Summary
Aqui, apresentamos um método eficiente para a purificação de oligodendrocytes e produção de meio condicioso oligodendrocyte que pode ser usado para experimentos de cocultura.
Abstract
No sistema nervoso central, os oligodendrocytes são bem conhecidos por seu papel na mielinação de axon, que acelera a propagação de potenciais de ação através da condução saltatória. Além disso, um número crescente de relatórios sugere que os oligodendrocitos interagem com neurônios além da mielinização, notadamente através da secreção de fatores solúveis. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado que permite a purificação de células de linhagem oligodendroglial de culturas células gliais também contendo astrócitos e células microgliais. O método conta com tremores noturnos a 37 °C, o que permite o desprendimento seletivo das células oligodendrólais e células microgliais, e a eliminação da microglia por adesão diferencial. Descrevemos então a cultura dos oligodendrocytes e a produção de meio climatizado pelo oligodendrocyte (OCM). Também fornecemos as cinéticas do tratamento oCM ou oligodendrocytes, além de neurônios hipocampais purificados em experimentos de cocultura, estudando interações oligodendrocyte-neurônio.
Introduction
Oligodendrocytes (OLs) são células gliais do sistema nervoso central (CNS) que geram embalagem de mielina em torno de axônios. Os OLs são originários de células precursoras de oligodendrocyte (OPCs) que proliferam dentro das zonas ventriculares do CNS embrionário e depois migram e se diferenciam em OLs totalmente maduros (ou seja, células formadoras de mielina)1. Os OPCs são abundantes durante o desenvolvimento precoce, mas também persistem no cérebro adulto, onde representam a maior população de células proliferativas2. Um único OL enshea vários axônios em seções não excitáveis (ou seja, internodes), e a borda de cada alça de mielina se conecta ao axônio formando o domínio paranodal que é crucial para as propriedades isolantes da mielina1,3. Entre os desfiles estão pequenas lacunas immielinizadas chamadas os nós de Ranvier. Esses nós são ricos em canais de sódio fechados por tensão (Nav), permitindo a regeneração e rápida propagação de potenciais de ação através da condução saltatória4. Essa interação apertada também permite o suporte à energia axonal através da captação neuronal de lactato de OLs5,6.
O amadurecimento das células de linhagem oligodendroglial e o processo de mielinação são fortemente regulados por suas interações com neurônios7. De fato, OLs e OPCs, também chamados de células NG2, expressam uma série de receptores para neurotransmissores, e podem receber entrada de neurônios excitatórios e inibitórios, permitindo que eles detectem atividade neuronal que pode desencadear sua proliferação e/ou diferenciação em células mielinantes2. Por sua vez, opcs/OLs secretam microvesicles e proteínas no espaço extracelular que sozinho ou sinergicamente mediam funções neuromodulativas e neuroprotetoras8,9,10,11,12. No entanto, os mecanismos moleculares que controlam os múltiplos modos de interações entre células de linhagem oligodendroglial e neurônios ainda não foram totalmente decifrados.
Além disso, em várias condições patológicas do CNS, os OLs são afetados principalmente, perturbando assim sua interação com os neurônios. Por exemplo, na Esclerose Múltipla (EM), a disfunção neurológica é causada pela desmistelinação focal no CNS, secundária à perda de OLs que pode levar a danos axonais e acúmulo de incapacidade relacionada. A remielinização pode ocorrer, embora insuficientemente na maioria dos casos13. O progresso na última década, devido ao desenvolvimento de imunoterapias, reduziram a taxa de recaída, mas promover a remielinização permanece até o momento uma necessidade não atendida. Como tal, uma melhor compreensão do papel, funções e influências das OLs é de particular interesse para o desenvolvimento de novas terapias para um amplo espectro de condições de CNS.
Aqui, descrevemos os métodos de purificação e cultura das OLs. Isso permite o exame preciso de mecanismos intrínsecos que regulam seu desenvolvimento e biologia. Além disso, tais culturas altamente enriquecidas de OLs permitem a produção de meio com condições de oligodendrocito (OCM), que pode ser adicionado às culturas de neurônios purificados para obter uma visão do impacto de fatores secretos do OLs na fisiologia neuronal e conectividade. Além disso, descrevemos como implementar um sistema de co-cultura in vitro onde oligodendrocitos purificados e neurônios são combinados, permitindo abordar os mecanismos que regulam (re)mielinação.
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Protocol
O cuidado e o uso de ratos neste experimento estão em conformidade com políticas e diretrizes institucionais (UPMC, INSERM e Diretiva do Conselho Comunitário Europeu 86/609/CEE). O seguinte protocolo é estabelecido para uma ninhada padrão de 12 filhotes.
1. Preparação dos frascos (~5 min)
NOTA: Realize as seguintes etapas no dia anterior à dissecção em um capô de fluxo laminar em condições estéreis.
- Cubra os frascos de 150 cm2 (T150) com tampa de filtro (1 frasco para 2 filhotes) utilizando 5 mL de polietileimina (PEI, 100 mg/L, consulte protocolo no Arquivo Complementar 1).
- Armazene os frascos a 4 °C durante a noite.
- Frascos revestidos de enxágue 3 vezes com água destilada estéril no dia da dissecção.
2. Preparação da mídia (~10 min)
NOTA: Realize os passos em um capô de fluxo laminar em condições estéreis.
- Prepare 500 mL de meio cultural, composto pelo meio de Águia modificado (DMEM) de Dulbecco complementado com 10% do soro fetal de bezerro (FCS) e penicilina-estreptomicina (100 UI/mL).
- Prepare 20,6 mL do meio de digestão enzimática em um tubo de 50 mL, composto por 20 mL de DMEM, 200 μL de DNase (50 μg/mL), 200 μL de mamão (30 U/mL) e 200 μL de L-cysteine (0,24 mg/mL).
- Filtrar-esterilizar a mídia usando um filtro de 0,22 μm.
- Mantenha a mídia no capô de fluxo laminar à temperatura ambiente (RT) até dissecção.
3. Preparação para dissecção (~10 min)
NOTA: Realize os passos em um capô de fluxo laminar em condições estéreis.
- Prepare 100 mL de sálina tampão de fosfato sem cálcio e magnésio (PBS; 1x). Esterilizar o filtro usando um filtro de 0,22 μm.
- Prepare 50 mL de solução PBS gelada 1x complementada com 750 μL de 45% de glicose. Esterilizar o filtro usando um filtro de 0,22 μm.
- Encha uma placa de petri de 100 mm com 1x PBS para instrumentos de limpeza e três pratos petri de 60 mm com pbs-glicose gelada para colheita de tecidos. Coloque as placas de petri no gelo até dissecar.
4. Dissecção
NOTA: A dissecação é realizada entre filhotes de rato Wistar masculino e feminino no dia pós-natal (P) 2.
- Para proporcionar um ambiente estéril, certifique-se de limpar o banco com 100% de etanol. Esterilizar todas as ferramentas cirúrgicas com 100% de etanol.
- Pulverizar suavemente o pescoço do filhote com 70% de etanol.
- Use uma tesoura cirúrgica grande para decapitar o animal e colocar a cabeça em uma placa de Petri de 100 mm contendo pbs-glicose gelada.
- Use fórceps curvos para manter a cabeça do animal no nível dos olhos. Use uma pequena tesoura cirúrgica para fazer uma pequena incisão na base do crânio e corte o crânio seguindo a linha média cerebral.
- Use fórceps para retirar suavemente as duas partes do crânio da linha média.
- Use uma pequena colher cirúrgica para remover o cérebro da cavidade da cabeça. Coloque o cérebro em uma placa de Petri de 60 mm contendo pbs-glicose gelada no gelo.
- Visualizando um steromicroscópio, use fórceps finos para remover o cerebelo, o tronco cerebral e lâmpadas olfativas dos hemisférios cerebrais.
- Use fórceps finos para separar os dois hemisférios cerebrais. Use fórceps finos para descascar as meninges. Coloque os cortices cerebrais em uma placa de petri de 60 mm no gelo.
NOTA: O PBS gelado é fundamental para a remoção correta de meninges.
5. Dissociação tecidual
NOTA: Realize os passos em um capô de fluxo laminar em condições estéreis.
- Use um bisturi afiado para cortar finamente os cortices cerebrais. Transfira o tecido picado para um tubo de 50 mL contendo meio de digestão enzimática.
- Incubar por 30 min em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO2.
- Use uma micropipeta p1000 para remover suavemente o meio de digestão da enzima, certificando-se de que o tecido cortical permanece na parte inferior do tubo de 50 mL.
- Use uma micropipette p1000 para adicionar 1 mL de DMEM-10% FCS e triturar suavemente o tecido.
- Use um filtro de 70 μm e um pistão de uma seringa de 1 mL para filtrar o tecido cortical em um tubo de 50 mL.
NOTA: Pode-se enxaguar tecido residual na parede interna do tubo várias vezes com DMEM-10% FCS. - Encha o tubo de 50 mL com DMEM-10%FCS. Centrífuga a 423 x g por 5 min na RT. Remova cuidadosamente a supernatant e resuspenda a pelota celular com 2 mL de DMEM-10%FCS.
- Triturar suavemente a pelota celular com uma micropipeta p1000 e, em seguida, com uma micropipeta p200. Diluir a suspensão celular com o volume apropriado de DMEM-10%FCS.
NOTA: Dois cérebros = um T150 = 5 mL de DMEM-10%FCS. - Placa 5 mL da suspensão celular em um T150 a uma densidade de 1 x 105 células/cm2. Adicione 20 mL de DMEM-10%FCS quente a cada T150. Incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO2.
- Renovar metade do meio cultural após 6 dias in vitro (DIV) com DMEM-10%FCS quente.
6. Preparação de agitação
- Realize a preparação agitada no dia anterior ao tremor em um capô de fluxo laminar em condições estéreis.
- Renovar metade do meio cultural adicionando meio de cultura quente fresca ao frasco e incubaa a 37 °C abaixo de 5% de CO2.
7. Tremendo
- Cubra três pratos petri de 100 mm com PEI. Guarde-os a 4 °C durante a noite.
- Cubra o boné com filme de parafina e coloque os frascos em um saco plástico. Frascos de shake contendo células gliais durante a noite a 250 rpm a 37 °C.
NOTA: Primeiro tremor é realizado em 8 DIV e pode-se realizar até três tremores diferentes (ver Figura 1 para cronometragem).
8. Colagem de células de linhagem e cultura
NOTA: Essas etapas devem ser realizadas em um capô de fluxo laminar em condições estéreis.
- No dia seguinte ao tremor, prepare o meio Bottenstein-Sato (BS) de acordo com a Tabela 1.
- Enxágüe pratos de Petri revestidos 3 vezes com água destilada estéril.
- O supernatante de frascos de colheita contendo principalmente células de linhaGem OL, mas também algumas células microgliais e emplaca-o em pratos petri não revestidos de 100 mm.
NOTA: Esta etapa permite a remoção de células microgliais através de adesão rápida diferencial na superfície do prato. - Incubar as placas de Petri por 15 min em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO2.
- Encha cada frasco T150 com 25 mL de meio de cultura quente e incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO2 até o segundo tremor.
- Transfira o supernatante das placas de Petri para novas placas de Petri não revestidas de 100 mm para permitir a adesão de células microgliais residuais.
- Incubar as placas de Petri por 15 min em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO2.
- Remova o supernatant, que contém células de linha OL não aderentes, e transfira-o para tubos de 50 mL (supernatante de 2 pratos petri para um tubo de 50 mL). Descarte pratos petri banhados com microglia.
- Centrífuga o supernatante por 5 min a 423 x g. Remova cuidadosamente a pelota de célula e resuspenda a pelota celular com 1 mL de meio BS. Pool todas as pelotas em um tubo comum de 50 mL e ajuste o volume para 10 mL com meio BS.
- Determine a densidade celular contando células um microscópio.
NOTA: Deve ser obtida uma densidade celular entre 3 x 105/mL e 5 x 105/mL. - Adicione 20 mL de BS se a densidade celular for maior ou igual a 4 x 105/mL para obter um volume final de 30 mL, ou adicionar apenas 10 mL de BS se a densidade celular for inferior a 4 x 105/mL para obter um volume final de 20 mL.
- Placa de dois ou três pratos de petri pré-revestidos de 100 mm com 10 mL de suspensão celular. Incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO2.
- Limpe os detritos das placas de Petri refrescando todo o meio BS 2 h depois.
NOTA: Examine a cultura o microscópio antes e depois da limpeza para verificar a densidade celular e a eficiência da remoção dos detritos. - Incubar por 2 dias em meio BS em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO2.
NOTA: Examine a cultura o microscópio. A confluência deve ser de 70% a 80%.
9. Produção de OCM
NOTA: Realize estas etapas em um capô de fluxo laminar em condições estéreis.
- Prepare nb-B27low médio de acordo com a Tabela 2.
- Renovar o meio cultural com 10 mL de meio NB-B27low quente. Incubar por 2 dias em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO2.
- Colher o OCM, ou seja, supernatante contendo fatores secretos oL. Filtrar o CM-esterilizador usando um filtro de 0,22 μm.
NOTA: Armazene OCM a 4 °C por máxima de 2 meses.
10. Adição de OCM
NOTA: As etapas devem ser realizadas em um capô de fluxo laminar em condições estéreis. O CM pode ser adicionado às culturas de neurôniohipocampais purificadas preparadas de acordo com o seguinte protocolo14, e obtidas adicionando, 24 h após o isolamento, os agentes anti-mitocóticos uridine e 5-fluorodeoxyuridina (5 μM) por 36 h.
- A 3 DIV, remova todo o meio de cultura do neurônio contendo agentes antimitóticos e adicione 500 μL de OCM fresco quente.
- Renovar metade do meio a cada 3 dias com RN-B27 recém-feito quente.
NOTA: Tais culturas podem ser mantidas até 21 DIV.
11. Adição de OL à cultura purificada do neurônio hipocampal
NOTA: Realize as seguintes etapas em um capô de fluxo laminar em condições estéreis. OLs podem ser adicionados às culturas hipocampais purificadas obtidas da mesma forma descrita acima.
- Prepare o meio de cocultura de acordo com a Tabela 3.
- Recupere a cultura OL em 70% a 80% de confluência. Enxágüe com 2 mL de PBS quente 1x.
- Para separar as células, adicione 2 mL de 0,25% de trypsin a uma placa de Petri de 100 mm.
- Incubar por 5 min em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO2.
- Adicione 2 mL de DMEM-10% FCS para bloquear a reação enzimática. Colher o supernatante contendo células de linhagem OL.
- Centrífuga a 423 x g por 5 min na RT. Remova cuidadosamente o supernatant e resuspenda a pelota celular em meio de cocultura quente para obter uma concentração de 1,25 x 105 células/mL.
- Adicione OL à cultura purificada dos neurônios hipocampais removendo 200 μL do meio de cultura do neurônio e adicionando 200 μL de suspensão celular por poço (2,5 x 104 células/poço) de uma placa de 24 poços.
- Refrescar metade do meio de cocultura a cada 2-3 dias.
NOTA: As coculturas podem ser mantidas até 24 DIV.
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Representative Results
Neste protocolo, as células de linhagem OL são purificadas das culturas gliais, sacudindo astrócitos e microglia. Pureza e exame adesivo das culturas OL podem ser avaliados por imunomanchas com marcadores gliais15. A análise da expressão de diferentes marcadores indicou que as culturas ol eram principalmente pré-OLs com 90% ± 4% das células O4+, 85% ± 7% NG2+ células, e 4,7% ± 2,1% das células PLP+, enquanto 7,2% ± 2,5% das células eram GFAP+ astrócitos (média ± S.D., n = 3; Figura 2). Além disso, 4,6% ± 0,7% das células eram células CD11b+ microglial (média ± S.D., não mostrada).
OCM produzido a partir dessas culturas pode ser adicionado a 3 DIV para culturas de neurôniohipocampais purificados. Este tratamento promove o agrupamento de proteínas nodais, consistindo de canais Nav associados à Neurofascin 186 e Ankyrin G ao longo do axôlo de neurônios gabaergicos hipocampais antes da mielação, em 17 DIV (Figura 3A,B). Note-se que gravações eletrofisiológicas revelaram que esses aglomerados estão associados a uma maior condução dos potenciais de ação14. Além disso, a expressão da proteína de filamento intermediário fosforilizada H manchada por Smi31 é aumentada em neurônios hipocampais tratados com OCM(Figura 3A). Os fatores secretos oligodendrogliais estão, portanto, implicados na maturação neuronal e fisiologia.
A mielinização dos neurônios hipocampais pode ser estudada através da adição de OL a 14 DIV. De 20 DIV a 24 DIV, a imunocoloração de marcadores de mielina, como a proteína básica de mielina (MBP) permite a visualização dos segmentos de mielina (Figura 4).
Figura 1: Cronograma de protocolo de isolamento de células de linhaGem OL e produção de OCM. Depois de dissecar cortices cerebrais de ratos P2 Wistar (passo 4), realize a dissociação tecidual às células gliais culturais (passo 5). Com 8, 12 e 15 DIV (ou seja, dias antes de tremer), renovar meio médio com DMEM-10% DE FCS (passo 6). No dia seguinte, agitar as culturas gliais durante a noite a 250 rpm a 37 °C (passo 7.2). Supernatante de colheita contendo células de linhagem OL e poucas células de microglia e placa por 15 minutos em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% CO2 (passos 8,3 a 8,7). Centrífuga o supernatante por 5 min a 423 x g, resuspender a pelota celular com BS e incubar por 2 dias em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO2 (passos 8,8 a 8,12). Para produzir OCM, incubar por 2 dias em NB-B27low (passo 9). Para isolar OLs para experimentos de cocultura, desapego celular usando trippsina (passo 11.3). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Células de linhagem OL fenótipo em culturas. As imagens foram adquiridas usando um microscópio confocal. Projeções de intensidade máxima são apresentadas. (A) As culturas ol contêm principalmente pré-OLs (ou seja, expressando apenas NG2 (vermelho), ou tanto O4 (verde) quanto NG2 (vermelho); células expressando ambos os marcadores são indicadas com estrelas amarelas), mas também alguns OLs imaturos (ou seja, apenas expressando O4 e não NG2; estrelas brancas). (B) Poucos OLs maduros (ou seja, PLP+; verde) e poucos astrócitos (CÉLULAS GFAP+ celular; vermelho) são encontrados em culturas celulares de linhagem OL. Barras de escala = 25 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Aplicações representativas. (A,B) Neurônios hipocampais tratados com OCM a 3 DIV e fixados em 17 DIV expresso proteção de filamento intermediário H (Smi31; verde; painel A). Neurônios GABAergicos, identificados por isofíferos glutamatosdes de 67 kDa (GAD67) expressão (branco), display acúmulo de canais ankyrin G e Nav sódio (vermelho; painéis A e B, respectivamente) no segmento inicial de axônio e formam aglomerados Ankyrin G e Nav ao longo de seus axônios (painéis A e B, respectivamente). Barras de escala = 25 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 4: Aplicações representativas. Células de linhagem OL adicionadas à cultura do neurônio hipocampal em 14 DIV mielinam alguns axônios hipocampais, aqui fixados em 23 DIV (MBP como um marcador de mielina; verde). Nós de Ranvier (Nav; vermelho) são observados entre os segmentos de mielina. Barra de escala = 25 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
| Mídia Bottenstein-Sato (BS) | Concentração final |
| O Meio de Águia Modificada de Dulbecco | |
| Penicilina-Estreptomicina | 100 UI/mL |
| apo-Transferrin humano | 100 μg/mL |
| BSA (Álbum de Soro Bovino) | 100 μg/mL |
| Insulina | 5 μg/mL |
| Pdgf | 10 ng/mL |
| Progesterona | 62 ng/mL |
| Dicloridor de putrescina | 16 μg/mL |
| Selenita de sódio | 40 ng/mL |
| T3 (sal de sódio triiodo-l-thyronine) | 30 ng/mL |
| T4 (L-Thyroxine) | 40 ng/mL |
Tabela 1: Preparação da mídia Bottenstein-Sato (BS).
| NB-B27 baixa mídia | Concentração final |
| Neurobasal | |
| Suplemento B27 | 0,5x |
| L-glutamina | 0,5 mM |
| Penicilina-Estreptomicina | 100 UI/mL |
| NB-B27 media | Concentração final |
| Neurobasal | |
| Suplemento B27 | 1x |
| L-glutamina | 0,5 mM |
| Penicilina-Estreptomicina | 100 UI/mL |
Tabela 2: Preparação da mídia NB-B27low e NB-B27.
| Mídia de cocultura | Concentração final |
| O Meio de Águia Modificada de Dulbecco | 1 vol |
| Neurobasal | 1 vol |
| Suplemento B27 | 1x |
| Penicilina-Estreptomicina | 100 UI/mL |
| apo-Transferrin humano | 50 μg/mL |
| Biotina | 10 ng/mL |
| BSA (Álbum de Soro Bovino) | 50 μg/mL |
| Ceruloplasmina | 100 ng/mL |
| Hidrocortisona | 0,05 μM |
| Insulina | 5 μg/mL |
| N-Acetyl-L-cysteine | 5 μg/mL |
| Progesterona | 6.2 ng/mL |
| Putrescin | 16 μg/mL |
| CNTF Humano Recombinante | 0,1 ng/mL |
| Selenita de sódio | 5 ng/mL |
| T3 (sal de sódio triiodo-l-thyronine) | 40 ng/mL |
| Vitamina B12 | 27.2 ng/mL |
Tabela 3: Preparação da mídia de cocultura.
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Discussion
Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para obter culturas de linhagem oligodendroglial altamente enriquecidas a partir de culturas gliais mistas, adaptadas de um método16publicado anteriormente , e a produção subsequente de meio sedél condicionado. Esta técnica de agitação não é cara, pode ser repetida três vezes e é ideal para obter alta quantidade de OLs purificados, como células cultivadas em bottenstein-Sato (BS) meio contendo PDGFα proliferam. As células gliais são preparadas usando cortices cerebrais de ratos Wistar em P2, um ponto de tempo em que a grande maioria das células de linhagem oligodendroglial são pré-oligodendrocites expressando NG2 e O415. Note-se que o amadurecimento da linhagem OL é semelhante em P2 em rato e rato, e este protocolo também pode ser usado para isolar o mouse pré-oligodendrocitos17.
Depois de sacudir as culturas celulares gliais mistos, as células separadas consistem principalmente em células de linhagem oligodendroglial, mas também algumas células microgliais e poucos astrócitos. As células microgliais são removidas através da adesão diferencial em pratos petri não revestidos. Note-se que a eficiência de remoção pode ser melhorada realizando uma etapa adicional de adesão. No entanto, cerca de 5% das células microgliais ainda são encontradas em culturas celulares oligodendrógliais enriquecidas, bem como de 5% a 9% dos astrócitos. É possível diminuir a contaminação de astrócitos para menos de 5%, realizando uma etapa adicional de imuno-panning usando pratos de Petri revestidos de anticorpos O4; para um protocolo detalhado, consulte informações suplementares em Freeman et al.14. A remoção dos detritos 2h após o revestimento das células oligodendrógliais é um passo crítico, que conta com a força do fluxo aplicado com a tubulação. Nesta etapa, é importante examinar a cultura o microscópio antes e depois de limpar para verificar a eficiência, pois a presença de detritos demais pode prejudicar a viabilidade celular e o crescimento. Note-se, também é importante usar meio BS recém-feito, caso contrário poderia alterar a sobrevivência dos oligodendrocytes. Além disso, as células purificadas sobrevivem apenas até 6 dias após o revestimento. De fato, sabe-se que outras células gliais e neurônios promovem a sobrevivência e proliferação ou diferenciação do OPC através de fatores secretos ou contatos diretos2,18.
Outros métodos permitem o isolamento dos OLs imediatamente após a dissociação cerebral, usando imunorotulagem com anticorpo O4 seguido de classificação celular ativada por citometria de fluxo (FACS) ou triagem celular ativada por magnético (MACS). Além disso, opcs gfp-positivo ou oligodendrocytes GFP-positivo podem ser purificados por classificação celular ativada fluorescente a partir de camundongos PDGFαR:GFP ou PLP:GFP, respectivamente19,20. Esses métodos de classificação são mais relevantes para estudar o estado fisiológico dos oligodendrocos em comparação com culturas tratadas com fatores de crescimento que poderiam alterar seu fenótipo. Notavelmente, a classificação celular ativada por fluorescentes tem sido usada para abordagens de perfil genético no estado fisiológico normal e condições de desmielining21. Como a sobrevivência celular pode ser alterada pela classificação celular, é melhor realizar ensaios funcionais imediatamente após a triagem.
Mostramos que as culturas de OL podem ser separadas e adicionadas às culturas de neurônios hipocampais purificados a 14 DIV. Essa co-cultura de neurônios OL permite o estudo dos primeiros passos da mielinação que começa durante a primeira semana de co-cultura (Dubessy, resultados inéditos). Outros modelos de co-cultura de mielinagem de neurônio oL-hipocampal foram alcançados adicionando oligodendrocytes imediatamente após a classificação22,23. Além disso, produzimos OCM para dissecar ainda mais as interações oL-neurônio e abordar o papel dos fatores secretos do OL nas culturas de neurônios. Usando essa técnica, demonstramos que subtipos de neurônios gabaergicos hipocampais (ou seja, parvalbumina+ e/ou somatostatin+) podem formar agrupamentos de proteínas nodais ao longo de seu axôlo que são induzidos pelo OCM antes da mielinação14,24. A análise de espectrometria em massa do OCM desvenda várias proteínas secretas e levou a identificar oligodendroglial Contactin-1 que, na sinergia com proteínas matricas extracelulares, media os primeiros passos do agrupamento nodal24. Culturas primárias são modelos úteis que permitem a avaliação da diferenciação de células de linhagem oligodendroglial e interações com neurônios. No entanto, outras abordagens também foram desenvolvidas para avaliar funções de OL e myelination, desmielinização e remyelinação de culturas organotípicas cerebellar ex vivo25,26, e em estudos vivos, notadamente com zebrafish e girinos modelos27 que são necessários nos passos finais dos estudos pré-clínicos.
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Disclosures
Nenhum dos autores tem interesses concorrentes ou interesses conflitantes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Rémi Ronzano por seu sábio conselho na edição de manuscritos. Este trabalho foi financiado pelo ICM, INSERM, bolsa de fundação ARSEP à NSF e preço bouvet-labruyère.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
References
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