Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד לחתוך את רקמת הלב והתרבות בתנאים פיסיולוגיים במשך 6 ימים. מערכת זו של התרבות יכול לשמש פלטפורמה לבדיקת היעילות של אי ספיקת לב הרומן therapeutics, כמו גם בדיקות אמינות של הקרדיוקרדיטיות חריפה במודל לב תלת-ממדי.
Abstract
תרופות הרומן הרבות להיכשל במחקרים קליניים בשל תופעות לוואי cardiotoxic כמו כיום זמין מחוץ לתחום במודלים בעלי חיים vivo לחזות התחייבויות לב האדם, פוזות נטל רב מיליארד דולר על תעשיית התרופות. לפיכך, יש צורך רפואי ברחבי העולם לגישות טובות יותר כדי לזהות קרדיולוקסיניטי סמים לפני התחייבות יקר זמן רב ' הראשון במבחנים של האדם. כיום, רק תאים לב בלתי מפותחים (האדם המושרה ביותר בתאי גזע הנגרמת על ידי מערכת החייאה) משמשים כדי לבדוק יעילות טיפולית רעילות הסמים כפי שהם היחידים בתאי הלב האנושיים שיכולים להיות מתורבתים לתקופות ממושכות נדרש כדי לבדוק את יעילות הסמים ואת הרעילות. עם זאת, סוג תא בודד אינו יכול לשכפל את הפנוטיפ של רקמת הלב 3D מורכבת אשר נוצרת של סוגי תאים מרובים. וחשוב מכך, השפעת הסמים צריכה להיבדק על הקרדיוציטים מבוגרים, שיש להם מאפיינים שונים ותגובות רעילות בהשוואה ל-היפנוסק-CMs בלתי-מפותח. הפרוסות של לב האדם מהווה מודל מבטיח של שריר הלב האנושי ללא פגע. טכנולוגיה זו מספקת גישה למערכת מסחר מלאה המחקה את רקמת הלב האנושית ומשקפת את התנאים הפיזיולוגיים או הפתולוגיים של שריר הלב האנושי. לאחרונה, באמצעות אופטימיזציה של רכיבי מדיה התרבות ותנאי התרבות לכלול גירוי חשמלי רציף ב 1.2 Hz ו חמצן לסירוגין של מדיום התרבות, פיתחנו התקנה חדשה של מערכת התרבות אשר שומרת על יכולת הקיום והפונקציונליות של פרוסות לב של אדם וחזיר למשך 6 ימים בתרבות. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מפרט את השיטה לחיתוך לב חזיר מקולף כדוגמה. אותו פרוטוקול משמש גם לפרוסות תרבות מלבבות אנושיים, כלבים, כבשים או חתולים. זו מערכת התרבות יש את הפוטנציאל להיות האדם ניבוי חזק במודל באתרו עבור בדיקות קרדיולקסיטיות חריפה הסוגרת את הפער בין תוצאות בדיקה קלינית קליני.
Introduction
שיטת התרופות הנגרמת היא גורם מרכזי לגמילה משוק1. בעשור האחרון של המאהה -20, שמונה תרופות ללא לב וכלי דם הונסוגו מן השוק כתוצאה מכך מוות פתאומי בשל הפרעות קצב הלב2. בנוסף, מספר טיפולים נגד סרטן (בעוד במקרים רבים יעיל) יכול להוביל לכמה אפקטים cardiotoxic כולל שריר הלב הפרעות קצב. לדוגמה, הן מסורתיות (למשל, פחם וקרינה) ו ממוקד (g., trastuzumab) טיפולים סרטן השד יכול לגרום לסיבוכים לב וכלי דם בקבוצת משנה של חולים3. שיתוף פעולה קרוב בין קרדיולוגים ו אונקולוגים (באמצעות השדה המתעוררים של "סיבולת לב ריאה") עזר להפוך את הסיבוכים האלה לניהול להבטיח כי חולים יכולים להיות מטופלים ביעילות2. פחות ברור הם השפעות לב וכלי דם של סוכנים חדשים, כולל Her2 ו PI3K מעכבי, במיוחד כאשר הטיפולים משמשים בשילוב. לכן, יש צורך הולך וגדל אסטרטגיות ההקרנה הקדם קלינית עבור רעלים קרדיווסטיים הקשורים המתעוררים נגד סרטן טיפולים לפני ניסויים קליניים אנושיים. חוסר הזמינות של מערכות התרבות לרקמת הלב האנושית כי הוא פונקציונלי מבחינה מבנית עבור יותר מ -24 h הוא גורם מגביל עבור בדיקות הקרדיולוקסיטי אמין. לכן, יש צורך דחוף לפתח מערכת אמינה עבור רקמת לב האדם culturing בתנאים פיזיולוגיים לבדיקת רעילות לסמים.
המהלך האחרון לקראת השימוש של האדם המושרה הנגרמת לתאי גזע-הקרדיוציטים (היפנוטית-CMs) בבדיקות קרדיולוקסיטי סיפקה פתרון חלקי לטיפול בבעיה זו; עם זאת, הטבע בוגר של היפנוsc-CMs ואובדן שלמות רקמות בהשוואה לטבע רב-תאי של רקמת הלב הם מגבלות גדולות של טכנולוגיה זו4. מחקר שנערך לאחרונה התגבר באופן חלקי על מגבלה זו באמצעות הייצור של רקמות לב מ-היפרsc-CMs על הידרוג ' לים והוא החזיק אותם לעלייה הדרגתית גירוי חשמלי לאורך זמן5. עם זאת, התכונות האלקטרו-מכאני שלהם לא השיגו את הבגרות הנתפסת בשריר הלב האנושי המבוגר. יתר על כן, רקמת הלב הוא מורכב יותר מבחינה מבנית, להיות מורכב מסוגי תאים שונים כולל תאים אנדותל, נוירונים וסוגים שונים של מסטרומה פיברותקיעות מקושרים יחד עם תערובת ספציפית מאוד של חלבונים מטריתאיים מטריצות6. הטרוגניות הזאת של אוכלוסיית התאים הבלתי-קרדיוציט7,8,9 בליבו של היונקים הגדולים הוא מכשול משמעותי ברקמת לב מידול באמצעות סוגי תאים נפרדים. מגבלות גדולות אלה מדגישות את החשיבות של פיתוח שיטות להפיכת התרבות של רקמת לב שלמה למחקרים אופטימליים הכרוכים בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים של הלב5.
מודל מבטיח של שריר הלב. האנושי ללא פגע טכנולוגיה זו מספקת גישה למערכת מלאה 3D הרב-תאיים הדומה לרקמת הלב האנושי אשר יכול באופן מהימן לשקף את התנאים הפיזיולוגיים או הפתולוגיים של שריר הלב האנושי. עם זאת, השימוש שלו כבר מוגבל באופן חמור על ידי התקופה הקצרה של הכדאיות בתרבות, אשר לא להאריך מעבר 24 h באמצעות הפרוטוקולים החזקים ביותר שדווחו עד 201810,11,12. מגבלה זו הייתה בשל גורמים מרובים, לרבות השימוש בממשק נוזלי האוויר לתרבות הפרוסות, והשימוש במדיום תרבותי פשוט שאינו תומך בדרישות האנרגטיות הגבוהות של רקמת הלב. פיתחנו לאחרונה מערכת תרבות מתחת לגוף, אשר מסוגלת לספק גירוי חשמלי רציף ואופטימיזציה של רכיבי מדיה התרבות כדי לשמור פרוסות רקמות לב קיימא עד 6 ימים13. זו מערכת התרבות יש את הפוטנציאל להיות האדם ניבוי חזק במודל באתרו עבור בדיקות קרדיולקסיטיות חריפה כדי לסגור את הפער בין תוצאות בדיקה קלינית קליני. במאמר הנוכחי, אנו מפרט את הפרוטוקול לחיתוך ולתפירה של פרוסות הלב באמצעות לב חזיר כדוגמה. אותו תהליך מוחל על לבבות אנושיים, כלבים, כבשים או חתולים. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מקווים להפיץ את הטכנולוגיה למעבדות אחרות בקהילה המדעית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל נוהלי החיות היו בהתאם להנחיות המוסדיים של אוניברסיטת לואיוויל ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש.
1. הכנה לפריסה (יום אחד לפני החיתוך)
- הכנת מיקרוטומה הרוטטת
- הניחו את הלהב הקרמי לתוך המחזיק בו באמצעות הצעדים הבאים: לאחר הסרת הלהב בזהירות, הצב את הקצה החד תחילה בחריץ של כלי הלהב. אז, להתאים את הלהב לתוך המחזיק על ידי התרופפות שני ברגים על זרועותיו של המחזיק ולהחליק את הלהב תחת כל מכונת כביסה ולדחוף אותו בחוזקה על העצירות האחוריות. הדק את הברגים כדי לאבטח את הלהב.
הערה: אין לחזק יותר מדי את הברגים. - כיול הלהב באמצעות פרוטוקול הכיול והכלים בהתאם לפרוטוקול היצרן.
הערה: בקצרה, כדי להקל על יישור הלהב באמצעות ציר הנסיעות וכלה בהפחתת החידוד של הציר Z, המיקרוטומה הרוטטת משתמשת בהתקן כיול מתקפל. כאשר התקן הכיול מחובר לתוך המכשיר שנוכחותו תזוהה באופן אוטומטי, והמיקרוטומה הרוטטת תיקח שליטה בהתאמת משרעת והגדרות התדר של הלהב לסדר גודל המאפשר התאמה מיטבית של שגיאת יישור הלהב.- לחץ על לחצן פרוסה כדי להתחיל את תהליך היישור שיגרום להזזת הלהב באופן אוטומטי כך שהקצה החדשני יהיה במצב אופטימלי יחסית להתקן הכיול להערכת היישור המיטבית. בצע את ההוראות שעל המסך כדי לבצע התאמות ללהב באמצעות המברג שסופק כדי להבטיח שיישור Z יהיה בטווח של 1 μm.
- הטבו את האמבט הפנימי ואת כל חלקי המתכת של המיקרוטומה הרוטטת.
- הניחו את הלהב הקרמי לתוך המחזיק בו באמצעות הצעדים הבאים: לאחר הסרת הלהב בזהירות, הצב את הקצה החד תחילה בחריץ של כלי הלהב. אז, להתאים את הלהב לתוך המחזיק על ידי התרופפות שני ברגים על זרועותיו של המחזיק ולהחליק את הלהב תחת כל מכונת כביסה ולדחוף אותו בחוזקה על העצירות האחוריות. הדק את הברגים כדי לאבטח את הלהב.
- אוטוקלב מגשי מתכת גדולים (עבור איסוף הפרוסות לספוג את הצלחת גירוי חשמלי מכסה), כל מיכלי זכוכית, להבי מלבן רגיל, מלקחיים, מספריים, מדפסת תזמון חגורה (לחתוך אותם לתוך 6 חלקים רחבים), שיבות מתכת 5 L של מים מזוקקים כפולים (ddH2O).
- לחטא צנצנת 1 L, 1 500 mL ומגש פלסטיק אחד ללב באתרו ובפרזיה מבחנה עם הפתרון הקרדיופיחה.
- הכינו 2 ליטר של התמיסה. "
- עבור 1 L של הפתרון של הפרוסות, מערבבים 3 g/L 2, 3-butanedione מונוקסימי (BDM), 140 מ"מ הנאל (8.18 g), 6 מ"מ KCl (0.447 g), 10 מ"מ D-גלוקוז (1.86 g), 10 מ"מ HEPES (2.38 g), 1 מ"מ MgCl2 (1 mL של 1 m פתרון), 1.8 Mm cacl2 (1.8 ml של 1 m פתרון), עד 1 L של ddh2O. להתאים את ה-PH ל7.40 באמצעות naoh. לאחר מכן, סנן את הפתרון באמצעות 1,000 mL, 0.22 μm, מערכת לסנן ואקום/אחסון ולאחסן ב 4 ° c בלילה.
- הכינו 4 ליטר של התמיסה הקרדיוליסטית.
- עבור 1 L של הפתרון cardioplegic, לערבב 110 מ"מ הנאל (6.43 g), 1.2 mM CaCl2 (1.2 mL של 1 M פתרון), 16 מ"מ kcl (1.19 g), 16 מ"מ mgcl2 (3.25 g), 10 מ"מ נחקו3 (0.84 g), 1 U/mL הפארין, עד 1 L של Ddh2O. כוונן את ה-pH ל7.40 באמצעות naoh. לאחר מכן, סנן את הפתרון באמצעות 1,000 mL, 0.22 μm, מערכת לסנן ואקום/אחסון ולאחסן ב 4 ° c בלילה.
הערה: הוסיפו 1,000 U/L הפארין בפתרון קרדיו, היום של החיתוך (ראה שלב 2.1).
- עבור 1 L של הפתרון cardioplegic, לערבב 110 מ"מ הנאל (6.43 g), 1.2 mM CaCl2 (1.2 mL של 1 M פתרון), 16 מ"מ kcl (1.19 g), 16 מ"מ mgcl2 (3.25 g), 10 מ"מ נחקו3 (0.84 g), 1 U/mL הפארין, עד 1 L של Ddh2O. כוונן את ה-pH ל7.40 באמצעות naoh. לאחר מכן, סנן את הפתרון באמצעות 1,000 mL, 0.22 μm, מערכת לסנן ואקום/אחסון ולאחסן ב 4 ° c בלילה.
- טרי להכין 500 mL של התרבות הבינונית בבקבוק המקורי בקבינט אבטחה טיחות: לערבב בינוני 199, 1x אינסולין-העברת-סלניום (שלה) תוספת, 10% סרום העובר העוברי (fbs), 5 ng/ml כלי הצמיחה אנדותל (מעבד), 10 ng/ml fbs-basic, 2x אנטיביוטי-antimycotic מסנן לעקר דרך מערכת 0.22 μm, מסנן ואקום/אחסון ולאחסן ב 4 ° c בלילה.
הערה: אין לכוונן את ה-pH, להוסיף לפני השימוש ב-, ולאחר FGF. - הכינו 4% לוחיות ג'ל באגר.
- הוסף 200 mL של העיקור ddH2O ב 500 מ"ל בקבוקון מעוקר. שוקלים 8 גר' של התעורר, ובעדינות לשפוך לתוך הבקבוקון. מרתיחים עבור 2 דקות במיקרוגל, ואז קריר עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- יוצקים 25 מ ל בכל צלחת פטרי 100 מ"מ בקבינט אבטחה טיחות (להכין 6 מנות) ולחכות 1 h כדי לגבש. לאחר מכן, לאטום את הצלחות עם סרט פרפין, לעטוף בניילון נקי, ולאחסן ב 4 ° c.
- להכין 4 L של 70% אתנול על ידי דילול האתנול 200-הוכחה מוחלטת באופן אוטומטי ddH2O.
- להכין 2x אנטיביוטי-antimycotic ב העיקור ddh2o: מערבבים 980 mL של העיקור ddh2o עם 20 מ ל של אנטיביוטי-antimycotic תחת הקבינט אבטחה טיחות.
2. לב חזיר Perfusion
- הוסף 1 מ ל של הפארין 1,000 U/mL לכל 1 L של הפתרון הקרדיופיחה. . שמור על הפתרון בקרח
הערה: לפחות 3 יש צורך בפרזיה ושימור הלב במהלך ההעברה לחדר התרבות של הרקמה. - לקחת את הפריטים הבאים לחדר ניתוח חזיר: אחד קרח גדול דלי מלא קרח, מתכת אחת המגש מעוקר (לשמור על דלי קרח עבור perfusion לב), אחד מעוקר 500 mL צנצנת, אחד לצנצנת 1 L (כדי להעביר את הלב בחזרה הפתרון לחדר תרבות הרקמה , על הקרח), ומגש פלסטיק אחד מעוקר מלא קרח (כדי לשמור על הפתרון הקרדיואופאלי על הקרח).
- להכין מערכת ההיתוך לב באתרו המכיל הקפאה 3-כיוון, מזרק 60 mL, 18 G פרפר המחט הצינור, ואת צינורות הרחבה למאגר הפתרון cardioplegic.
- שאיפה חזיר הזכר יורקשייר (2-3-חודש בן, 20 על 25 ק ג) הראשון עם הזרקת השרירים של קטמין (20 מ"ג/ק"ג)/xylazine (2 מ"ג/ק"ג) קוקטייל. לאשר הרדמה נכונה על ידי אובדן של מתח הלסת. ואז, להעביר את החזיר לחדר הניתוח, צנרור ולאוורר מכנית את הריאות כפי שתוארה בעבר14.
- שמירה על הרדמה עם (1.5-2%) איזופלוריין.
- הנח את החיה בתנוחה הצדדית הימנית וגלח את הפרווה מאזור החזה. נקה את העור עם לשפשף אלכוהול, ואז לחטא את האתר כירורגי עם 10% (w/v) povidone-פתרון יוד.
- פתח את החזה על ידי חתך האונה השמאלי השמאלית באמצעותth אזמל בחלל האינטרקוסטל 4, ולהשתמש במפסק החזה בין הצלעות כדי להחזיק את החזה פתוח לחשוף את הלב.
הערה: השתמש בכל המכשירים הציריליים עבור הליך זה. - הכנס את קטטר המחט פרפר לתוך האטריום השמאלי ולתקן את המחט עם סגירת מחרוזת הארנק. לאחר הזרקה ורידי של מינון מנת הפבית (100 U/kg), להתחיל לעשות את הלב באתרו עם 500 mL של פתרון קרדיו, קר הקרח הקרה (כדי להאט את קצב הלב) דרך צנתר שמאל פרפור.
- מורדם בצורה עמוקה את. החזיר עם 5% מלוריאן בזריזות את הלב מהחזה. עם מספריים כירורגיים בעזרת צינורית של אבי העורקים והפעלת הלב במבחנה עם עוד 1 L של התמיסה הקרה קרדיופיחה (100 mL/min) כדי לרוקן את הדם של vascuלטורה.
- לאחר הפרזיה לב, יש לשמור את הלב בצנצנת 1 L מלאה בתמיסת כבישה קרה ולשמור על קרח במהלך ההעברה לחדר התרבות של הרקמה.
3. חותך רקמת לב חזיר
- להגדיר את האמבטיה רקמה על הרטט, להוסיף קרח למעיל הקירור באמבט רקמות, ואז להוסיף את הפתרון של Tyrode לתוך האמבטיה רקמה. הגדרת כד פלסטיק 1 L כדי לאסוף את הסילוק של קרח נמס מן המעיל לקירור רקמת הרקמה.
- מתחת לארון הבטיחות, העבירו את לב החזיר למגש המכיל 1 ל' של התמיסה הקרה.
- מנתחים את הלב כדי לבודד את החדר השמאלי באמצעות מנתחים סטרילי לשליפה. ואז, לחתוך את החדר השמאלי לתוך בלוקים של 1-2 ס מ3 כל אחד באמצעות להבים מלבן תער. השתמש בחתיכה אחת לחיתוך ולשמור את החלקים הנותרים בצינור 50 mL בתמיסה הקרה של טירכב על קרח לחיתוך מאוחר יותר, במידת הצורך.
הערה: עסה את הרקמה לפני החיתוך בידיים, במיוחד אם זהו הבלוק השני. עיסוי מסייע לשחזר את התצורה הנכונה של סיבי השריר ומונע כל נוקשות בתוך בלוק הלב. - הוסף 1-2 טיפות של דבק רקמות (טבלה של חומרים) על מחזיק דגימת מתכת ולתקוע פיסת 4% אגר בלוק עם שטח של כ 1 ס מ2.
- הוסיפו 1-2 טיפות. של דבק רקמות באגר
- לתקוע את בלוק הלב לאגר עם צד הלב האפילידיום הפונה למטה על דבק רקמות ולוודא שהוא שטוח ככל האפשר. ואז, להעביר את מחזיק הרקמה עם בלוק הלב למיקומה באמבט הפרוסות של הרטט.
- הצמד את צינור החמצן לאמבט הפרוסות ולמגש המתכת המלא בתמיסה של טירודה לאיסוף הפרוסות (אמבט טירודה מחמצן). לאחר מכן, להוסיף 40 יקרומטר תא מכשירי במגש מתכת כדי לאסוף את הפרוסות לאחר חיתוך.
- התאמת מיקום הפרוסות
- באמצעות תוכנת ההפעלה והרטט של לוח המחוונים, התאם את גובה הלהב/דגימה. בחר את לחצן הגובה ובצע את ההוראות שעל המסך כדי לכוונן את הגובה. באופן אידיאלי, יש את הלהב קרוב לראש הרקמה אבל מתחת לשרירי הלסת ולוודא שיש נוזל המכסה את הרקמה ואת הלהב לפני החיתוך.
- התאם היכן להתחיל לחתוך את הרקמה על-ידי בחירת הלחצן מראש . לחץ על כפתור פרוסה ולהגדיל את המהירות באמצעות הכפתור כדי להזיז את הלהב לכיוון קצה הרקמה. לאחר מכן, הקש על פרוסה שוב כדי להפסיק ולחץ על הלחצן מראש כדי לבטל את התהליך.
- להתאים את הפרמטרים גזירה: מהירות מראש = 0.03 מ"מ/s, תדר רטט = 80 Hz, ו משרעת הרטט אופקי = 2 מ"מ. לאחר מכן, התחל בחיתוך על-ידי בחירה בלחצן פרוסה .
- תן את הרטט הפרוסות עד שהוא מגיע לסוף הרקמה, אך לפני שהוא פוגע בקצה האחורי של מחזיק הדגימה. בשלב זה, הקש שוב על חתוך כדי להפסיק. להכות את כפתור ההחזרה כדי לחזור למיקום ההתחלה.
- בחרו ' חזרה אוטומטית ' (לחיצה פעמיים) שתאפשר למיקרוטומה הרוטטת לחזור באופן אוטומטי על תהליך הפריסה עד 99 פעמים.
- איסוף פרוסות
- המתן עד שפרוסות הן באורך מלא ונראות טוב (לאחר שעברו את שכבות השריר הפטובות), ולאחר מכן התחילו לאסוף את הפרוסות.
- לאסוף את הפרוסות באמצעות פיפטה פלסטיק פסטר ממולא הפתרון של Tyrode הקרים כדי לתפוס בעדינות את הרקמה מהאמבטיה. במקרה הצורך, השתמש מלקחיים ומספריים האביב כדי לנתק את הפרוסה מבלוק הלב אם הרקמה עדיין מחוברת.
- להעביר את הפרוסה לתוך מסננת תא אחד באמבטיה של Tyrode מחמצן (ראה שלב 3.7) ולהשתמש בנוזל הצינורות הפלסטיק פסטר כדי לקבל את הרקמה לשכב שטוח על אחד מהניידים התא, ולאחר מכן להוסיף מנקה מתכת על גבי להחזיק את הרקמה למטה.
הערה: הפרוסות צריך להיות מודלפחות עבור 1 h בפתרון של Tyrode לפני העיבוד (זה עבור BDM כדי להרגיע את הרקמה).
4. שבבי פרוסות לב
-
הכנת הפרוסות לתרבות
- חתוך את הפרוסה מהקצוות כדי למנוע קצוות לא אחידים. אז, להדביק אותו משני הקצוות של פוליאוריטן מעוקר 6 מ"מ מדפסת רחב חגורה תזמון עם חוטי מתכת מוטבע באמצעות דבק רקמת.
- העבר את פרוסות הלב הנתמכות ל-6 לוחות היטב המכילים 6 מ ל של התרבות הבינונית בכל באר.
- מניחים את מכסה לוחית הגירוי (טבלת חומרים) בחלק העליון של 6 הצלחות היטב ומחברים את המכסה לגירוי חשמלי של תרבות התא (טבלת חומרים). כוונן את הגירוי לחשמל כדי לגרות את פרוסות הלב ב-10 V, 1.2 Hz ברציפות כל הזמן.
הערה: לאחר חיבור הגירוי, פרוסות הלב יתחילו לפעום, ותנועה זו תהיה ברורה מבחינה חזותית. - העבירו את הלוחות לאינקובטור ושמרו על 37 ° c עם מחולל לחות ו-5% CO2.
- שינוי תרבות בינונית 3 x ליום ולהוסיף 6 מ ל של התרבות בינונית לכל טוב במהלך כל שינוי המדיה.
הערה: בינונית תרבותית במשך 5 דקות לפני כל שינוי במדיה. יש לשנות בינונית לפחות 1x ליום; זה בסדר בסופי שבוע אם צריך. יומיים של רק שינוי אחד במדיה ביום הוא המקסימום שנבדק. -
שנה את כיסוי לוחית הגירוי מדי יום כדי למנוע שחרור חלקיקי גרפיט רעילים במדיום התרבותי (בדרך כלל במהלך שינוי המדיה באמצע היום).
- הסר את מכסה לוחית הגירוי מתוך צלחת התרבות והכנס את תקע הקצף הלבן שבו המכסה מתחבר לכבל של הגירוי החשמלי של תרבות התא, כדי למנוע נזק למים למעגל החשמלי.
- מניחים את כיסוי הצלחת באמבטיה של מים אוטומטיים עם 2x אנטיביוטי-antimycotic. שמור אותו באמבטיה זו (כלומר, אמבטיה שטיפה) בלילה.
- למחרת, הזיזו את כיסוי הצלחת לאמבט אתנול של 70% עבור 5-15 דקות עד טהרים. הרעד הנוזלי הרבה יותר מהמכשיר לפני החלפת האמבטיות.
- ואז, להעביר את כיסוי הצלחת לאמבטיה השלישי והאחרון (כלומר, לנקות אמבטיה), אשר מורכב מים אוטוקלבים ו-2x אנטיבקטריאלי-antimycotic, כדי לשטוף את כל עקבות אתנול שנותרו.
- לאחר שטיפה את כיסוי הצלחת באמבטיה נקייה, להשתמש נקי מוך לנגב (מרוסס עם אתנול) כדי לייבש את כל המים השאריות על חלקי פלסטיק, לאחר מכן להסיר את פיסת קצף לבן מקום בזהירות לכסות את הצלחת בחזרה על צלחת התרבות.
הערה: אין לגעת באלקטרודות גרפיט שחורים שנכנסים לתוך הבאר, כמו המכשיר לא יהיה יותר סטרילי. - באמצעות מלקחיים סטרילי, לוודא את הרקמה היא במרכז הבאר כך כיסוי הצלחת לא לגעת ברקמה. ודא כי הצד המעוקל של כיסוי הצלחת מתאים עם הצד הזוויתי של הצלחת וכי פינות מרובעות קו למעלה.
הערה: כדי למזער את הזיהום של מכסה לוחית גירוי, לשמור אותם נקי וריק לוחית 6 לאחר סיום הניסוי.
- בצע ביצוע של שיטת MTT, מדידות סידן והערכות הפונקציה על פרוסות לב חזיר טרי (יום 0), ואחרי 6 ימים בתרבות לפי Ou et al.13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות ממריץ מסחרי של תרבות התא הזמין מסחרית כי יכול להכיל שמונה 6 צלחות היטב בבת אחת, אנו לחיקוי של למבוגרים את הסביבה הלב על ידי גרימת גירוי חשמלי בתדר הפיזיולוגי (1.2 Hz), והוקרן עבור רכיבים בינוניים בסיסיים כדי להאריך את המשך של פרוסות לב של חזיר פונקציונלי בתרבות13. מאז לבבות חזיר ובני אדם דומים בגודל ואנטומיה15, פיתחנו לב ביואידיי מערכת התרבות הפרוסה באמצעות לבבות חזיר ולאחר מכן אימות אותו בפרוסות לב האדם. כאן, המפורט את הפרוטוקול לפרוסות לב של חזיר שהוא הליך זהה לחיתוך לב האדם והפיג. ההתקנה החדשה של התרבות הביותיבית תיאר כאן, שמר על הכדאיות של פרוסות לב חזיר עבור 6 ימים כפי שמוערך על ידי שיטת MTT (איור 1א). אנו אישר את הכדאיות התפקודית של פרוסות אלה מעל 6 ימים על ידי הערכת הומאוסטזיס סידן שלהם כוח הקונקטילה. בששת הימים הראשונים, אין מעבר סידן ספונטני בקרדיוציטים, והקרדיוציטים הגיבו לגירוי חשמלי חיצוני, כמו גם גירוי β-אדראררגיות דומה לפרוסות לב טריות (איור 1ב'). בנוסף, הכוח והתגובות האיזוקטיתיים הינם מתוחזקים בפרוסות לב מתורבתות עד 6 ימים, בדומה לפרוסות לב טריות (איור 1ג, ד).
איור 1: ואלידציה של הכדאיות והפונקציונליות של התרבות הפרוסה של לב החזיר. (א) קוונפיקציה של מערכת הכדאיות של הלב לאורך זמן באמצעות בדיקת mtt במערכת התרבות מגורה או בלתי מגורה בינונית ממוטבת (n = 5 לבבות חזיר כל אחד טרילקאט, SEM מיוצגת כקווי שגיאה; מבחן ANOVA דו כיוון נערך להשוות בין קבוצות, * p < 0.05). (ב) המייצג סימן סידן מתוך פרוסת לב טרי (יום 0) ואחרי 6 ימים בתרבות (יום 6) עם ובלי 1 μm איזוטרואנרול (Iso) גירוי. מארעיות נרשמו לאחר טעינת פרוסות הלב עם Fluo-4 צבע סידן ושימוש 1 הרץ/20 V גירוי חשמלי בזמן ההקלטה. הקוונפיקציה של אות סידן משרעת עם וללא גירוי עם אלכוהול איזוטראנרול מראה דפוס דומה של מעבר סידן ביום 0 ויום 6 בתרבות (n = 4 לבבות חזיר, 10-15 תאים שנותחו בכל אחד מהם, SEM מיוצג כקווי שגיאה; מבחן ANOVA דו כיוון נערך להשוות בין קבוצות, * p < 0.05 השוואת בסיס לגירוי Iso באותה נקודת זמן, p-valueD0 Vs D6 = 0.95, ו-p-ValueD0 Iso לעומת D6 iso = 0.93). (ג) כיוונון כוח כפוי (פאנל שמאלי); את הפרוסה הלב (HS) הוא נתלה בין מתמר כוח (FT) והצבה יציבה (P) בין שתי אלקטרודות חשמליות (EE) עבור גירוי חשמלי. עם גירוי, חוזי הפרוסה והצירים נרשמים באמצעות התוכנה המיועדת (הלוח הימני). (ד) גרף עמודות מראה את כימות הכוח הקונקטינול בנוכחות או היעדרות של איזופנול (Iso) שנוצר על ידי פרוסות לב חזיר טרי (יום 0) ולאחר 6 ימים בתרבות ביותיתית (n = 4 לבבות חזיר כל אחד בטרילקאט, SEM מיוצג כקווי שגיאה; מבחן ANOVA דו כיוון נערך להשוואה בין קבוצות, * p < 0.05 השוואת בסיס לגירוי Iso באותה נקודת זמן, עווית כוח: p-valueD0 vs D6 = 0.96, p-ערךD0 iso vs D6 iso = 0.81; זמן ל50%-value: p-ערך D0 vs D6 = 0.47, p-ערךD0 Iso Vs D6 iso = 0.43). דמות זו שונתה מ-Ou et al.13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| מצב | פישר ואח '16 | Ou ואח '13 |
| ינים | אדם | חזיר ואדם |
| מחלה | לבבות נכשלים | לבבות בריאים ונורמליים |
| שימור | רקמה שנשמרה | רקמה טרייה |
| עובי פרוסה | 300 יקרומטר | 300 יקרומטר |
| חמצן בינוני | לא | חמצן Intermittant |
| מדיום לתרבות | M199/ITS | M199/הוראות/הוראות/מיקוד |
| עצבנות | כן | לא |
| קצב תנועה | 0.2 הרץ | 1.2 הרץ |
| משך התרבות | 4 חודשים עם פשרה | 6 ימים ללא פשרות |
| טמפ ' הטמפרטורה | 37 | 37 |
| טעינה מכנית | העמסה וטעינה | ללא טעינה |
| הזמן נבדק נקודות ללא שינוי בביטוי הגנים בהשוואה לפרוסת לב טרייה | N/A | 2 ו -6 ימים |
| נקודת זמן שנבדקה ראשונה להצגת שינוי בביטוי הגנים | יום 8 | היום העשירי |
טבלה 1: השוואה בין תנאי החיתוך והתפירה המשמשים בפישר ואח '16 ובין אם.13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים את פרוטוקול וידאו מפורט עבור השיטה שפורסמה לאחרונה עבור תפוקה בינונית פשוטה (תהליכים עד 48 פרוסות/התקן) שיטה המאפשרת תרבות של פרוסות לב חזיר לתקופה ארוכה מספיק כדי לבדוק את הקרדיולקסיניטי החריפה13. התנאים המוצעים מחקים את הסביבה של הלב, כולל תדירות של גירוי חשמלי, זמינות תזונתי וחמצון לסירוגין. אנו מייחסים את הכדאיות הממושכת של פרוסות הלב בתרבות הביותית שלנו ומעוררת את ההתמקדות שלנו בשחזור התנאים הפיזיולוגיים שחוו הלב השלם. קונספט זה נתמך על ידי הנתונים שלנו מראה כי גירוי חשמלי בלבד, מבלי לספק חומרים מזינים חיוניים, לא מספיק כדי לשמור על הכדאיות לחתוך לב13. לכן, המרכיבים החדשים של מדיום התרבות הם מנהל ההתקן העיקרי להארכת הכדאיות והפונקציונליות של משולש הלב בתרבות. מצאנו כי חיוני לכלול FBS במדיום כדי לשמור על הכדאיות, אשר צפוי בשל הדרישה למגוון של חומצות שומן, מעקב אלמנטים, אנזימים, חלבונים, קרו, רכיבים כימיים, הורמונים, אשר נמצאים בדרך כלל בסרום ונמסר רקמת הלב ב vivo17. יתר על כן, מצאנו כי תוספת של FGF ו-מדיום התרבות נחוצים כדי לשפר את הכדאיות רקמות. FGF ו-ומהם גורמים מוכרים באמצעות אנגיוגנטית, החיוניים לתחזוקת תאים מתורבתים משנת18. לפיכך, סביר להניח כי FGF ו-וורף נדרשים לשמור על תאי האנדותל ורקמות החיבור בתרבות כדי לתמוך ביכולת הרקמות. עבודתנו היא הראשונה לשנות את מדיום התרבות הפשוטה שדווחה בעבר לפרוסות לב של culturing, והיא פותחת את האפשרות למיטוב נוסף של רכיבי המדיה במחקרים הבאים.
בזמן הדרך עם השיטה החדשה שלנו, היו עוד שלושה מחקרים שהפגינו את החשיבות של גירוי אלקטרו-מכאני מתמשך בשמירה על פרוסות בתרבות במערכות ביונדסה16,19,20. עם זאת, מחקרים אלה השתמשו בבסיס M199/המדיום שלה, אשר אינו מספיק כדי לשמור על הצרכים המטבולית של פרוסות לב. זה הוביל לפשרות אחדות בתוך החיתוך והומאוסטזיס סידן מוקדם במהלך התרבות16,19,20. Qiao et al.19 פיתח שבבי ביו הנדסה מתוחכמים ביותר, היכולים לשמור על התכונות האלקטרופיזיולוגיות של פרוסות הלב במשך 4 ימים, אך לא ניתן להעריך את התפקוד הקונקטילה. ווטסון ואח '20 יש נדס נדסה במערכת התפוקה נמוכה תרבות (תהליכים עד 4 פרוסות/התקן) כדי להדגים את החשיבות של האורך סרקומר דיאסטולי עבור תחזוקה של תכונות שריר הלב עבור 24 h. לבסוף, פישר ואח '16 הראו שניתן לשמור על כישלון בפרוסות של לב אנושי בתוך מבחנה של עד 4 חודשים כאשר הם מתורבתים תחת 0.2 הרץ, העמסה ועומס מדיה במכשיר ביולוגי. עם זאת, תנאים אלה המושרה מגוון של שינויים בפרוסות הלב, כפי שמתבטא בנתוני RNAseq שלהם, אשר הראו מעל 10 הפחתת מקפלים של ביטוי גנים לב מוקדם כמו נקודת הזמן הראשונה של הערכה (יום 8)16. עם זאת, במערכת התרבות האופטימיזציה שלנו, רק 2 ו -5 התעתיקים הביעו באופן משמעותי לאחר 2 ו 6 ימים בתרבות לעומת רקמת לב טרייה, בהתאמה. עם זאת, לאחר 10 ימים בתרבות, היו שינויים משמעותיים בביטוי של למעלה מ 500 תעתיקים. הגנים מוסדרים לאחר 10 ימים בתרבות היו קשורים בעיקר לשריר הלב, בעוד הגנים upregulated קשורים לפיברותקיעות, מטריקס מסחטות, ודלקת13. טבלה 1 כוללת השוואה מלאה בין הפרוטוקולים לפריסה ולתרבות בין פישר ואח '16 לבין Ou et al.13. לכן, מערכת התרבות המעוררת שלנו מחקה את התנאים הנמצאים בשליטה על ידי הלב באתרו, ולכן יש לספק בדיקה מהימנה של התוצאות התפקודיות והמבניות של הטיפול בסמים ביחס לבעיות הקרדיוקטיביות או היעילות בהשוואה למערכות תרבות בסיכון.
אחת המגבלות העיקריות של מערכת התרבות הזו היא שלמרות שמערכת התרבות שלנו יכולה לחקות מספר מצבים פיזיולוגיים, היא אינה יכולה לחקות שינויים בעומס מכני ולהטות את המתח במהלך מחזור הלב. אופטימיזציה נוספת של גורמים פיזיולוגיים ומטבולית יכול לעזור להאריך את הכדאיות לחתוך לב ותפקוד. בנוסף, שמנו לב לעיבוד מוקדם אשר מוביל לdiminishment של זרחון חמצוני אשר עשוי להסית את הידרדרות של הכדאיות בחיתוך הלב13. למרבה הצער, עד כה, לא הצלחנו לזהות שיטה אופטימלית לשמור על זירחון חמצוני. סביר להניח כי שיפור חילוף החומרים חומצת שומן בפרוסות לב אינו פשוט כמו הוספת חומצות שומן למדיום הצמיחה, ידרוש אופטימיזציה נוספת, אשר ניתן לטפל במחקרים עתידיים. יתר על כן, חולשה כללית של גישה זו היא המדידה החסרה של פוטנציאל הפעולה על הקרדיוציטים בודד בתוך פרוסת הלב, אשר חיוני להפגין הפרעה בדופק חשמלי והפרעת קצב לב חדרית. לכן, יש צורך לייעל את הפרוטוקולים כדי לבודד קרדיוומיציטים בודד מתוך פרוסות הלב לאחר הטיפול עם cardiotoxins שיגרמו לשיבוש בדיקת החשמל ולאמוד את השפעתם על פוטנציאל הפעולה של הקרדיוומיציטים מבודדים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לגברת ההון העצמי בטאיה Therapeutics. המחברים האחרים מדווחים שאין התנגשויות.
Acknowledgments
TMAM נתמך על ידי NIH מענק P30GM127607 ואיגוד הלב האמריקאי המענק 16SDG29950012. RB נתמכת על ידי P01HL78825 ו-UM1HL113530.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks - | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
- Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature. BMC Medicine. 14, 10 (2016).
- Fermini, B., Fossa, A. A. The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).
- Moslehi, J. J. Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies. The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).
- Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).
- Kretzschmar, K., et al. Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).
- Perbellini, F., et al. Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices. Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Jones, S. P., et al. The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs. Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).
- Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).
- Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts. BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).
- Vuorenpaa, H., et al. Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 50 (4), 275-286 (2014).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).
