplast X-TRA | Sigma | P3808-1KG | |
| Perkin Elmer Lumina S5 IVIS | Perkin Elmer | CLS148588 | |
| Sparkle Optical Lens Cleaner | ThermoFisher | NC0090079 | |
| Tissue-Tek Processing/Embedding Cassettes | ThermoFisher | NC9499605 | |
| Tissue-Tek VIP Processing machine | Tissue-Tek | VIP 5A-F1 | |
| Xylazine 20 mg/mL | AnaSed | NDC 59399-110-20 | |
| Xylenes | ThermoFisher | X5-4 |
References
- Green, M., Loewenstein, P. M. Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein. Cell. 55 (6), 1179-1188 (1988).
- Frankel, A. D., Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55 (6), 1189-1193 (1988).
- Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Zahid, M., Robbins, P. D. Cell-type specific penetrating peptides: therapeutic promises and challenges. Molecules. 20 (7), 13055-13070 (2015).
- Zahid, M., Robbins, P. D. Identification and characterization of tissue-specific protein transduction domains using peptide phage display. Methods in Molecular Biology. 683, 277-289 (2011).
- Zahid, M., et al. Identification of a cardiac specific protein transduction domain by in vivo biopanning using a M13 phage peptide display library in mice. PLoS One. 5 (8), e12252 (2010).
- Zahid, M., et al. Cardiac Targeting Peptide, a Novel Cardiac Vector: Studies in Bio-Distribution, Imaging Application, and Mechanism of Transduction. Biomolecules. 8 (4), E147 (2018).
- Amblard, M., Fehrentz, J. A., Martinez, J., Subra, G. Methods and protocols of modern solid phase Peptide synthesis. Molecular Biotechnology. 33 (3), 239-254 (2006).
- Katritzky, A. R., Yoshioka, M., Narindoshvili, T., Chung, A., Johnson, J. V. Fluorescent labeling of peptides on solid phase. Organic and Biomolecular Chemistry. 6 (24), 4582-4586 (2008).
- Prabhala, B. K., Mirza, O., Hojrup, P., Hansen, P. R. Characterization of Synthetic Peptides by Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1348, 77-82 (2015).
- Arms, L., et al. Advantages and Limitations of Current Techniques for Analyzing the Biodistribution of Nanoparticles. Frontiers in Pharmacology. 9, 802 (2018).
- Leblond, F., Davis, S. C., Valdes, P. A., Pogue, B. W. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. Journal of Photochemistry and Photobiology. 98 (1), 77-94 (2010).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose your label wisely: water-soluble fluorophores often interact with lipid bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).
- McGowan, J. W., Bidwell, G. L. 3rd The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).
