Summary
In vivo schnelle photochemische Oxidation von Proteinen (IV-FPOP) ist eine Hydroxyl-Radikal-Protein-Footprinting-Technik, die die Kartierung der Proteinstruktur in ihrer heimischen Umgebung ermöglicht. Dieses Protokoll beschreibt die Montage und Einrichtung des mikrofluidischen Strömungssystems IV-FPOP.
Abstract
Die schnelle Oxidation von Proteinen (FPOP) ist eine Methode zur Analyse der Proteinstruktur, der Protein-Ligand-Wechselwirkungen und der Protein-Protein-Wechselwirkungen. FPOP verwendet einen KrF-Excimerlaser bei 248 nm zur Photolyse von Wasserstoffperoxid, um Hydroxylradikale zu erzeugen, die wiederum lösungsmittelzugängliche Aminosäureseitenketten oxidativ modifizieren. Kürzlich haben wir die Verwendung von FPOP der in vivo oxidativen Etikettierung in Caenorhabditis elegans (C. elegans), mit dem Titel IV-FPOP, erweitert. Die transparenten Nematoden wurden als Modellsysteme für viele menschliche Krankheiten verwendet. Strukturstudien in C. elegans von IV-FPOP sind möglich, weil das Tier Wasserstoffperoxid aufnehmen kann, seine Transparenz zur Laserbestrahlung bei 248 nm und die irreversible Natur der Modifikation. Hierbei werden die Montage eines mikrofluidischen Durchflusssystems für die IV-FPOP-Kennzeichnung, IV-FPOP-Parameter, Proteinextraktion und LC-MS/MS-optimierte Parameter beschrieben.
Introduction
Protein-Footprinting gekoppelt an Massenspektrometrie (MS) wurde in den letzten Jahren verwendet, um Protein-Wechselwirkungen und Konformationsveränderungen zu untersuchen. Hydroxyl radical protein footprinting (HRPF)-Methoden sonden die Zugänglichkeit von Proteinlösungsmitteln, indem sie die Seitenketten von Protein-Aminosäuren modifizieren. Die HRPF-Methode, schnelle photochemische Oxidation von Proteinen (FPOP)1, wurde verwendet, um die Proteinstruktur in vitro2, in-cell (IC-FPOP)3und zuletzt in vivo (IV-FPOP)4zu untersuchen. FPOP nutzt einen 248 nm Wellenlängen-Excimer-Laser, um durch Photolyse von Wasserstoffperoxid schnell Hydroxylradikale zu erzeugen, um Hydroxylradikale zu bilden1. Im Gegenzug können diese Radikale 19 von 20 Aminosäuren auf einer Mikrosekunden-Zeitskala kennzeichnen, schneller als Proteine sich entfalten können. Obwohl die Reaktivität jeder Aminosäure mit Hydroxylradikalen 1000-fach verlängert, ist es möglich, die Seitenkettenoxidation durch Berechnung eines Schutzfaktors (PF)5zu normalisieren.
Da FPOP Proteine unabhängig von ihrer Größe oder Primärsequenz oxidativ modifizieren kann, erweist es sich als vorteilhaft für in-zellige und in vivo Proteinstudien. IV-FPOP untersucht die Proteinstruktur in C. elegans ähnlich wie in vitro und in-cell-Studien4. C. elegans sind Teil der Nematodenfamilie und werden häufig als Modell zur Untersuchung menschlicher Krankheiten verwendet. Die Fähigkeit des Wurms, Wasserstoffperoxid sowohl durch passive als auch durch aktive Diffusion aufzunehmen, ermöglicht die Untersuchung der Proteinstruktur in verschiedenen Körpersystemen. Darüber hinaus eignen sich C. elegans für IV-FPOP aufgrund ihrer Transparenz bei der 248 nm Laserwellenlänge, die für FPOP6benötigt wird. Die Kopplung dieser Methode an die Massenspektrometrie ermöglicht die Identifizierung mehrerer modifizierter Proteine mit herkömmlichen Bottom-up-Proteomik-Ansätzen.
In diesem Protokoll beschreiben wir, wie IV-FPOP für die Analyse der Proteinstruktur in C. elegansdurchgeführt wird. Das Versuchsprotokoll erfordert die Montage und Einrichtung eines mikrofluidischen Strömungssystems für IV-FPOP, angepasst von Konermann et al7. Nach IV-FPOP werden Proben für die Proteinextraktion homogenisiert. Proteinproben werden proteolysiert und Peptide werden mit dem Flüssigchromatographen (LC) Tandem MS analysiert, gefolgt von der Quantifizierung.
Protocol
1. C. elegans Pflege und Kultur
- Wachsen und synchronisieren Würmer Kolonien zu ihrer vierten Larven (L4) Stufe nach Standard-Laborverfahren8.
- Am Tag des IV-FPOP-Experiments, waschen L4 Würmer von bakteriellen Rasenflächen (OP50 E. coli) mit M9 Puffer (0.02 M KH2PO4, 0.08 M Na2HPO4, 0.08 M NaCl, 1 mM MgSO4).
- Erhalten Sie 500 L Aliquots von 10.000 Würmern pro IV-FPOP-Probe.
2. Mikrofluidische Durchflusssystem-Montage
- Beginnen Sie die Fließsystembaugruppe, indem Sie einen 2 cm großen Stück fluoriertes Ethylenpropylen (FEP) Rohre (1/16 Zoll Außendurchmesser (o.d.) x 0,020 Zoll Innendurchmesser (i.d.)) schneiden.
- Mit einer sauberen Seznadel, verbreitern Sie die i.d. der FEP-Schläuche, um nur an einem Ende einen kleinen Krater mit einer Länge von 50 mm zu bilden. Der Krater sollte groß genug sein, um zwei 360 m o.d. Stücke von geschmolzener Kieselsäure zu passen.
HINWEIS: Verbreitern Sie nicht das entgegengesetzte Ende, da dieses Ende nur verwendet wird, um die Auslasskapillare zu montieren. - Mit einem Keramikschneider zwei 15 cm große Stücke von 250 m i.d. geschmolzenem Kieselsäure schneiden. Diese beiden Teile werden zu den infundierten Linien des Strömungssystems.
- Mit selbstklebendem Klebeband die beiden 250 m i.d. Kapillaren zusammenkleben, um sicherzustellen, dass sie parallel zueinander sind und ihre Enden zu 100% gespült werden.
HINWEIS: Um sicherzustellen, dass die geschmolzenen Kieselsäureenden nach dem Schneiden nicht zerkleinert und gerade und zu 100% gegeneinander gespült werden, wird empfohlen, sie mit einer Lupe oder unter einem Stereomikroskop zu untersuchen. - Setzen Sie die beiden verklebten Kapillaren in den handgefertigten Krater der FEP-Schläuche ein. Schieben Sie die Kapillaren bis zum Rand des handgefertigten Kraters.
VORSICHT: Um die Wirksamkeit des Strömungssystems aufrechtzuerhalten, schieben Sie nicht am handgefertigten Krater vorbei (Abbildung 1a). - Legen Sie einen kleinen Punkt Epoxidharz auf eine saubere Oberfläche und mischen Sie mit einer Sezierender Nadel.
- Legen Sie schnell mit der gleichen Nadel einen kleinen Tropfen Harz am Ende der infundierten Kapillaren, wo sie sich mit den FEP-Schläuchen verbinden und das Harz für ein paar Minuten trocknen lassen(Abbildung 1a).
- Während das Harz trocknet und die FEP-Schläuche und zwei Kapillaren miteinander verbindet, schneiden Sie eine neue 250-m-i.d.-Kapillare. Die neue Kapillare wird zur Auslasskapillare des Strömungssystems. Die gewünschte Länge der Kapillare kann mit der folgenden Gleichung berechnet werden:
Wobei l die Länge der Kapillare ist, die in Zentimeter geschnitten werden soll, ist t die gewünschte Reaktionszeit in Minuten, f die Durchflussmenge in mL/min und d.h. der Innendurchmesser der Kapillare in Zentimetern.
HINWEIS: Nach dem Schneiden der Auslasskapillare, überprüfen Sie die Enden, um sicherzustellen, dass sie gerade und nicht zerkleinert sind. - Sobald das Harz getrocknet ist, legen Sie die neue Kapillare durch das FEP-Schlauchauslassende. Die innenen Enden der Auslasskapillare und die beiden infundierten Kapillaren sollten im FEP-Schlauch bündig gegeneinander sein, wodurch das Misch-T entsteht (Abbildung 1b).
- Binden Sie die Auslasskapillare und FEP-Schläuche mit frischem Epoxidharz, wie in den Schritten 2.6 und 2.7 beschrieben.
- Lassen Sie das Harz über Nacht trocknen und binden Sie das Strömungssystem miteinander. Richten Sie das mikrofluidische Durchflusssystem am nächsten Tag ein (Abbildung 1c).
3. Mikrofluidisches Durchflusssystem für in vivo FPOP
- Legen Sie vier Magnetrührer in eine 5 ml Spritze ein. Diese Spritze wird zur Probenspritze. Die Magnetischen Rührwerke verhindern, dass sich die Würmer während der IV-FPOP in der Spritze absetzen (Abbildung 2A).
- Füllen Sie die beiden 5 ml Spritzen mit M9. Stellen Sie sicher, dass sich in jeder Spritze keine Luftblasen befinden, da sie die Durchflussrate und die Mischeffizienz beeinflussen können.
- Schließen Sie einen Luer-Adapter an jede 5 ml Spritze an, um sicherzustellen, dass sie an der Stelle des Fingers fest und gesichert sind.
- Befestigen Sie jede Spritze an einem einzigen 3-2 Ventil. Die Spritze sollte am mittleren Anschluss des Ventils befestigt werden (Abbildung 2B).
- Befestigen Sie jede 5 ml Spritze an der Doppelspritzepumpe und stellen Sie den mechanischen Anschlagkragen ein, um einen Überdruck aus dem Schubblock auf die Spritze zu verhindern. Beachten Sie die Zugabe der Magnetischen Rührwerke beim Einstellen des Stoppkragens.
- Befestigen Sie jedes infundierte Kapillarende des hausgemachten mikrofluidischen Durchflusssystems mit einer Super-Flangeless-Mutter, FEP-Hülle und Superflanschferrule an den oberen Anschluss jedes 3-2-Ventils (Abbildung 2B).
- An den verbleibenden geöffneten Anschluss des 3-2 Ventils (Bodenport) befestigen Sie eine 10 cm 450 m i.d. Kapillare mit einer Super-Flangeless-Mutter, FEP-Hülle und Super-Flangeless-Ferrule (Abbildung 2B). Diese Kapillaren werden zu den zurückziehenden Probenkapillaren.
- Starten Sie den Pumpenstrom und prüfen Sie alle Anschlüsse des mikrofluidischen Durchflusssystems auf visuelle Leckagen. Durchfluss von mindestens drei Spritzenvolumen mit der experimentellen Durchflussrate. Die endklassige Durchflussrate hängt vom Laserbestrahlungsfenster, der Laserfrequenz und einem Null-Ausschluss-Fraktionsvolumen ab.
HINWEIS: Für dieses Protokoll wurde aus einem Laserbestrahlungsfenster von 2,55 mm, 250 m i.d. geschmolzenem Kieselsäure, Null-Ausschluss-Fraktion und 50 Hz-Frequenz eine Enddurchflussrate von 375,52 l/min berechnet.- Der Fließweg wird durch die Pfeile am 3-2 Ventilgriff markiert. Jede Spritze kann manuell nachgefüllt werden, indem der Ventilgriff von der Austriebsposition in die Rückzugsposition bewegt wird.
HINWEIS: Leckagen am 3-2 Ventil können durch erneutes Verschrauben der Superflanschmutter oder durch Austausch eines der Ventilanschlüsse (Super-Flangeless-Mutter, FEP-Hülse oder Superflangeless-Ferrule) behoben werden. Leckagen am Misch-T erfordern eine Wiedermontage des mikrofluidischen Durchflusssystems (Schritte 2.1 bis 2.11).
- Der Fließweg wird durch die Pfeile am 3-2 Ventilgriff markiert. Jede Spritze kann manuell nachgefüllt werden, indem der Ventilgriff von der Austriebsposition in die Rückzugsposition bewegt wird.
- Bewegen Sie das mikrofluidische Durchflusssystem auf die Versuchsbank und sichern Sie die Auslasskapillare mit einer 360 m o.d. Edelstahl-Union auf die Strahlungsstufe (Abbildung 2C,D).
- Brennen Sie mit einem Langlichtzeug die Beschichtung des geschmolzenen Kieselsäures am Laserbestrahlungsfenster. Reinigen Sie die verbrannte Beschichtung mit fusselfreiem Gewebe und Methanol.
HINWEIS: Wechseln Sie zwischen Brennzyklen und Methanolreinigungszyklen, um eine Überhitzung der Kapillare zu vermeiden, da überschüssige Wärme schmelzen und/oder die Kapillare brechen kann. - Positionieren Sie den magnetischen Rührblock über der 5 ml Spritze, die die Magnetrührer enthält. Stellen Sie die Geschwindigkeit und Position des Magnetischen Rührblocks so ein, dass sich die Magnetischen Rührwerke in der 5 ml Spritze langsam und konstant drehen.
4. In vivo FPOP
- Schalten Sie den KrF Excimer-Laser ein und lassen Sie den Thyratron aufwärmen.
VORSICHT: Der Laser sendet sichtbare und unsichtbare Strahlung bei einer Wellenlänge von 248 nm aus, die die Augen schädigen kann. Der richtige Augenschutz sollte vor dem Einschalten des Lasers und dem Öffnen des Strahlausgangsfensters getragen werden. - Messen Sie die Laserenergie bei einer Frequenz von 50 Hz für mindestens 100 Impulse, indem Sie den optischen Sensor am Strahlausgangsfenster platzieren.
HINWEIS: Für dieses Protokoll wurde ein 2,55-mm-Bestrahlungsfenster mit einer Laserenergie von 150 x 2,32 mJ verwendet. - Erhalten Sie ca. 10.000 Würmer (500 l) und ziehen Sie die Probe manuell in die Probenspritze.
- Füllen Sie die Probenspritze mit 2,5 ml M9-Puffer für ein endgültiges Probenvolumen von 3 ml. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in die Probenspritze eingeführt werden.
- Füllen Sie die zweite Spritze mit 3 ml von 200 mM H2O2, wieder um sicherzustellen, dass keine Luftblasen in die Spritze eingeführt werden.
- Am Ende der Auslasskapillare ein 15 ml in Aluminiumfolie gewickeltes konisches Rohr mit 6 ml 40 mM N'-Dimethylthiourea (DMTU), 40 mM N-tert-Butyl-Phenylnitron (PBN) und 1% Dimethylsulfoxid aufstellen, um überschüssigeH2O2,Hydroxylradikale zu löschen bzw. Die Aktivität der Methioninsulfoxiddisduzidzuführung zu hemmen.
- Starten Sie den Excimer-Laser aus dem Softwarefenster, warten Sie auf den ersten Impuls, und starten Sie den Probenfluss von der Doppelspritze.
ANMERKUNG: Proben sollten in biologischen Duplikaten in technischen Triplicaten unter 3 Probenbedingungen ausgeführt werden: Laserbestrahlung mit H2O2 (Probe), keine Laserbestrahlung mitH2O2 und keine Laserbestrahlung Nr.H2O2 (Kontrollen), insgesamt 9 Proben pro biologischem Satz. - Sammeln Sie die gesamte Probe in der 15 ml-Röhre, während Sie aktiv den Probenfluss auf visuelle Lecks überwachen, da sich manchmal ein gewisser Gegendruck aus der Probenspritze aufbauen kann.
- Nach IV-FPOP, Pelletwürmer durch Zentrifugation bei 805 x g für 2 min. Löschlösung entfernen, 250 L Lysepuffer (8 M Harnstoff, 0,5% SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid [PMSF]) hinzufügen. Die Probe in ein sauberes Mikrozentrifugenrohr geben, einfrieren und bei -80 °C bis zur Probenverdauung lagern.
5. Proteinextraktion, -reinigung und -proteolyse
- Gefrorene Proben auf Eis auftauen und durch Beschallung für 10 s homogenisieren, gefolgt von einer 60 s Eisinkubation. Es können mehrere Schallungsrunden erforderlich sein, homogenat kann unter einem Stereomikroskop beobachtet werden, indem eine 2-L-Probe aliquot auf einem Mikroskopschlitten platziert wird. Die Probenhomogenisierung ist abgeschlossen, wenn kleine bis keine Würmerstücke zu sehen sind.
- Zentrifugen homogenisierte Würmer bei 400 x g für 5 min bei 4 °C und sammeln den Überstand in ein sauberes Mikrozentrifugenrohr.
- Bestimmen Sie die Probenproteinkonzentrationen mit einem Bicinchoninsäure-Assay (BCA-Assay) anhand der Anweisungen des Herstellers.
HINWEIS: Die Probenkonzentration kann mit jedem biochemischen Proteinkonzentrationstest nach Wahl bestimmt werden. Beachten Sie die Reagenzienkompatibilität mit Lysepuffer (8 M Harnstoff, 0,5% SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF). Zusätzlich kann eine Pufferverdünnung erforderlich sein. - Erhalten Sie 100 g Protein aus jeder Probe und legen Sie sie in saubere Mikrozentrifugenröhrchen.
- Dithiothreitol (DTT) zu einer Endkonzentration von 10 mM hinzufügen, um Disulfidbindungen in allen Proben zu reduzieren. Wirbel, Spin-down, und inkubieren Proben bei 50 °C für 45 min.
- Proben auf Raumtemperatur für 10 min abkühlen.
- Iodoacetamid (IAA) zu einer Endkonzentration von 50 mM hinzufügen, um Alkylat reduzierte Rückstände zu entfernen. Wirbel, Spin-down, und inkubieren Proben für 20 min bei Raumtemperatur vor Licht geschützt.
- Unmittelbar nach der Alkylierung die Proteinprobe durch Zugabe von 4 Bänden von 100% vorgekühltem Aceton ausbrechen und über Nacht bei -20 °C inkubieren.
- Am nächsten Tag fällt Pelletprotein durch Zentrifugation bei 16.000 x g für 10 min aus. Probenpellet mit 90% Aceton waschen, Überstand entfernen und Pellet 2–3 min trocknen lassen.
- Setzen Sie das Proteinpellet in 25 mM Tris-HCl (1 g/l) wieder auf. Trypsin bei einem endgültigen Protease-Protein-Verhältnis von 1:50 (w/w) hinzufügen und Proben bei 37 °C über Nacht verdauen.
- Am nächsten Tag die Trypsin-Verdauungsreaktion durch Zugabe von 5% Ameisensäure zu löschen.
HINWEIS: Für die LC-MS/MS-Analyse ist ein Minimum von 0,5 g Peptiden pro Probe erforderlich (Schritte 6.1-6.5). Bestimmen Sie die Peptidkonzentrationen der Probe anhand eines quantitativen kolorimetrischen Peptid-Assays (siehe Materialtabelle),wie im Protokoll des Herstellers beschrieben.
6. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)
- Verwenden Sie die folgenden mobilen LC-Phasen: Wasser in 0,1% FA (A) und ACN in 0,1% FA (B).
- Mit einem Wasserfall auf eine Fallsäule (180 m x 20 mm) mit C18 (5 m, 100 ) und eine Waschprobe mit 99 % Lösungsmittel A und 1% B für 15 min bei 15 l/min Durchfluss.
- Separate Peptide mit einer hausinternen verpackten Säule (0,075 mm, d.h. 20 mm) mit C18-Reverse-Phasen-Material (5 m, 125 x).
- Verwenden Sie die folgende analytische Trennmethode: Der Gradient wurde bei 300 nL/min für 120 min gepumpt: 0 x 1 min, 3% B; 2 x 90 min, 10 bis 45% B; 100 bis 105 min, 100% B; 106 bis 120 Min., 3% B.
- Führen Sie die Datenerfassung von Peptiden im positiven Ionenmodus Nano-Elektrospray-Ionisation (nESI) mit einem hochauflösenden Massenspektrometer durch.
HINWEIS: Für dieses Protokoll wurde ein Ultra-Performance LC (UPLC) Instrument Paar zu einem hochauflösenden Massenspektrometer verwendet. Es wurde eine datenabhängige Erfassung genutzt. Der m/z-Scanbereich für MS1 betrug 3750–1500 bei einer Auflösung von 60.000 und einem dynamischen Ausschluss von 60 s. Ionen mit Ladungszuständen von +1 und >6 wurden ausgeschlossen. Ein automatisches Gain Control (AGC) Ziel von 5.5e5 wurde mit einer maximalen Injektionszeit von 50 ms und einer Intensitätsschwelle von 5,5e4 verwendet. Für MS2 ausgewählte Ionen wurden einer kollisionsstärkeren Dissoziationsfragmentierung (HCD) mit 32 % normalisierter Kollisionsenergie ausgesetzt. Fragmentionen wurden im Spektrometer mit 15.000 Auflösung und einem AGC-Ziel von 5,0e4 nachgewiesen.
7. Datenanalyse
- Durchsuchen Sie Tandem-MS-Dateien mit einer Bottom-up-Proteomik-Analysesoftware mit der C. elegans-Datenbank.
- Stellen Sie die Suchparameter für die Proteinanalyse wie folgt ein: ein Trypsin verfehlte Spaltung, 375–1500 m/z Peptidmassenbereich, Fragmentmassentoleranz von 0,02 und Vorläufermassentoleranz von 10 ppm. Carbamidomethylierung wird als statische Modifikation eingestellt und alle kennen Hydroxylradikale Seitenkettenmodifikationen9,10 als dynamisch. Die Peptididentifikation wird bei 95% Vertrauen (mittel) und Rückständen bei 99% Vertrauen (hoch) festgestellt. Die false discovery rate (FDR) wird auf 1% festgelegt.
- Exportieren Sie Daten in eine elektronische Datenbank und fassen Sie das Ausmaß der Oxidation pro Peptid oder Rückstand unter Verwendung der Gleichung unter11zusammen:
ANMERKUNG: Bei geändertem EIC-Bereich ist der extrahierte Ionenchromatographiebereich (EIC) des Peptids oder Rückstands mit oxidativer Modifikation und eIC die Gesamtfläche desselben Peptids oder Rückstands mit und ohne oxidative Modifikation.
Representative Results
Im mikrofluidischen Durchflusssystem für IV-FPOP werdenH2O2 und die Würmer bis kurz vor der Laserbestrahlung getrennt gehalten. Diese Trennung eliminiert den Abbau vonH2O2 durch endogene Katasse und andere zelluläre Mechanismen12. Die Verwendung einer 250-m-I.d.-Kapillare zeigt eine Gesamtrückgewinnung der Probe zwischen 63 und 89 % in zwei biologischen Replikationen, während die 150-m-i.d.-Kapillare nur eine Rückgewinnung von 21–31 % zeigt(Abbildung 3A). Die Verwendung einer größeren i.d. Kapillare (250 m) führt zu einem besseren Wurmfluss während DES IV-FPOP und des einzelnen Schneckenflusses (Abbildung 3B) im Vergleich zu einer kleineren i.d. Kapillare (150 m) (Abbildung 3C). Die 150-m-I.d.-Kapillare erlaubt keinen einzelnen Wurmfluss(Abbildung 3C) und mehrere Würmer fließen zusammen am Laserbestrahlungsfenster, was die Laserexposition pro einzelnen Wurm verringert.
IV-FPOP ist eine kovalente Etikettiertechnik, die die Lösemittelzugänglichkeit in C. elegansuntersucht. Abbildung 4A zeigt ein repräsentativ extrahiertes Ionenchromatogramm (EIC) eines FPOP modifizierten und unveränderten Peptids. Das Hydroxylradikal-Label verändert die Chemie oxidativ modifizierter Peptide und macht so FPOP-modifizierte Peptide polarer. In der Reverse-Phase-Chromatographie haben IV-FPOP-modifizierte Peptide frühere Retentionszeiten als unveränderte Peptide. Ms/MS-Fragmentierung isolierter Peptide ermöglicht die Identifizierung oxidativ modifizierter Rückstände (Abbildung 4B).
IV-FPOP hat gezeigt, dass insgesamt 545 Proteine in zwei biologischen Replikationen innerhalb von C. elegans oxidativ modifiziert wurden (Abbildung 5A,B). Ein Vorteil von IV-FPOP als Protein-Footprinting-Methode beruht auf der Fähigkeit der Technik, Proteine in einer Vielzahl von Körpersystemen innerhalb der Würmer zu modifizieren (Abbildung 5C). Diese Methode würde es ermöglichen, Proteinstruktur und Proteinwechselwirkungen unabhängig von Körpergewebe oder Organ innerhalb des Wurms zu untersuchen. Darüber hinaus bestätigt die Tandem-MS-Analyse, dass IV-FPOP-Sonden die Lösemittel-Zugänglichkeit in vivo untersuchen. Das Oxidationsmuster des Hitzeschockproteins 90 (Hsp90) im Komplex mit dem Myosin-Chaperonprotein UNC-45 wurde analysiert (Abbildung 6). Die MS/MS-Analyse für Hsp90 zeigt vier oxidativ modifizierte Rückstände (Abbildung 6C,D), das normalisierte Ausmaß der FPOP-Modifikation (ln(PF))5 zeigt an, dass der Rückstand M698 von Hsp90 weniger lösungsmittelzugänglich ist als die Rückstände R697, E699 und E700, wenn er an UNC-45 gebunden ist (Abbildung 6C). Diese Oxidationsunterschiede werden durch Lösemittel-Berechnungen (SASA) validiert (PDB 4I2Z13). Rückstand M698 hat einen SASA-Wert von 0,03, der im Vergleich zu den Rückständen R697, E699 und E700 mit höheren SASA-Werten als vergrabener Rückstand gilt (Abbildung 6C). 14
Abbildung 1. In vivo FPOP mikrofluidisches Strömungssystem schematisch. (A) Die beiden Infeben (orange) des IV-FPOP-Durchflusssystems sind im FEP-Schlauch (gelb) dargestellt, die korrekte Bindungsposition des Epoxidharzes wird durch den hellblauen Kreis dargestellt. (B) Komplett montiertes Misch-T, gebildet durch die drei 250 m i.d. Kapillaren. Die korrekte Harzbindungsposition der Auslasskapillare zum FEP-Schlauch wird durch den hellblauen Kreis dargestellt. (C) Das komplette montierte Durchflusssystem für die in vivo kovalente Etikettierung von C. elegans. Vor FPOP werden Würmer bis kurz vor der Etikettierung von H2O2 getrennt gehalten; das Laserbestrahlungsfenster ist hellblau dargestellt und der Laserstrahl wird durch den violetten Blitz dargestellt. Zahlen sollen nicht skaliert werden. Diese Zahl wurde von Espino et al.4geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Mikrofluidisches System während IV-FPOP. (A) Repräsentatives Bild von C. elegans in der 5 ml Spritze. Ohne Rühren setzen sich die Würmer am Boden der Spritze ab (links). Die Magnetrührer und der Rührblock halten die Würmer während der IV-FPOP-Experimente in Suspension (rechts). (B) Repräsentatives Bild einer 5 ml Spritze, infundierender Kapillare und zurückziehender Kapillare, die mit dem 3-2-Ventil verbunden ist. Der 3-2 Ventilgriff wird in der Rückzugsposition angezeigt. (C) Mikrofluidisches Durchflusssystem während IV-FPOP, der magnetische Rührblock befindet sich position über der 5 ml Spritze der Würmer. (D) Auslasskapillare an der Strahlungsstufe befestigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Vergleich von C. elegans Fluss und Erholung mit zwei i.d. Kapillaren. (A) Prozentuale Rückgewinnung von Würmern nach IV-FPOP für zwei biologische Replikationen (BR) mit 250 (grau) und 150 (schwarz) m i.d. Kapillaren. Fehlerbalken werden aus der Standardabweichung über technische Triplicates berechnet. C. Elgane, die durch das Laserbestrahlungsfenster durch eine 250 m (B) und 150 m (C) i.d. Kapillaren fließen. Die Würmer sind in der kleineren Kapillare fester verdichtet. Die 150 m i.d. Kapillare zeigt das Verklumpen von Würmern. Diese Zahl wurde von Espino et al.4geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Repräsentative LC-MS/MS Ergebnisse nach IV-FPOP. (A) EIC eines FPOP modifizierten Peptids (rot) und unverändert (blau). Das ausgewählte Peptid gehört zum Actin-1-Protein. (B) MS/MS-Spektrum des doppelt aufgeladenen unveränderten Aktin-1-Peptids 317-327. (C) MS/MS-Spektrum des doppelt aufgeladenen FPOP-modifizierten Actin-1-Peptids 317-327, in diesem Beispiel wurde P323 oxidativ modifiziert (y5+ ion, rot). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5. IV-FPOP modifiziert Proteine in C. elegans oxidativ. (A) Venn-Diagramm von oxidativ modifizierten Proteinen in Gegenwart von 200 mM Wasserstoffperoxid bei 50 Hz über zwei biologische Repliken (BR), BR1 ist in blau und BR2 ist in gelb. (B) Venndiagramm oxidativ modifizierter Proteine, die in bestrahlten Proben, Wasserstoffperoxidkontrolle und nur Wurmbekämpfung in BR2 über technische Triplicate hinweg identifiziert wurden. (C) Kreisdiagramm oxidativ modifizierter Proteine innerhalb verschiedener C. elegans Körpersysteme. Diese Zahl wurde von Espino et al.4geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6. Korrelierende IV-FPOP-Modifikationen an der Lösemittel-Zugänglichkeit. (A) Myosin-Chaperon-Protein UNC-45 (grau) (PDB-ID 4I2Z13) Hervorhebung von zwei modifizierten Peptiden, die durch LC/MS/MS-Analyse identifiziert wurden, 669-680 und 698-706 (grün, links eingelassen). UNC-45 ist an das Hsp90 Peptidfragment (blau) gebunden. Oxidativ modifizierte Rückstände innerhalb dieses Fragments werden in Stöcken (rot) dargestellt, und UNC-45 wird als Oberfläche gerendert (rechte eingesteckt). (B) Tandem-MS-Spektren von UNC-45-Peptid 669-680 (oben) und 698-706 (unten) mit B- und Y-Ionen für den Verlust vonCO2, einer FPOP-Modifikation. (C) Berechnete ln(PF) für die oxidativ modifizierten Hsp90-Rückstände, R697, M698, E699 und E700. Berechnete SASA-Werte für Hsp90 werden über jedem Rückstand angegeben. (D) Tandem-MS-Spektren für R697, M698, E699 und E700 mit einer +16-FPOP-Modifikation. Diese Zahl wurde von Espino et al.4geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Der aktuelle Maßstab für die Untersuchung von In-vivo-Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) ist die Fluoreszenzresonanz-Energieübertragung (FRET). In ihrer einfachsten Form untersucht diese Technik PPI durch Energietransfer zwischen zwei Molekülen, wenn sie sich in unmittelbarer Nähe zueinanderbefinden 15. Im Gegensatz zu MS-Techniken hat FRET nicht die Auflösung, um Konformationsänderungen und Interaktionsstellen auf Aminosäureebene zu charakterisieren. MS-basierte Techniken wurden zunehmend für die Untersuchung von PPI16verwendet. IV-FPOP ist eine HRPF-Methode, die die In-vivo-Proteinstrukturanalyse in C. elegans ermöglicht. Um C. elegans erfolgreich mit IV-FPOP zu kennzeichnen, ist es wichtig, das mikrofluidische Durchflusssystem richtig zu montieren, um Probenverluste zu reduzieren. Die 250-m-I.d.-Kapillare hat gezeigt, dass die Probenrückgewinnung im Vergleich zu kleineren i.d. Kapillaren4maximiert wird. Größere i.d. Kapillaren wurden nicht getestet, aber das mikrofluidische Durchflusssystem ist mit einer Kapillare mit dem gleichen i.d. wie ein handelsübliches Durchflusszytometriesystem für die Sortierung von C. elegansausgelegt. 17 Die Größe der Wurmprobe ist ebenfalls wichtig, da eine Stichprobengröße von weniger als 10.000 USD pro Probe vor FPOP keine Proteinkonzentrationen liefert, die für die LC-MS/MS-Analyse hoch genug sind. Höhere Stichprobengrößen (>10.000 Würmer) können auch verwendet werden, indem das anfängliche Startvolumen angepasst wird (Schritt 4.5).
Die richtige Montage des mikrofluidischen Durchflusssystems ist wichtig. Leckagen im Probenweg führen zu einem inkonsistenten Fluss der Würmer oder H2O2. Die Ferrules, Hülsen und 3-2 Ventile können aus mehreren IV-FPOP-Experimenten wiederverwendet werden, wenn sie nach jedem Experiment richtig gereinigt werden. Wir empfehlen jedoch, für jede biologische Replikation ein neues mikrofluidisches Durchflusssystem zusammenzustellen. Wenn die Mikrofluidik richtig montiert ist, mischen sich die Würmer und H2O2 am Misch-T mit minimalem Gegendruck. Als Qualitätskontrolle (QC) des mikrofluidischen Durchflusssystems empfehlen wir, die Mischeffizienz mit farbigen Farbstoffen zu testen. Es ist wichtig, die Bewegung der Magnetrührer in der Schneckenspritze während des IV-FPOP zu überwachen, unsachgemäßes Probenmischen an der Schneckenspritze oder das Misch-T kann zu Rückdrücken führen, die Leckagen verursachen. Darüber hinaus führen schlechte Mischbedingungen zu großen Probenverlusten, schlechter Laserbelichtung von Würmern am Laserfenster und Verstopfung.
C. elegans Wartung ist wichtig, um die Hintergrundoxidation zu verringern. Wir empfehlen, die Würmer bei niedrigen Temperaturen unter niedrigen Stressbedingungen anzubauen, da hohe Temperaturen die gesamte Hintergrundoxidation beeinflussen können. Für alle IV-FPOP-Experimente wird empfohlen, eine Kontrollprobe nur von Würmern, keineH2O2 und keine Laserbestrahlung, um die Hintergrundoxidation aufgrund von Laborwartungen zu berücksichtigen. Eine der aktuellen Einschränkungen dieser Technik ist die Gesamtzahl der identifizierten oxidativ modifizierten Peptide und die Gesamtzahl der pro Peptid oxidierten Rückstände, um höhere Proteinstrukturinformationen zu erhalten. Obwohl nicht empfohlen, könnte eine Erhöhung der oxidativen Modifikationen durch die Verwendung höherer Konzentrationen von Wasserstoffperoxid erreicht werden. Eine Erhöhung des Wasserstoffperoxids könnte wichtige biologische Wege signifikant verändern und zu oxidationsinduzierter Entfaltung führen. Wenn die Wasserstoffperoxidkonzentration für IV-FPOP erhöht ist, wird empfohlen, die Lesefähigkeit und Dieoxidation im Hintergrund zu testen, da Konzentrationen von mehr als 200 mM nicht getestet wurden.
Das beschriebene LC-MS/MS-Protokoll kann optimiert und modifiziert werden, um dem MS QC anderer Laboratorien gerecht zu werden. Die Verwendung von 2D-Chromatographie-Techniken hat sich bisher gezeigt, dass die Identifizierung von oxidativ modifizierten Peptiden und Proteinen zu erhöhen18. Dennoch werden Proteinanreicherungstechniken, die auf ein bestimmtes Protein von Interesse abzielen, nicht empfohlen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Antikörperfällungen oder Pull-Down-Assays. Diese Techniken können zu einem Protein-Conformer tendieren, wenn die Epitop-/Bindungsstelle des Proteins durch IV-FPOP oxidativ modifiziert wurde. Neue Entwicklungen bei der Grundierung radikaler Reagenzien, wie Z.O. Anion10 oder Trifluoromethylierung19, könnten die Vielseitigkeit von IV-FPOP erhöhen. Obwohl das bisher einzige in vivo getestete Etikettierungsreagenz Wasserstoffperoxid ist, konnten andere laseraktivierte Radikale optimiert werden. Die Verwendung anderer Radikale sollte sich als kompatibel mit der Wurmlebensfähigkeit, der zelldurchlässigen und der 248 nm Laserwellenlänge erweisen. Durch die Verwendung von C. elegans als Modellsystem für viele menschliche Krankheiten hat IV-FPOP das Potenzial, einen starken Einfluss auf die Untersuchung der Rolle der Proteinstruktur bei der Pathogenese von Krankheiten zu haben.
Disclosures
Diese Veröffentlichung wurde in teilweiser Erfüllung der JAE Ph.D. Arbeit geschrieben. Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Start-up-Fonds der University of Maryland, Baltimore und des NIH 1R01 GM 127595 unterstützt, das LMJ verliehen wurde. Die Autoren danken Dr. Daniel Deredge für seine Hilfe bei der Bearbeitung des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | 2 minimum |
| 60 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FM3279 | This item is no longer available. Any low-volume sonicator will be sufficient |
| Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
| ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ||
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
| Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Dissecting Needle | Fisher Scientific | 50-822-525 | only a couple are needed |
| Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Epoxy instant mix 5 minute | Loctite | 1365868 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-100 | |
| EX350 excimer laser (248 nm wavelength) | GAM Laser | ||
| FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Sciene | 1548L | |
| Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | 2 minimum |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
| Legato 101 syringe pump | KD Scientific | 788101 | |
| Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Sciene | P-618L | 2 minimum |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
| NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x1.6"' | IDEX Health & Sciene | F-242X | |
| NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Sciene | F-246 | |
| N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
| OmniPur Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 7110-OP | any protease inhibitor is sufficient |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used | |
| PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 250µm, Outer Diameter 350µm, TSP250350 | Polymicro Technologies | 1068150026 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450µm, Outer Diameter 670µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75µm, Outer Diameter 375µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
| Proteome Discover (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
| Scissors | Fisher Scientific | 50-111-1315 | any scissors are sufficient |
| Self-Adhesive Label Tape | Fisher Scientific | 15937 | one roll is sufficient |
| Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes | Fisher Scientific | 05-402 | any brand is sufficient |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | 15-525-017 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | |
| Stereo Zoom Microscope | Fisher Scientific | 03-000-014 | a magnifying glass is sufficient |
| Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Sciene | P-259X | |
| Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Sciene | P-255X | |
| Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Universal Base Plate, 2.5" x 2.5" x 3/8" | Thorlabs Inc. | UBP2 | |
| Urea | Fisher Scientific | U5378 | |
| VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Sciene | UH-436 | 2 minimum |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
References
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. J Am Soc Mass Spectrom. 16 (12), 2057-2063 (2005).
- Jones, L. M., Sperry, J. A., Carroll, J., Gross, M. L. Fast Photochemical Oxidation of Proteins for Epitope Mapping. Analytical Chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).
- Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. In Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry for the Structural Analysis of Proteins in Live Cells. Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).
- Espino, J. A., Jones, L. M. Illuminating Biological Interactions with in Vivo Protein Footprinting. Analytical Chemistry. 91 (10), 6577-6584 (2019).
- Huang, W., Ravikumar, K. M., Chance, M. R., Yang, S. Quantitative mapping of protein structure by hydroxyl radical footprinting-mediated structural mass spectrometry: a protection factor analysis. Biophysical Journal. 108 (1), 107-115 (2015).
- Keller, C. I., Calkins, J., Hartman, P. S., Rupert, C. S. UV photobiology of the nematode Caenorhabditis elegans: action spectra, absence of photoreactivation and effects of caffeine. Photochemistry and Photobiology. 46 (4), 483-488 (1987).
- Konermann, L., Collings, B. A., Douglas, D. J. Cytochrome c Folding Kinetics Studied by Time-Resolved Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Biochemistry. 36 (18), 5554-5559 (1997).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
- Gau, B. C., Chen, H., Zhang, Y., Gross, M. L. Sulfate radical anion as a new reagent for fast photochemical oxidation of proteins. Analytical Chemistry. 82 (18), 7821-7827 (2010).
- Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. An efficient quantitation strategy for hydroxyl radical-mediated protein footprinting using Proteome Discoverer. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (11), 3021-3031 (2016).
- Wagner, B. A., Witmer, J. R., van't Erve, T. J., Buettner, G. R. An Assay for the Rate of Removal of Extracellular Hydrogen Peroxide by Cells. Redox Biology. 1 (1), 210-217 (2013).
- Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
- Willard, L., et al. VADAR: a web server for quantitative evaluation of protein structure quality. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3316-3319 (2003).
- Broussard, J. A., Green, K. J. Research Techniques Made Simple: Methodology and of Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
- Kaur, U., et al. Evolution of Structural Biology through the Lens of Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (1), 142-155 (2019).
- Pulak, R. C. elegans: Methods and Applications. Strange, K. , Humana Press. 275-286 (2006).
- Rinas, A., Jones, L. Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled to Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT): Expanding Footprinting Strategies to Complex Systems. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 540-546 (2015).
- Cheng, M., Zhang, B., Cui, W., Gross, M. L. Laser-Initiated Radical Trifluoromethylation of Peptides and Proteins: Application to Mass-Spectrometry-Based Protein Footprinting. Angewandte Chemie International Edition. 56 (45), 14007-14010 (2017).
