Summary
我们已开发出一种有效的气味信号采样和分析方法，以便了解气味信号在动物通信中如何使用。特别是，我们使用头部空间固体相微缩结合气相谱-质谱法来分析动物气味和气味标记的挥发性成分。
Abstract
我们开发了一种有效的气味信号采样和分析方法，方法是利用头部空间固体相微缩法和气相-质谱法，了解它们如何用于动物通信。该技术允许对气味分泌物的挥发性成分进行半定量分析，从而能够分离和初步识别样品中的成分，然后分析峰值区域比率，以寻找可能表示可能参与信号的化合物的趋势。此当前方法的主要优点是可分析的样本类型范围：缺乏对任何复杂的样品准备或提取的需要;分离和分析混合物成分的能力;检测到的组件的标识;以及提供所检测组件的半定量和潜在定量信息的能力。方法的主要限制与样品本身有关。由于特定兴趣的组件是不稳定的，而且这些成分很容易丢失，或者其浓度发生变化，因此样品在收集后必须妥善储存和运输。这也意味着样品储存和运输条件相对昂贵。这种方法可以应用于各种样品（包括尿液、粪便、头发和香气味分泌物）。这些气味由复杂的混合物组成，在一系列基质中发生，因此需要使用技术来分离单个成分并提取生物兴趣的化合物。
Introduction
对于支撑动物嗅觉信号的化学变化知之甚少，也因为记录和量化气味2挥发性化学特征的方法学挑战。在与高度复杂的化学矩阵合作时，存在几个潜在的陷阱：其中包括在采样和分析气味样本时3。
在伍尔弗汉普顿大学的罗莎琳德富兰克林科学中心，我们正在对气味和气味标记进行分析，以了解它们如何被动物使用。我们把半化学与行为生态学、内分泌学和细胞学结合起来，以增进我们对嗅觉信号在动物传播中所起的作用的理解。
我们开发了一种方法，然后分析了来自各种物种的气味和标记，包括一些非人类灵长类动物（即加冕狐猴、红斑狐猴、日本猴、橄榄大猩猩、黑猩猩）和其他哺乳动物（即猫、牛）。我们收集并分析了各种样本，包括尿液、粪便、头发和香气味分泌物。这些气味和气味标记由化合物的复杂混合物组成，因此用于分析的任何方法都需要包括某种形式的分离技术。如前所述，它们也发生在一系列矩阵中，需要使用技术来提取感兴趣的组件。
Vaglio等人的 先前研究和其他作者5 使用气相色谱-质谱仪（GC-MS）的动态头部空间提取（DHS），同时直接溶剂提取6 和复杂溶剂提取7 也被使用。特别是，动态头部空间采样涉及用已知的惰性气体清除头部空间，最终去除所有挥发性化合物，但那些对样品基质有强烈亲和力的化合物（例如，水样中的极性化合物）除外。
在目前的方法中，我们采用了头空间固体相微缩（HS-SPME）与GC-MS相结合的技术。特别是，我们已经开发和改进了Vaglio等人在以前的GC-MS实验室8、9、10中已经使用的方法。
无溶剂萃取技术非常有效，用于分析小的、高挥发性的化合物（否则很容易从样品中丢失），因为这些方法使化合物在稳定、坚实的相位支撑下无法移动。HS-SPME 使用涂有溶剂聚合物的纤维捕获样品头部空间中的挥发性化合物，或通过浸入水性生物液11提取溶解化合物。聚合物涂层不会对化合物有很强的结合，因此，通过在GC的注入端口加热，可以去除这些化合物。这种方法比溶剂提取技术更强大，也比DHS更有效。
在当前方法中，样品包含在玻璃瓶中。这些小瓶加热到40°C的温度，以模拟动物体温，以促进气味标记的挥发性成分占据小瓶的头部空间。一种SPME纤维，涂有65微米的多晶硅氧烷/二苯二苯（PDMS/DVB）吸收材料，暴露在头部空间环境中，样品中的挥发性成分被吸收到纤维上。在 GC-MS 的入口端口加热纤维时，挥发性部件从纤维中去除，然后由 GC 分离。使用 MS 获取每个组件的质量光谱碎片模式。通过将这些质谱与质量光谱数据库进行比较，可以初步确定气味标记的成分。通过使用自动取样器，我们能够以一致的方式分批分析多个样本。
鉴于每种SPME纤维与极地化学物质具有不同的亲和力，通常根据目标化合物的极性和/或分子量选择纤维。此外，GC 条件会根据 GC 列的类型和目标化合物的特性而改变。
该技术允许对气味标记的挥发性成分进行半定量分析，从而能够分离和初步识别样品中的成分，然后分析峰值区域比率，以寻找可能表示可能涉及信号的气味标记组件的趋势。
目前这种方法的主要优点是：
- 可分析的样本类型范围。
- 无需复杂的样品制备或提取。
- 分析挥发性组件的能力。
- 分离混合物成分的能力。
- 能够识别检测到的组件。
- 能够提供半定量和潜在定量的检测组件信息。
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Protocol
1. 样本收集
- 样本气味如下：
- 通过无菌滤纸上的气味标记（如香味腺气味分泌物）或直接进入小瓶（如尿液），由习惯性研究对象（如动物园灵长类动物）自发释放。
- 通过使用积极的强化训练，在训练学习科目后通过摩擦无菌棉签收集。
- 研究对象的沉着后，通过摩擦无菌棉签收集。
- 将样品放入无菌的 10 mL 螺丝盖透明玻璃瓶中，并密封带有 FTFE/硅胶隔膜的螺丝顶盖。立即将其存储在-20°C。
注意：使用干净的个人防护设备，如氮化物手套，至关重要：经常更改它们;避免与样品和小瓶直接接触皮肤。它更倾向于使用全新的小瓶：但是，在使用小瓶的情况下，必须预先清洁小瓶，然后使用相同的协议。 - 每次收集气味标记时，都要取环境空白。例如，收集采样介质（例如滤纸或拭子）和在采样时暴露在环境中的头部空间小瓶。
2. 样品准备
- 用刀片从气味标记的滤纸或拭子头切开大约 10 mm 正方形的刀片，将其放入 10 mL 螺丝顶头空间小瓶中，在田间准备样品。
- 在准备完每个样品后，处理或清洁用于使用适当的抗菌擦拭和/或酒精切割取样介质的刀片，彻底干燥。
- 将所有样品存储在-20°C。
注意：在-20°C或其他尽可能低的字段中首选。
3. 准备分析
- 从冰柜中取出样品，让温度自然加热至室温至少1小时。
- 在 GC-MS 上设置分析方法如下：
- 对于 SPME 分析条件，请按照制造商的指示对 SPME 纤维进行首次使用前的状况：纤维预制（260 °C 代表 5 分钟）、样品孵化（40 °C 代表 2 分钟）、提取时间（15 分钟）、脱硫时间（2 分钟）和纤维后状况（260 °C 代表 20 分钟）。
- 使用以下 GC 条件：列（HP5-MS 30 米 x 0.25 毫米; 0.25 μm），喷油器温度（270°C），流速（1 mL/min），注射模式（无分裂），GC烤箱轮廓（45°C 2分钟;4°C/分钟至170°C;20°C/分钟至300°C），MSD传输线（280°C）。
注意：为了改善样品保留时间一致性，分析方法是锁定保留时间）。 - 使用以下 MSD 条件：溶剂延迟（2.5 分钟）和扫描范围（29 至 400 amu）。
注：在以前的协议4中使用了10到400的范围。
- 确保打开对纤维调节装置的净化气体供应。
注：SPME 组件正确安装在自动取样器中，并且与自动取样器托盘、光纤调节装置和 GC 入口端口对齐至关重要。不正确的对齐可能导致 SPME 纤维的损坏或破坏。
4. 分析
- 将空头空间小瓶（作为系统空白）放在 GC-MS 自动取样盘的第一位置。将环境空白放在自动取样盘的第二个位置。将样品放在自动样品托盘的后续位置进行分析。
- 创建分析序列以分析样品托盘内的每个样本。
- 在"大规模猎人"主屏幕中，选择 序列|加载序列。
- 通过插入适当的信息，完成所有空白和样品的序列表。保存已完成的序列表。
注：序列表的确切信息将取决于表的实验室格式。最小信息通常包括样本类型、样本名称、小瓶位置和编号、分析方法以及数据文件位置和名称（分配与样本名称相匹配的数据文件名称有助于未来数据处理）。分析过程中，可以向序列添加其他示例。
- 通过选择 序列|运行序列运行序列。
- 分析后尽快将样品放回冰柜。
注意：可以重新分析样品，但应当指出，在初步分析过程中，可能完全提取了一些挥发性成分，有些化合物可能在 40 °C 时经历了热和细菌分解，因此由此产生的色谱可能无法完全代表原始气味标记。
5. 数据分析
注：初步数据分析包括色谱图的集成，以获得保留时间和峰值区域数据，以及使用ChemStation软件和NIST（国家标准与技术研究所）质量光谱数据库（MSD F.01.01.2317版本）对峰值进行初步识别。数据分析可以手动进行，也可以通过半自动化方法进行。如果使用半自动化方法，则有时进行一定程度的手动数据分析以验证暂定身份验证是有益的。
- 单击左侧导航栏中的相应文件，打开数据文件。总离子色谱 （TIC） 将显示在数据分析屏幕的顶部窗口中。
- 要使用 RTE 集成器集成 TIC，请选择 色谱图|集成。
- 调整集成参数，以便集成大于 3 x 基线噪声的峰值。选择 色谱图|MS 信号集成参数。在输出框中，根据情况调整最小峰值区域（1.0 在我们的示例中产生可接受的结果）。
- 要识别峰值并生成汇总报告，请选择 出口报告|库搜索结果报告给 XLS。
注：要搜索的光谱库以及要显示的库匹配数，需要在软件中预设，然后才能进行库搜索。 - 由此产生的电子表格报告包含每个峰值的集成数据，以及分配身份的暂定光谱库匹配。通常，图书馆质量/库匹配应>80接受暂定标识。保存电子表格。
- 直接从 TIC 识别峰值。
- 选择兴趣的顶峰。
- 如果峰值较小，请通过按住左手鼠标按钮在峰值周围绘制一个框进行放大，将盒子伸展到峰值上并释放。
- 放置光标线，使其位于峰值的最高点（或紧接之后）。
- 双击右侧鼠标按钮，峰值的质谱将显示在数据分析屏幕的下窗中。
- 要搜索光谱库，请将光标移动到光谱窗口的任何地方，然后双击右侧鼠标按钮。库搜索结果将显示在一个新的窗口中。
- 要从兴趣谱中去除背景噪音，请先双击有关峰值上的右手鼠标按钮。然后双击感兴趣的峰值前没有峰值的区域中的右手鼠标按钮。选择 色谱图|减去光谱。减去的频谱将显示在数据分析屏幕的下窗，并将在窗口头中的 SCAN 数据旁边显示"（-）"。
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Representative Results
根据这项协议，我们初步确定了总共32种挥发性化合物，从分析14个非生殖器气味标记自发释放在过滤纸上由红褶狐猴（Varecia variegata rubra），并比较气味配置文件与信号器12的功能。天然存在的挥发性化合物，如碳氢化合物、三苯甲酸酯、三苯醇和酮，存在于这些特征中，包括以前被发现充当性信息素的化合物，以及其他动物物种健身的线索。已初步确定的化合物列在 表1中。代表色谱图（1 个来自控制，1 个来自狐猴气味标记）显示在 图 1 中。不同研究对象的成分数量和相对丰度因样本而异。然而，所有样品中都存在六种化合物（苯甲醛、2-乙基-1-六氯醇、p-cresol、cis-p-mentha-2、8-dien-1-ol、2-皮宁-4-1、五角苯酚）。
这项研究的结果表明，红发狐猴使用气味标记来传达有关性别和女性年龄的信息，而非生殖器标记在社会流中起着一种作用。
使用本议定书后的另一个有代表性的结果是我们对雌性橄榄大猩猩（帕皮奥·阿努比斯）的生育广告（Vaglio等人未公布的数据）的研究。我们通过对385个雌性大猩猩阴道气味样本的分析，共鉴定了74种挥发性化合物。这些化合物包括一系列自然产生的臭味挥发性化合物，如酮、酒精、醛、三叶草、挥发性脂肪酸和碳氢化合物。典型的色谱图用于比较空白控制和雌性大猩猩阴道气味样本从肥沃和非肥沃时期显示在 图2。我们检查了阴道气味特征和雌性大猩猩的性接受性之间的关系。我们的结果表明，阴道气味的总量与生育力不同，这表明气味可能在信号雌性大猩猩生育能力方面发挥作用。我们还发现组类型之间阴道气味的差异，但我们无法区分组组成、女性年龄和均等的影响。
图1。示例色度图;（顶部色谱图-"控制"）控制样本，显示污染物：（底部色谱图 -"狐猴香味标记"）一个成年女性红发狐猴非生殖器气味分泌物，显示污染物和有意义的生物化合物。红色箭头表示在所有样品中发现的六种有意义的生物化合物：（a） 苯甲醛：（（b） 2-乙基-1赫萨诺尔：（c） p- 克雷索尔：（d） 顺-p-门塔-2，8-迪恩-1-奥尔：（e） 2-皮宁-4-1：（f） 五角大厦。这个数字已经从詹达等人12日修改。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2。示例色度图从（顶部色谱 - "控制"）控制样本中，显示污染物;（中色谱图-'巴布恩无肥味'）雌性橄榄大猩猩，阴道气味样本来自非肥沃期：和 （底部色谱 - '巴布恩肥沃的气味'） 雌性橄榄大猩猩， 阴道气味样本从肥沃时期。 请单击此处查看此图的较大版本。
| 保留时间（分钟） | 暂定复合 ID | 分子量 |
| 3.906 | 己醛 | 100 |
| 6.057 | 5-甲基-3-六氯酮 | 114 |
| 7.413 | 阿尔法-皮恩 | 136 |
| 8.077 | 1-异丙基-4-甲基双环比[3.1.0]六角-2-1 | 134 |
| 8.268 | 安息香醛 | 106 |
| 8.623 | 3，7，7-三甲基-1，3，5-环丙烯 | 134 |
| 9.096 | 苯酚 | 94 |
| 9.269 | 6-甲氧-5-赫普滕-2-1 | 126 |
| 10.72 | 2-乙基-1-六酚 | 130 |
| 12.362 | p - 克雷索尔 | 108 |
| 12.553 | 西斯 - 韦尔贝诺尔 | 152 |
| 13.385 | 西斯 - p - 门塔 - 2， 8 - 迪恩 - 1 - ol | 152 |
| 14.104 | 1，7，7-三甲基双环比[2.2.1]赫普塔-2-1 | 152 |
| 14.536 | L - 皮诺卡维尔 | 152 |
| 14.791 | 跨维贝诺 | 152 |
| 15.605 | p-乙基酚 | 122 |
| 15.928 | 特皮宁-4-奥尔 | 154 |
| 16.415 | 阿尔法-泰皮诺 | 154 |
| 16.615 | 默特诺尔 | 152 |
| 17.047 | 2-皮宁-4-1 | 150 |
| 18.252 | 香芹酮 | 150 |
| 19.217 | p - 门塔 - 1， 8 - 迪恩 - 3 - 1 | 150 |
| 23.283 | 4，7，7-三甲基双环比[4.1.0]赫普特-3-ene-2-1 | 150 |
| 23.443 | 四重奏 | 198 |
| 25.094 | 杰拉尼拉酮 | 194 |
| 25.899 | 异丙酮 | 206 |
| 26.513 | 五角大厦 | 212 |
| 30.871 | 2，6，10-三叶虫 | 254 |
| 32.208 | 赫普泰德坎 | 240 |
| 32.372 | 2，6，10-三甲基苯丙胺 | 268 |
| 34.446 | n- 特拉科萨内 | 338 |
| 34.591 | 2，6，10，14-四甲基苯甲酸酯 | 282 |
表1。 过滤纸样本中存在的挥发性化合物来自女性红毛狐猴非生殖器气味分泌物，初步使用ChemStation软件和NIST质量光谱数据库（MSD F.01.01.2317版本）确定。这张桌子已经从詹达等人的12号表格中修改了。
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Discussion
使用控制样品，包括采集样品时产生的环境控制和系统空白，对于解释气味标记样品至关重要。由于采样环境或仪器系统造成的任何峰值都需要排除在气味标记样本之外，以便在任何解释中只包括感兴趣的峰值。这些控制还可以在评估和监测仪器的"健康"方面发挥作用。
该协议包括在每次提取前后对纤维进行条件调节的步骤。使用自动取样器可以简化这一点，并确保样品与样品没有交叉污染。
方法的主要限制与样品本身有关。收集后，必须妥善存储和运输它们。特定兴趣的组件是不稳定的，这些成分很容易丢失，或者它们的浓度会发生变化。目前样品被储存和运输冷冻，通常为-20°C。 因此，储存和运输这些样品需要付出巨大代价。将样品运送到实验室进行分析的延误将进一步增加这些成本，并可能影响从气味标记中获得的结果。需要进一步研究，以了解时间和存储对从样品中获得的分析结果的影响。由于具有特殊意义的组件是气味标记中波动性较大的组件，因此这些组件的水平可能会改变样本收集后的含量。可能需要考虑某些样本类型中潜在的细菌效应。例如，在尿样酒精测试中，尿液中的细菌可能会产生酒精，从而增加检测到的酒精水平。
当前方法符合先前概述的所有要求。它提供了良好的质量结果，从中获取了关于气味标记成分的进一步信息。然而，分析是基于实验室的技术，依赖于提交给实验室的样品。解决这一限制的一个潜在办法是使用便携式GC-MS仪器，这些仪器可以带到采集样品的领域。这种方法将减轻储存和运输样品的需要，并能够实时分析气味标记，从而可能提供有关标记最易挥发成分的更多信息。提供几种便携式GC-MS仪器。他们采用与实验室仪器不同的技术，但应提供可比的结果。HS-SPME 提取技术的使用仍然适用。但是，由于便携性，仪器不提供自动样品介绍选项：然而，如果收集样本后立即进行分析，则每日样本数量可能可管理，用于人工注射。此外，在实地提取的情况下，应注意SPME纤维在使用前不会捕获环境化学品。目前可用的仪器是电池供电，使完全便携性，但随着提供某种形式的电源（即使是小型发电机），这些仪器可以运行更长的时间。这些仪器的性质往往设计为操作简单，需要最少的培训和知识。这意味着，可能没有必要部署训练有素的操作员与仪器，他们可以由那些收集样品的人操作。分析结果的详细解释可以远程实现，也可以在仪器返回基地时实现。
使用SPME纤维方法的另一个主要限制是，只能分析样品中存在的化合物。特别是，即使使用SPME纤维进行分析的分子量低于样本中，也存在大量的化学物质。此外，在动物气味标记和其他动物化学信号释放的气味分泌物中，个别动物倾向于使用少量的化合物与其他动物通信和/或检测来自材料的嗅觉信号。换句话说，动物鼻子和SPME提取的不同性能可能是对这种取样技术成功的一大挑战。
目前方法的未来发展可以以样品收集为基础，调查使用替代性吸附材料或吸附管用于热脱硫系统。这种发展可能在某种程度上有助于样品储存和运输条件。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢基思·控股协助罗莎琳德·富兰克林科学中心、伍尔弗汉普顿和本·曼特尔制作视频。我们还感谢格洛里亚诺·莫内蒂教授、朱塞佩·皮耶拉奇尼博士和佛罗伦萨大学质谱中心的成员，以及佛罗伦萨CNR ARCA实验室的卢卡·卡拉迈教授和马可·米切洛齐博士帮助建立这种方法。包括手稿中描述的采样和分析方法在内的研究项目得到了两个玛丽·斯考多斯卡-居里欧洲内部研究金（格兰特协议 ID：327083，703611）、来自英国灵长类学会的小额赠款（"感官丰富灵长类动物"）和一笔小型研究补助金（"狩猎采集者有特别的嗅觉吗？'）从英国学院/勒弗胡尔姆信托到S.V.建立这种方法所需的实验室工作也得到了科学和工程学院年度资助竞赛（伍尔弗汉普顿）到S.V.的资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL autosampler vials | Agilent | 5188-5392 | 10 ml screwtop vials with |
| 18 mm vial caps | Agilent | 8010-0139 | Magnetic with PTFE/silicone septa |
| Autosampler | Agilent | GC120 PAL autosampler | |
| Capillary column | Agilent | HP5-MS | 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm |
| Data analysis software | Agilent | - | ChemStation |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890B | |
| Inlet septa | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| Mass Selective Detector | Agilent | 5977A | |
| Reporting software | Microsoft | - | Excel |
| Spectral library | NIST | - | NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library |
| Spectral library search program | NIST | - | MS Search v.2.2 |
| Splitless Inlet liner | Agilent | 5190-4048 | |
| SPME fibres | Agilent | SU57345U | 65 µm PDMS/DVB fibre |
References
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