Summary
В этом виде мы демонстрируем эффективный метод очистки олигодендроцитов и производства олигодендроцитов, которые могут быть использованы для совместно-культурных экспериментов.
Abstract
В центральной нервной системе олигодендроциты хорошо известны своей ролью в аксонной миелинации, что ускоряет распространение потенциалов действия через солейную проводимость. Кроме того, все большее число сообщений свидетельствуют о том, что олигодендроциты взаимодействуют с нейронами за пределами миелинации, в частности, за счет секреции растворимых факторов. Здесь мы представляем подробный протокол, позволяющий очищать олигодендроглиальные линии клеток от глиальных клеточных культур, также содержащих астроциты и микроглиальные клетки. Метод опирается на ночь встряхивания при 37 градусов по Цельсию, что позволяет селективного отряда надлежащих олигодендроглиальных клеток и микроглиальных клеток, а также ликвидации микроглии дифференциальной сливки. Затем мы описываем культуру олигодендроцитов и производство олигодендроцитов кондиционированной среды (OCM). Мы также предоставляем кинетику лечения OCM или олигодендроцитов дополнение к очищенным гиппокампа нейронов в совместной культуры экспериментов, изучение олигодендроцитов нейронов взаимодействий.
Introduction
Олигодендроциты (Ол) являются глиальными клетками центральной нервной системы (ЦНС), которые генерируют миелин, обертывающий вокруг аксонов. Ол сходят на из олигодендроцитов клеток-предшественников (ОПК), которые размножаются в желудочковых зонах эмбриональной ЦНС, а затем мигрируют и дифференцируются в полностью зрелые Ол (т.е. миелин-образующие клетки)1. OPCs в изобилии во время раннего развития, но и сохраняются во взрослом мозге, где они представляют собой основные пролиферативной популяции клеток2. Один OL ensheathes несколько аксонов в невозбудимых разделов (т.е. межузлов), и край каждого цикла миелина прикрепляется к аксон формирования паранодального домена, который имеет решающее значение для изоляционных свойств миелина1,3. Между паранодами находятся небольшие немиелинированные зазоры, называемые узлами Ранвье. Эти узлы богаты натриевыми каналами напряжения (Nav), что позволяет регенерацию и быстрое распространение потенциалов действия черезсолей4. Это плотное взаимодействие также позволяет аксональной энергетической поддержки через поглощение нейронов лактата от OLs5,6.
Созревание олигодендроглиальных линий клеток и процесс миелинизации жестко регулируются их взаимодействиями с нейронами7. Действительно, OLs и OPCs, также названные ng2 клетки, выражают блок приемнок для нейротрансмиттеров, и могут получать вход от возбуждающих и ингибирующих нейронов, позволяющ им чувствовать деятельность нейронов которая может вызвать их пролиферацию and/or дифференциацию в миелинационные клетки2. В свою очередь, OPCs/OLs выделяют микровезики и белки во внеклеточное пространство, которое в одиночку или синергетически посреднические нейромодуляционные и нейропротекторные функции8,9,10,11,12. Тем не менее, молекулярные механизмы, контролирующие несколько режимов взаимодействия между олигодендроглиальными линейными клетками и нейронами, еще предстоит полностью расшифровать.
Кроме того, в нескольких патологических условиях ЦНС, OLs в первую очередь страдают, тем самым нарушая их взаимодействие с нейронами. Например, при рассеянном склерозе (МС) неврологическая дисфункция вызвана очаговой демиелинизнацией в ЦНС, вторичной потерей Олс, которая может привести к повреждению аксонального аксоналят и связанному с ним накоплению инвалидности. Ремелинизацию может иметь место, хотя и недостаточно в большинстве случаев13. Прогресс, достигнутый в последнее десятилетие в связи с развитием иммунотерапии, снизил скорость рецидивов, однако содействие ремиелинизации остается на сегодняшний день неудовлетворенной необходимостью. Таким образом, более глубокое понимание роли, функций и влияний ОЛ представляет особый интерес для разработки новых методов лечения широкого спектра условий ЦНС.
Здесь мы описываем методы очищения Ол и культуры. Это позволяет точно изучить внутренние механизмы, регулирующие их развитие и биологию. Кроме того, такие высокообогащенные культуры ОЛ позволяют производство олигодендроцитов-кондиционированной среды (OCM), которые могут быть добавлены к очищенной нейронных культур, чтобы получить представление о влиянии OLs-секретных факторов на нейрональной физиологии и связи. Кроме того, мы описываем, как внедрить систему совместной культуры in vitro, где очищенные олигодендроциты и нейроны объединяются вместе, что позволяет решать механизмы, регулирующие (ре) миелинизацию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Уход и использование крыс в этом эксперименте соответствует институциональной политике и руководящим принципам (UPMC, INSERM и Директива Совета Европейского сообщества 86/609/EEC). Для стандартного помета из 12 щенков установлен следующий протокол.
1. Подготовка колб (5 мин)
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги за день до вскрытия в ламинарном капоте потока в стерильных условиях.
- Пальто 150 см2 колбы (T150) с крышкой фильтра (1 колба для 2 щенков) с использованием 5 мл полиэтиленина (PEI, 100 мг/ л, см. протокол в дополнительном файле 1).
- Храните фляги при 4 градусах Цельсия на ночь.
- Промыть покрытую колбами 3 раза стерильной дистиллированной водой в день вскрытия.
2. Подготовка средств массовой информации (10 мин)
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги в ламинарном капоте потока в стерильных условиях.
- Подготовка 500 мл культуры среды, состоящей из Dulbecco в модифицированных Eagle среды (DMEM) дополнен 10% сыворотки плода теленка (FCS) и пенициллин-стрептомицин (100 МЕ / мл).
- Приготовьте 20,6 мл ферментной среды пищеварения в трубке 50 мл, состоящей из 20 мл ДМЭМ, 200 л DNase (50 мкг/мл), 200 л папаина (30 U/mL) и 200 л L-цистеина (0,24 мг/мл).
- Фильтр-стерилизовать средства массовой информации с помощью фильтра 0,22 мкм.
- Держите средства массовой информации в ламинарном капоте потока при комнатной температуре (RT) до вскрытия.
3. Подготовка к вскрытию (10 мин)
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги в ламинарном капоте потока в стерильных условиях.
- Приготовьте 100 мл фосфатно-буферного солья без кальция и магния (PBS; 1x). Фильтр-стерилизовать с помощью фильтра 0,22 мкм.
- Приготовьте 50 мл ледяного раствора 1x PBS, дополненного 750 л из 45% глюкозы. Фильтр-стерилизовать с помощью фильтра 0,22 мкм.
- Заполните 100 мм петри блюдо с 1x PBS для очистки инструментов и три 60 мм Петри блюда с ледяной PBS-глюкозы для сбора тканей. Положите петри блюда на лед до вскрытия.
4. Рассечение
ПРИМЕЧАНИЕ: Рассечение выполняется от мужчин и женщин Wistar крысы щенки в послеродовой день (P) 2.
- Для того, чтобы обеспечить стерильную среду, убедитесь, что для очистки скамейке с 100% этанола. Стерилизовать все хирургические инструменты с 100% этанола.
- Аккуратно распылите шею щенка 70% этанола.
- Используйте большие хирургические ножницы, чтобы обезглавить животное и поместить голову в 100 мм Петри блюдо, содержащее ледяной PBS-глюкозы.
- Используйте изогнутые щипцовать для поддержания головы животного на уровне глаз. Используйте небольшие хирургические ножницы, чтобы сделать небольшой разрез в основании черепа и вырезать череп после средней линии мозга.
- Используйте щипчьи, чтобы аккуратно снять две части черепа с средней линии.
- Используйте небольшую хирургическую ложку, чтобы удалить мозг из полости головы. Положите мозг в 60 мм Петри блюдо, содержащее ледяной PBS-глюкозы на льду.
- Просмотр под стеромикроскоп, использовать тонкие щипцы, чтобы удалить мозжечок, ствол мозга и обонятельные луковицы из полушарий головного мозга.
- Используйте тонкие щипцы, чтобы отделить два полушария головного мозга. Используйте мелкие щипцы, чтобы снять обезвреживания. Положите кортики головного мозга в 60 мм-петри блюдо на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ледяной PBS имеет решающее значение для правильного удаления оленей.
5. Диссоциация тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги в ламинарном капоте потока в стерильных условиях.
- Используйте острый скальпель, чтобы мелко нарезать кортики головного мозга. Перенесите измельченные ткани в трубку 50 мл, содержащую среду пищеварения ферментов.
- Инкубировать в течение 30 минут в увлажненный инкубатор при 37 градусах Цельсия под 5% CO2.
- Используйте микропайпет p1000, чтобы аккуратно удалить среду пищеварения фермента, убедившись, что корковая ткань остается на дне трубки 50 мл.
- Используйте p1000 micropipette, чтобы добавить 1 мл DMEM-10% FCS и аккуратно triturate ткани.
- Используйте фильтр площадью 70 мкм и поршень шприца 1 мл для фильтрации корковой ткани в трубку 50 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно промыть остаточной ткани на внутренней стенке трубки несколько раз с DMEM-10% FCS. - Заполните трубку 50 мл dMEM-10%FCS. Центрифуга при 423 х г в течение 5 мин на RT. Тщательно удалите супернатант и отдохните клеточные гранулы с 2 мл DMEM-10%FCS.
- Аккуратно тритурировать клеточные гранулы с p1000 микропайпет, а затем с p200 micropipette. Разбавить клеточную подвеску соответствующим объемом DMEM-10%FCS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Два мозга - один T150 и 5 мл DMEM-10%FCS. - Плита 5 мл клеточной подвески на T150 при плотности 1 х 105 клеток/см2. Добавьте 20 мл теплого DMEM-10%FCS к каждому T150. Инкубировать в увлажненный инкубатор при 37 градусах Цельсия под 5% CO2.
- Обновите половину культуры среды после 6 дней in vitro (DIV) с теплым DMEM-10%FCS.
6. Встряхивание подготовки
- Выполните встряхивания подготовки на день, прежде чем трястись в ламинарный поток капот в стерильных условиях.
- Обновите половину культуры среды, добавив свежие теплой среде культуры в колбу и инкубировать на 37 градусов по Цельсию под 5% CO2.
7. Встряхивание
- Пальто три 100 мм Петри блюда с PEI. Храните их при 4 градусах Цельсия на ночь.
- Обложка колбы крышка с парафина пленки и положить колбы в полиэтиленовый пакет. Встряхните колбы, содержащие глиальные клетки на ночь при 250 об/мин при 37 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Первая встряхивания выполняется на 8 DIV и можно выполнить до трех различных встряхивания (см. Рисунок 1 для времени).
8. OL линии клеток уборки и культуры
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги должны выполняться в ламинарном капоте потока в стерильных условиях.
- На следующий день после встряхивания, подготовить Bottenstein-Sato (BS) среды в соответствии с таблицей 1.
- Промыть покрытием Петри блюда 3 раза с стерильной дистиллированной водой.
- Супернатант фляг, содержащий в основном OL-линии клеток, а также некоторые микроглиальные клетки и пластины его на не-покрытием 100 мм Петри блюд.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг позволяет удаление микроглиальных клеток через дифференциальный быстрый слив на поверхности блюда. - Инкубировать блюда Петри в течение 15 минут в увлажненный инкубатор при 37 градусах Цельсия под 5% CO2.
- Заполните каждую колбу T150 25 мл теплой свежеприготовленной культуры среды и инкубировать в увлажненный инкубатор на 37 градусов по Цельсию под 5% CO2 до второй тряски.
- Перенесите супернатант из посуды Петри в новые непокрытые 100 мм блюда Петри, чтобы позволить сацепность остаточных микроглиальных клеток.
- Инкубировать блюда Петри в течение 15 минут в увлажненный инкубатор при 37 градусах Цельсия под 5% CO2.
- Удалите супернатант, который содержит неадекторные OL линейные клетки, и перенесите его в 50 мл труб (супернатант из 2 посуды Петри для трубки 50 мл). Отбросьте посуду Петри, покрытую микроглией.
- Центрифуга супернатант в течение 5 мин на 423 х г. Тщательно удалите супернатант и resuspend клеточные гранулы с 1 мл среды BS. Объедините все гранулы в общую трубку 50 мл и отрегулируйте громкость до 10 мл со средним BS.
- Определить плотность клеток под микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность ячейки между 3 х 105/мл и 5 х 105/мл должны быть получены. - Добавьте 20 мл BS, если плотность клеток выше или равна 4 х 10 5/мл, чтобы получить окончательный объем 30 мл, или добавьте только 10 мл BS, если плотность ячейки меньше 4 х 105/мл, чтобы получить окончательный объем 20 мл.
- Плита два или три предварительно покрытые 100 мм Петри блюда с 10 мл клеточной подвески. Инкубировать в увлажненный инкубатор при 37 градусах Цельсия под 5% CO2.
- Очистите мусор от блюд Петри, освежая все BS среде 2 ч позже.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изучите культуру под микроскопом до и после очистки, чтобы проверить плотность клеток и эффективность удаления мусора. - Инкубировать в течение 2 дней в бС среде в увлажненный инкубатор при 37 градусах Цельсия под 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изучите культуру под микроскопом. Слияние должно составить от 70% до 80%.
9. Производство OCM
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните эти шаги в ламинарном капоте потока в стерильных условиях.
- Подготовка NB-B27low среды в соответствии с таблицей 2.
- Обновите культурную среду с 10 мл теплой среды NB-B27low. Инкубировать в течение 2 дней в увлажненный инкубатор при 37 градусах Цельсия под 5% CO2.
- Урожай OCM, т.е. супернатант, содержащий ПР секретированные факторы. Фильтр-стерилизовать OCM с помощью фильтра 0,22 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните OCM при 4 градусах по Цельсию в течение максимум 2 месяцев.
10. Добавление OCM
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги должны выполняться в ламинарном капоте потока в стерильных условиях. OCM могут быть добавлены к очищенным гиппокампа нейронных культур, подготовленных в соответствии со следующим протоколом14, и получить путем добавления, 24 ч после изоляции, анти-митотические агенты уридин и 5- фтородородеоксюридин (5 мкм) для 36 ч.
- На 3 DIV, удалить все нейронкультуры среды, содержащей анти-митотических агентов и добавить 500 зл.
- Обновляйте половину среды каждые 3 дня со свежеприготовленным теплым NB-B27.
ПРИМЕЧАНИЕ: Такие культуры могут быть сохранены до 21 DIV.
11. Добавление ПР к очищенной культуре гиппокампа нейронов
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги в ламинарном капоте потока в стерильных условиях. Ол можно добавлять в очищенные гиппокампа культур, полученных таким же образом, как описано выше.
- Подготовка среды совместной культуры в соответствии с таблицей 3.
- Извлекайте культуру OL на 70% до 80% слияние. Промыть 2 мл теплого 1x PBS.
- Чтобы отделить клетки, добавьте 2 мл 0,25% трипсина в 100 мм чашку Петри.
- Инкубировать в течение 5 мин в увлажненный инкубатор при 37 градусах По 5% CO2.
- Добавьте 2 мл DMEM-10% FCS, чтобы заблокировать ферментативную реакцию. Урожай супернатант, содержащий OL линейных клеток.
- Центрифуга при 423 х г в течение 5 мин на RT. Тщательно удалить супернатант и resuspend клеточной гранулы в теплой среде совместной культуры, чтобы получить концентрацию 1,25 х 105 клеток/ мл.
- Добавить ПР в очищенных гиппокампа нейронов культуры, удалив 200 зл. нейронов культуры среды и добавив 200 злиц клеточной подвески на хорошо (2,5 х 104 клетки / хорошо) из 24-хорошо пластины.
- Освежать половину среды совместной культуры каждые 2-3 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сокультуры могут быть сохранены до 24 DIV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом протоколе, OL линии клеток очищаются от глиальных культур, стряхивая астроцитов и микроглии. Чистоту и фенотипическое исследование OL-культур можно оценить с помощью иммунодефицита с глиальными маркерами15. Анализ экспрессии различных маркеров показал, что OL-культуры были в основном предварительно OLs с 90% и 4% от O4- клетки, 85% и 7%NG2 - клетки, и 4,7% - 2,1% от PLP- клетки, в то время как 7,2% - 2,5% клеток были Астроцитами ГФАП(средний - S.D., n 3; Рисунок 2). Кроме того, 4,6% и 0,7% клеток были CD11bи микроглиальных клеток (средний S.D., не показано).
OCM, произведенный из таких культур, может быть добавлен в 3 DIV для очищенных культур гиппокампа нейронов. Это лечение способствует кластеризации узловых белков, состоящий из NaV каналов, связанных с Neurofascin 186 и Ankyrin G вдоль аксона гиппокампа ГАМК нейронов до миелинизации, на 17 DIV (Рисунок 3A, B). Следует отметить, что электрофизиологические записи показали, что эти кластеры связаны с повышенной проводимой потенциалов действия14. Кроме того, экспрессия фосфорилированного промежуточного белка нити H, окрашенного Smi31, увеличивается в обработанных OCM гиппокампальных нейронах(рисунок 3A). Олигодендроглиальные выделяемые факторы, таким образом, вовлечены в созревание нейронов и физиологию.
Миелинизацию гиппокампа нейронов могут быть изучены путем добавления ПР на 14 DIV. От 20 DIV до 24 DIV, иммуностоирование маркеров миелина, таких как основной белок миелина (MBP) позволяет визуализировать сегменты миелина(рисунок 4).
Рисунок 1: Протокол сроки OL линии изоляции и OCM производства. После вскрытия кортиков головного мозга от крыс P2 Wistar (шаг 4) выполнить диссоциацию тканей с культурой глиальных клеток (шаг 5). В 8, 12 и 15 DIV (т.е. за несколько дней до встряхивания), обновите половину среды с теплым DMEM-10% FCS (шаг 6). На следующий день, встряхнуть глиальных культур на ночь при 250 об/мин при 37 градусах По Цельсия (шаг 7.2). Урожай супернатант, содержащий OL линии клеток и несколько клеток микроглии и пластины его в течение 15 минут в увлажненный инкубатор на 37 градусов по Цельсию под 5% CO2 (шаги 8,3 до 8,7). Centrifuge супернатант в течение 5 мин на 423 х г, resuspend клеточные гранулы с BS и инкубировать в течение 2 дней в увлажненный инкубатор на 37 градусов по Цельсию под 5% CO2 (шаги 8,8 до 8,12). Для производства OCM, инкубировать в течение 2 дней в NB-B27low (шаг 9). Чтобы изолировать Ол для совместно-культурных экспериментов, отсоедините клетку с помощью трипсина (шаг 11.3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: ФЕнотип клеток OL линии в культурах. Изображения были получены с помощью конфокального микроскопа. Представлены проекции максимальной интенсивности. (A) OL культуры содержат главным образом pre-OLs (т.е., выражая только NG2 (красный), или оба O4 (зеленый) и NG2 (красный); клетки выражая оба маркера показаны с желтыми звездами), но также некоторые незрелые OLs (т.е., только выражая O4 и не NG2; белые звезды). (B) Немногие зрелые OLs (т.е., PLP;зеленый цвет) и немногие астроциты (GFAPи клетки; красный цвет) найдены в культурах клетки линии OL. Шкала баров 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Представитель приложений. (A, B) Гиппокампальные нейроны, обработанные OCM при 3 DIV и фиксированные на 17 DIV экспресс-фосфорилированный промежуточный белок нити H (Smi31; зеленый; панель A). ГАМК-нейроны, выявленные глутамат декарбоксилаза изоформа 67 kDa (GAD67) выражение (белый), отображение Ankyrin G и NaV натрия каналов (красный; панели A и B, соответственно) на аксон начального сегмента и форме Ankyrin G и NaV кластеров вдоль их аксон (панели A и B, соответственно). Шкала баров 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Представитель ные слова. OL линии клеток, добавленных к гиппокампа нейронов культуры на 14 DIV миелинат некоторые гиппокампа аксоны, здесь фиксированной на 23 DIV (MBP в качестве маркера миелина; зеленый). Узлы Ранвье (Nav; red) наблюдаются между сегментами миелина. Шкала бар 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Боттенштейн-Сато (BS) СМИ | Окончательная концентрация |
| Dulbecco в модифицированных Eagle Medium | |
| Пенициллин-стрептомицин | 100 МЕ/мл |
| апо-Трансферин человека | 100 мкг/мл |
| BSA (Бовинский сывороточный альбомин) | 100 мкг/мл |
| Инсулина | 5 мкг/мл |
| PDGF | 10 нг/мл |
| Прогестерона | 62 нг/мл |
| Путречин дигидрохлорид | 16 мкг/мл |
| Селенит натрия | 40 нг/мл |
| Т3 (3,3',5-Трийодо-L-тиронина соли натрия) | 30 нг/мл |
| T4 (L-тироксин) | 40 нг/мл |
Таблица 1: Подготовка средств массовой информации Боттенштейна-Сато (BS).
| NB-B27 низкие носители | Окончательная концентрация |
| Нейробазал | |
| Дополнение B27 | 0,5x |
| L-глутамин | 0,5 мм |
| Пенициллин-стрептомицин | 100 МЕ/мл |
| NB-B27 СМИ | Окончательная концентрация |
| Нейробазал | |
| Дополнение B27 | 1x |
| L-глутамин | 0,5 мм |
| Пенициллин-стрептомицин | 100 МЕ/мл |
Таблица 2: Подготовка носителей NB-B27low и NB-B27.
| Средства массовой информации, связанные с сокультурой | Окончательная концентрация |
| Dulbecco в модифицированных Eagle Medium | 1 vol |
| Нейробазал | 1 vol |
| Дополнение B27 | 1x |
| Пенициллин-стрептомицин | 100 МЕ/мл |
| апо-Трансферин человека | 50 мкг/мл |
| Биотин | 10 нг/мл |
| BSA (Бовинский сывороточный альбомин) | 50 мкг/мл |
| Серулопласмин | 100 нг/мл |
| Гидрокортизон | 0,05 мкм |
| Инсулина | 5 мкг/мл |
| N-ацетил-L-цистеин | 5 мкг/мл |
| Прогестерона | 6,2 нг/мл |
| Путрешин | 16 мкг/мл |
| Рекомбинантный человек CNTF | 0,1 нг/мл |
| Селенит натрия | 5 нг/мл |
| Т3 (3,3',5-Трийодо-L-тиронина соли натрия) | 40 нг/мл |
| Витамин B12 | 27,2 нг/мл |
Таблица 3: Подготовка средств массовой информации совместной культуры.
Дополнительный файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы предоставляем подробный протокол для получения высокообогащенных олигодендроглиальных клеточных культур из смешанных глиальных культур, адаптированных из ранее опубликованного метода16, и последующего производства OL-кондиционированной среды. Этот метод встряхивания не является дорогостоящим, может быть повторен три раза и является оптимальным для получения большого количества очищенных Ол, как клетки культивируются в Боттенштейн-Сато (BS) среда, содержащая PDGF' размножаться. Глиальные клетки готовятся с использованием кортики головного мозга Крыс Ыстар на P2, момент времени, в котором подавляющее большинство олигодендроглиальных линейных клеток до олигодендроцитов, выражающих NG2 и O415. Следует отметить, OL линии созревания похож на P2 в мыши и крысы, и этот протокол также может быть использован для изоляции мыши до олигодендроцитов17.
После встряхивания смешанных глиальных клеточных культур, отдельные клетки состоят в основном из олигодендроглиальных линейных клеток, но и некоторые микроглиальные клетки и несколько астроцитов. Микроглиальные клетки удаляются с помощью дифференциальной сливки на непокрытых чашках Петри. Следует отметить, что эффективность удаления может быть улучшена путем выполнения дополнительного шага стыковки. Тем не менее, около 5% микроглиальных клеток по-прежнему находятся в обогащенных олигодендроглиальных клеточных культурах, а также от 5% до 9% астроцитов. Можно уменьшить загрязнение от астроцитов до менее чем 5%, выполняя дополнительный иммунопанирование шаг с использованием O4 антитела покрытием Петри блюда; для подробного протокола см. дополнительную информацию в Freeman et al.14. Удаление мусора 2 ч после покрытия олигодендроглиальных клеток является критическим шагом, который опирается на силу потока применяется с трубач. На этом этапе важно изучить культуру под микроскопом до и после очистки, чтобы проверить эффективность, поскольку наличие слишком большого количества мусора может ухудшить жизнеспособность и рост клеток. Следует отметить, что также важно использовать свежеприготовленные BS среды, в противном случае это может изменить выживание олигодендроцитов. Кроме того, очищенные клетки выживают только до 6 дней после покрытия. Действительно, известно, что другие глиальные клетки и нейроны способствуют выживанию и пролиферации ОЗК или дифференциации через секретные факторы или прямые контакты2,18.
Другие методы позволяют oLs изоляции сразу после диссоциации мозга, используя иммуномаркировку с антителами O4 после довастыми флуоресцентно-активированными сортировкой клетки цитометрией потока (FACS) или магнитно-активированной сортировкой клетки (MACS). Кроме того, GFP-положительные OPCs или GFP-положительные олигодендроциты могут быть очищены путем флуоресцентно-активированной сортировки клеток от PDGF'R: GFP или PLP:GFP мышей, соответственно19,20. Эти методы сортировки более актуальны для изучения физиологического состояния олигодендроцитов по сравнению с культурами, обработанными факторами роста, которые могут изменить их фенотип. Примечательно, что флуоресцентно-активированная сортировка клеток была использована для генно-профилирующих подходов в нормальном физиологическом состоянии и демиелинизирующих условиях21. Поскольку выживание клеток может быть изменено путем сортировки клеток, лучше выполнять функциональные анализы сразу после сортировки.
Мы показали, что OL культуры могут быть отделены и добавлены к очищенной гиппокампа нейронных культур на 14 DIV. Такая ol-нейронная ко-культура позволяет изучать ранние шаги миелинизации, которая начинается в течение первой недели совместной культуры (Dubessy, неопубликованные результаты). Другие модели OL-гиппокампа нейрона миелинирования со-культуры были достигнуты путем добавления олигодендроцитов сразу после сортировки22,23. Кроме того, мы подготовили OCM для дальнейшего вскрытия ol-нейронных взаимодействий и решения роли OL-секретных факторов на нейронных культур. Используя эту технику, мы продемонстрировали, что гиппокампа ГАМК-подтипов нейронов (т.е., парвальбумин и / или соматостатин) может образовывать кластеры узловых белков вдоль их аксон, которые индуцируются OCM до миелинизации14,24. Масс-спектрометрия анализ OCM распутал несколько секретов и привело к выявлению олигодендроглиального контакта-1, который в синергии с внеклеточными матричными белками опосредует ранние шаги узловой кластеризации24. Первичные культуры являются полезными моделями, которые позволяют оценку дифференциации клеток олигодендроглиальной линии и взаимодействия с нейронами. Тем не менее, другие подходы были также разработаны для оценки функций OL и миелинации, демиелинизм и ремиелинизм от ex vivo мозжечковой оргенотипической культуры ломтик25,26, и in vivo исследований, в частности, с зебрафиш и головастик модели27, которые необходимы в заключительных шагах доклинических исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни один из авторов не имеет конкурирующих интересов или противоречащих друг другу интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Реми Ронзано за мудрый совет по редактированию рукописей. Эта работа финансировалась ICM, INSERM, грантом фонда ARSEP NSF и ценой Буве-Лабруйер.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
References
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).
- Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication. Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
- Freeman, S. A., Desmazières, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Birey, F., et al. Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2. Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).
- Frühbeis, C., et al. Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication. PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).
- Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem. eLife. 8, (2019).
- Sakry, D., et al. Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2. PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).
- Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors. PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).
- Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology. Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).
- Freeman, S. A., et al. Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).
- Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
- Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development. Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).
- Moyon, S., et al. Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration. Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Thetiot, M., et al. An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system. bioRxiv. , 763573 (2019).
- Dubessy, A. L., et al. Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS. Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).
- Barateiro, A., Fernandes, A. Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination. Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).
- Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
- Mannioui, A., Zalc, B. Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).
