Summary
Этот протокол описывает, как нарезать и культуры сердечной ткани в физиологических условиях в течение 6 дней. Эта культурная система может быть использована в качестве платформы для тестирования эффективности новых терапевтических препаратов сердечной недостаточности, а также надежного тестирования острой кардиотоксичности в 3D-модели сердца.
Abstract
Многие новые препараты не в клинических исследованиях из-за кардиотоксических побочных эффектов, как в настоящее время доступны в пробирке анализы и in vivo животных моделей плохо предсказать человека сердечной обязательств, что создает многомиллиардное бремя на фармацевтической промышленности. Таким образом, во всем мире существует неудовлетворенная медицинская потребность в более эффективных подходах к выявлению сердечно-токсичности наркотиков, прежде чем проводить дорогостоящие и трудоемкие испытания «первых в людях». В настоящее время, только незрелые сердечные клетки (человек индуцированных плюрипотентных стволовых клеток полученных кардиомиоцитов (hiPSC-CMs) используются для проверки терапевтической эффективности и токсичности наркотиков, поскольку они являются единственными человеческими сердечными клетками, которые могут быть культивированы в течение длительных периодов времени для проверки эффективности и токсичности препарата. Однако один тип клеток не может воспроизвести фенотип сложной 3D-ткани сердца, которая формируется из нескольких типов клеток. Важно отметить, что влияние препаратов необходимо протестировать на взрослых кардиомиоцитов, которые имеют различные характеристики и токсичность реакции по сравнению с незрелыми hiPSC-CMs. Культивирование человеческих ломтиков сердца является перспективной моделью нетронутыми человеческого миокарда. Эта технология обеспечивает доступ к полной многоклеточной системе, которая имитирует ткани сердца человека и отражает физиологические или патологические условия миокарда человека. Недавно, путем оптимизации компонентов культурных медиа и условий культуры, чтобы включить непрерывную электрическую стимуляцию на уровне 1,2 Гц и прерывистую оксигенацию культуры среды, мы разработали новую систему культуры, которая сохраняет жизнеспособность и функциональность человеческих и свиных ломтиков сердца в течение 6 дней в культуре. В текущем протоколе мы подробно описываем метод нарезки и культивирования свиного сердца в качестве примера. Тот же протокол используется для культуры ломтики из человеческих, собак, овец или кошек сердца. Эта культурная система имеет потенциал, чтобы стать мощным прогностическим человеком на месте модели для острого тестирования кардиотоксичности, которая закрывает разрыв между результатами доклинических и клинических испытаний.
Introduction
Препарат индуцированной кардиотоксичности является основной причиной вывода рынка1. В последнее десятилетие20-го века, восемь не сердечно-сосудистых препаратов были сняты с рынка, поскольку они привели к внезапной смерти из-за желудочковой аритмии2. Кроме того, несколько противораковых методов лечения (в то время как во многих случаях эффективным) может привести к нескольким кардиотоксическим эффектам, включая кардиомиопатию и аритмии. Например, как традиционные (например, антрациклы и радиация), так и целевая (например, трастузумаб) терапия рака молочной железы могут привести к сердечно-сосудистым осложнениям у подмножества пациентов3. Тесное сотрудничество между кардиологами и онкологами (через формирующуюся область "кардиоонкологии") помогло сделать эти осложнения управляемыми, гарантируя, что пациенты могут быть эффективно лечить2. Менее ясны сердечно-сосудистые эффекты новых агентов, в том числе Her2 и PI3K ингибиторы, особенно когда терапии используются в комбинации. Таким образом, существует растущая потребность в надежных стратегиях доклинического скрининга сердечно-сосудистой токсичности, связанной с возникающими противораковыми методами лечения до клинических испытаний на людях. Отсутствие культурных систем для тканей сердца человека, которые функционально и структурно жизнеспособны для более чем 24 ч является ограничивающим фактором для надежного тестирования кардиотоксичности. Поэтому необходимо срочно разработать надежную систему культивирования тканей сердца человека в физиологических условиях для тестирования токсичности лекарств.
Недавнее движение в направлении использования антропогенных плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов (hiPSC-CMs) в кардиотоксичности тестирования предоставил частичное решение для решения этой проблемы; однако, незрелый характер hiPSC-CMs и потеря целостности ткани по сравнению с многоклеточной природой сердечной ткани являются основными ограничениями этой технологии4. Недавнее исследование частично преодолело это ограничение путем изготовления сердечных тканей из HIPSC-CMs на гидрогелях и подвергая их постепенному увеличению электрической стимуляции с течением времени5. Однако их электромеханические свойства не достигли зрелости, наблюдаемой у взрослого человека миокарда. Кроме того, сердечная ткань структурно сложнее, состоящая из различных типов клеток, включая эндотелиальные клетки, нейроны и различные типы стромальных фибробластов, связанных вместе с очень специфической смесью внеклеточных матричных белков6. Эта неоднородность некардиомиоцитной популяции клеток7,,8,,9 у сердца взрослых млекопитающих является основным препятствием в моделировании сердечной ткани с использованием отдельных типов клеток. Эти основные ограничения подчеркивают важность разработки методов, позволяющих культуре нетронутой сердечной ткани для оптимальных исследований с участием физиологических и патологических состояний сердца5.
Культивирование человеческих ломтиков сердца является перспективной моделью нетронутой человеческой миокарда. Эта технология обеспечивает доступ к полной 3D многоклеточной системе, которая похожа на ткани сердца человека, которые могут надежно отражать физиологические или патологические условия миокарда человека. Тем не менее, его использование было серьезно ограничено коротким периодом жизнеспособности в культуре, который не выходит за пределы 24 ч с использованием самых надежных протоколов сообщили до 201810,11,12. Это ограничение было связано с несколькими факторами, включая использование воздушно-жидкого интерфейса для культуры ломтики, и использование простой среды культуры, которая не поддерживает высокие энергетические требования сердечной ткани. Недавно мы разработали систему подводной культуры, которая способна обеспечить непрерывную электрическую стимуляцию и оптимизировать компоненты культуры средств массовой информации, чтобы сохранить срезы сердечной ткани жизнеспособными на срок до 6 дней13. Эта культурная система имеет потенциал, чтобы стать мощным прогностическим человеком на месте модели для острого тестирования кардиотоксичности, чтобы закрыть разрыв между доклиническими и клиническими результатами тестирования. В текущей статье мы подробно описываем протокол для нарезки и культивирования ломтиков сердца с помощью свиного сердца в качестве примера. Тот же процесс применяется к человеческому, собаке, овце или кошке сердца. С помощью этого протокола мы надеемся распространить технологию в другие лаборатории научного сообщества.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для животных были в соответствии с институциональными руководящими принципами Университета Луисвилла и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию.
1. Подготовка к нарезке (за день до нарезки)
- Подготовка вибрирующего микротома
- Поместите керамический лезвие в его держатель, выполнив следующие действия: после тщательного разворачивания лезвия, поместите острый край сначала в слот инструмента лезвия. Затем, вписываются лезвие в держатель, ослабляя два винта на руках держателя и слайд лезвие под каждой шайбой и нажмите его твердо назад против задних остановок. Затяните винты, чтобы закрепить лезвие.
ПРИМЕЧАНИЕ: Винты не должны быть затянуты. - Откалибровать лезвие с помощью протокола калибровки и инструментов в соответствии с протоколом производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вкратце, для того, чтобы облегчить выравнивание лезвия с осью путешествия и свести к минимуму отклонения оси, вибрирующий микротом использует съемное калибровочное устройство. Когда калибровочное устройство будет подключено к инструменту, его присутствие будет автоматически обнаружено, и вибрирующий микротом возьмет под контроль регулировку амплитуды и частотных настроек лезвия до величины, которая наилучшим образом позволяет регулировать ошибку выравнивания лезвия.- Нажмите кнопку Slice, чтобы начать процесс выравнивания, который автоматически переместит лезвие так, чтобы передний край находился в оптимальном положении по сравнению с калибровозававаемым устройством для наилучшей оценки выравнивания. Следуйте инструкциям на экране, чтобы внести коррективы в лезвие с помощью предоставленной отвертки, чтобы убедиться, что выравнивание в пределах 1 мкм.
- Автоклав внутренняя ванна и все металлические части вибрирующего микротома.
- Поместите керамический лезвие в его держатель, выполнив следующие действия: после тщательного разворачивания лезвия, поместите острый край сначала в слот инструмента лезвия. Затем, вписываются лезвие в держатель, ослабляя два винта на руках держателя и слайд лезвие под каждой шайбой и нажмите его твердо назад против задних остановок. Затяните винты, чтобы закрепить лезвие.
- Автоклав большие металлические лотки (для сбора ломтиков и замачивания электрической стимуляции пластины охватывает), любые стеклянные контейнеры, регулярные прямоугольник лезвия, щипцы, ножницы, ремень времени принтера (разрезать их на 6 мм широкие куски), металлические шайбы и 5 л двойной дистиллированной воды (ddH2O).
- Стерилизовать один 1 l банку, один 500 мл банку и один пластиковый лоток для сердца на месте и в пробирке перфузии с кардиоплегическим раствором.
- Подготовьте 2 л раствора нарезки Tyrode в стакане 2 l.
- Для 1 л раствора нарезки Tyrode, смешайте 3 г/л 2,3-бутанедион моноксим (BDM), 140 мМ NaCl (8,18 г), 6 мМ KCl (0,447 г), 10 мМ D-глюкоза (1,86 г), 10 мм HEPES (2,38 г), 1 мМ MgCl2 (1 мл 1 мл раствора 1 М), 1,8 мм CaCl2 (1,8 мл 1 мл раствора), до 1 л ddH2O. Отрегулируйте рН до 7.40 с помощью NaOH. Затем отфильтруйте раствор, используя 1000 мл, 0,22 мкм, вакуумный фильтр/систему хранения и храните при 4 градусах Цельсия на ночь.
- Подготовьте 4 л кардиоплегического раствора.
- Для 1 л кардиоплегического раствора смешайте 110 мМ NaCl (6,43 г), 1,2 мМ CaCl2 (1,2 мл 1 мл 1 млн раствора), 16 мм ККл (1,19 г), 16 мМ MgCl2 (3,25 г), 10 мм NaHCO3 (0,84 г), 1 U/mL heparin, до 1 л ddH2O. Отрегулируйте рН до 7.40 с помощью NaOH. Затем отфильтруйте раствор, используя 1000 мл, 0,22 мкм, вакуумный фильтр/систему хранения и храните при 4 градусах Цельсия на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 1000 U/L гепарина в кардиоплегийный раствор в день нарезки (см. шаг 2.1).
- Для 1 л кардиоплегического раствора смешайте 110 мМ NaCl (6,43 г), 1,2 мМ CaCl2 (1,2 мл 1 мл 1 млн раствора), 16 мм ККл (1,19 г), 16 мМ MgCl2 (3,25 г), 10 мм NaHCO3 (0,84 г), 1 U/mL heparin, до 1 л ddH2O. Отрегулируйте рН до 7.40 с помощью NaOH. Затем отфильтруйте раствор, используя 1000 мл, 0,22 мкм, вакуумный фильтр/систему хранения и храните при 4 градусах Цельсия на ночь.
- Свежеприготовленные 500 мл культуры среды в оригинальной бутылке в биобезопасности кабинет: смесь среднего 199, 1x инсулин-трансферрин-селен (ITS) дополнение, 10% плода крупного рогатого скота сыворотки (FBS), 5 нг /мЛ сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), 10 нг/мл FGF-основной, и 2x антибиотик-антико. Фильтр стерилизовать через 0,22 мкм, вакуумный фильтр / система хранения и хранить на 4 градуса Цельсия в одночасье.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не настраивайте рН, добавляйте VEGF и FGF перед использованием. - Приготовьте 4% пластин агар-геля.
- Добавьте 200 мл стерилизованной дДГ2O в стерилиизованную колбу 500 мл. Взвесить 8 г агарозы и аккуратно вылейте в колбу. Отварить 2 мин в микроволновой печи, затем охладить в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Налейте 25 мл в каждой 100 мм Петри блюдо в биобезопасности шкаф (приготовить 6 блюд) и ждать 1 ч, чтобы затвердеть. Затем запечатайте тарелки парафиновой пленкой, заверните чистой пленкой и храните при 4 градусах Цельсия.
- Подготовка 4 L 70% этанола путем разбавления 200-доказательство абсолютного этанола в autoclaved ddH2O.
- Подготовка 2x антибиотик-антимикоттик в стерилизованных ddH2O: смесь 980 мл стерилизованных ddH2O с 20 мл антибиотико-антимикотикподов под шкаф биобезопасности.
2. Перфузия сердца свиньи
- Добавьте 1 мл 1000 u/mL гепарина к каждому 1 L кардиоплегического раствора. Держите раствор на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: По крайней мере 3 L необходимы для перфузии и сохранения сердца во время передачи в комнату культуры тканей. - Возьмите следующие элементы в комнату хирургии свиньи: один большой лед ведро, полное льда, один стерилизованный металлический лоток (держать на льду ведро для перфузии сердца), один стерилизованный 500 мл банку, один 1 L банку (для передачи сердца в кардиоплегии решение обратно в комнату культуры ткани , на льду), и один стерилизованный пластиковый лоток, полный льда (чтобы сохранить кардиоплегический раствор на льду).
- Подготовьте на месте сердце перфузийной системы, содержащей 3-путь стопкок, 60 мл шприц, 18 G бабочка иглы катетер, и расширение трубки для кардиоплегического раствора резервуара.
- Анестезия йоркширской свиньи мужского пола (2-3 месяца, 20-25 кг) сначала с внутримышечной инъекции кетамина (20 мг/кг) / ксилазин (2 мг/кг) коктейль. Подтвердите правильную анестезию потерей напряжения челюсти. Затем, передать свинью в хирургическое отделение, интубировать и механически проветрить легкие, как ранее описано14.
- Поддержание анестезии с (1,5–2%) изолюран.
- Поместите животное в нужное боковое положение и побрить мех из области груди. Очистите кожу спиртовым скрабом, затем стерилизуйте хирургическое место 10% (w/v) повидон-йодным раствором.
- Откройте грудь левым разрезом торакотомии с помощью скальпеля на4-м межреберном пространстве, и используйте втягиватель груди между ребрами, чтобы держать грудь открытой и подвергать сердце.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте все стерилизованные инструменты для этой процедуры. - Вставьте катетер иглы бабочки в левое предсердие и зафиксировать иглу с закрытием шнура портмоне. После внутривенной инъекции болисовой дозы гепарина (100 U/kg), начните пронизать сердце на месте 500 мл ледяного кардиоплегического раствора (для замедления сердечного ритма) через левый предсердный катетер.
- Глубоко обезвлечить свинью с 5% изолюран. Быстро вырезать сердце из груди с хирургическими ножницами. Каннуляция аорты с аортальной канюли и наполнить сердце в пробирке с другой 1 L ледяной кардиоплегический раствор (100 мл / мин), чтобы избавиться от сосудистой крови.
- После перфузии сердца, держать сердце в 1 l банку заполнены ледяной кардиоплегии раствор и держать на льду во время передачи в комнату культуры тканей.
3. Свинья сердца Ткани Нарезки
- Настройте тканевую ванну на вибратом, добавьте лед в куртку для охлаждения тканей, затем добавьте раствор Tyrode в ванну ткани. Навяжните 1 l пластиковую банку для сбора расплавленного льда из куртки охлаждения ванной ткани.
- Под шкафом биобезопасности перенесите свиное сердце в лоток, содержащий 1 л свежего холодного кардиоплегического раствора.
- Вскрыть сердце, чтобы изолировать левый желудочек с помощью выдвижных стерильных скальпелей. Затем разрежьте левый желудочек на блокипо 1,2 см каждый с помощью лезвий прямоугольника бритвы. Используйте один кусок для нарезки и держать оставшиеся части в 50 мл трубки в растворе холодного Tyrode на льду для резки позже, если это необходимо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Массаж ткани перед нарезки руками, особенно если это второй блок. Массаж помогает восстановить правильную конфигурацию мышечного волокна и предотвращает любую жесткость внутри блока сердца. - Добавьте 1'2 капли клея ткани(Таблица материалов)к держателю образца металла и приклейте часть блока агара 4% с площадью поверхности приблизительно 1 см2.
- Добавьте на агар 1,2 капли тканевого клея.
- Придерживайтесь блок сердца к агару с сердечной стороны эпикардия лицом вниз на клей ткани и убедитесь, что это как плоский, как это возможно. Затем перенесите держатель ткани с блоком сердца в его положение в нарезающей ванне вибратом.
- Прикрепите кислородную трубку к нарезной ванне и металлический лоток, наполненный раствором Tyrode для сбора ломтиков (кислородная ванна Тирода). Затем добавьте 40 мкм ячейки ситечко в металлический лоток, чтобы собрать ломтики после резки.
- Регулировка положения нарезки
- Используя программное обеспечение для работы с вибратом и приборную панель, отрегулируйте высоту лезвия/образца. Выберите кнопку высоты и следуйте инструкциям на экране для регулировки высоты. В идеале, есть лезвие близко к верхней части ткани, но ниже папиллярных мышц и убедитесь, что есть жидкость, покрывающая ткани и лезвие перед нарезкой.
- Отрегулируйте, где начать нарезку ткани, выбрав кнопку заранее. Нажмите на кнопку ломтик и увеличить скорость с помощью ручки для перемещения лезвия к краю ткани. Затем нажмите на резкую сторону, чтобы остановиться, и нажмите кнопку заранее, чтобы инактивировать процесс.
- Отрегулируйте параметры резки: передовая скорость 0,03 мм/с, частота вибрации 80 Гц и горизонтальная амплитуда вибрации 2 мм. Затем начните нарезку, выбрав кнопку среза.
- Пусть ломтик вибратом, пока не достигнет конца ткани, но прежде чем он попадает в задней части держателя образца. В этот момент, нажмите ломтик снова, чтобы остановить. Нажмите кнопку Return, чтобы вернуться в стартовое положение.
- Выберите автоматическое повторение (нажав его дважды), который позволит вибрирующему микротому автоматически повторять процесс нарезки до 99 раз.
- Сбор ломтиков
- Подождите, пока ломтики полной длины и появляются хорошие (после получения прошлом папиллярных слоев мышц), а затем начать собирать ломтики.
- Соберите ломтики с помощью пластиковой пипетки Pasteur, наполненной раствором холодного Tyrode, чтобы аккуратно захватить ткань из ванны. При необходимости используйте щипцы и пружинные ножницы, чтобы отделить кусок от блока сердца, если ткань все еще прикреплена.
- Перенесите срез на одну ячейку ситечко в ванне с кислородом Tyrode (см. шаг 3.7) и используйте жидкость в пластиковой пипетке Pasteur, чтобы заставить ткань лежать ровно на одном из ситектов клетки, а затем добавьте металлическую шайбу сверху, чтобы удержать ткань вниз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ломтики должны быть инкубированы по крайней мере на 1 ч в растворе Tyrode перед обработкой (это для BDM, чтобы расслабить ткани).
4. Культивирование ломтиков сердца
-
Подготовка ломтиков для культуры
- Обрезать ломтик от краев, чтобы избежать неравномерных краев. Затем, клей его с обоих концов стерилизованных полиуретана 6 мм широкий пояс времени принтера с металлическими проводами встроенных с помощью ткани клея.
- Перенесите поддерживаемые срезы сердца на 6 колодцев, которые содержат 6 мл культуры среды в каждом колодце.
- Поместите крышку пластины стимуляции (Таблица Материалов) на верхней части 6 хорошо пластины и подключить крышку к клеточной культуре электрического стимулятора (Таблица материалов). Отрегулируйте стимулятор, чтобы электрически стимулировать срезы сердца при 10 В, 1,2 Гц непрерывно все время.
ПРИМЕЧАНИЕ: После подключения стимуляции, сердце ломтики начнут биться, и это движение будет визуально очевидным. - Перенесите пластины в инкубатор и поддерживать при 37 градусах Цельсия с увлажненным воздухом и 5% CO2.
- Изменение культуры среднего 3x в день и добавить 6 мл культуры среды в хорошо во время каждого изменения мультимедиа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Культурная среда насыщена кислородом в течение 5 минут до каждого изменения мультимедиа. Средний должен быть изменен не менее 1x в день; это нормально по выходным, если это необходимо. Два дня только 1 изменение мультимедиа в день является максимальным, что проверяется. -
Изменение стимуляции пластины покрова каждый день, чтобы предотвратить высвобождение токсичных частиц графита в среде культуры (как правило, во время смены средств массовой информации в середине дня).
- Удалите крышку пластины стимуляции из культуры блюдо и вставить белую пену штепсельную вилку, где крышка подключается к кабелю для клеточной культуры электрического стимулятора, чтобы предотвратить повреждение воды в электрической цепи.
- Поместите крышку пластины в ванну из автоклавированной воды с 2x антибиотик-антимикотик. Храните его в этой ванне (т.е. промывка ванны) на ночь.
- На следующий день переместите крышку пластины в 70%-ую ванну на этанол в течение 5–15 минут для обеззараживания. Встряхните столько жидкости от устройства перед переключением ванны.
- Затем перенесите крышку пластины в третью и последнюю ванну (т.е. чистую ванну), которая состоит из автоматической воды и 2-кратного антибактериально-антимикотика, чтобы промыть все оставшиеся следы этанола.
- После промывки пластины крышку в чистой ванне, использовать чистую без ворса протрите (распыляется вниз с этанолом), чтобы высушить любые остаточные воды на пластиковых частей, а затем удалить белый кусок пены и тщательно поместите крышку пластины обратно на культурную пластину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к черным графитным электродам, которые попадают в колодец, так как устройство больше не будет стерильным. - Используя стерильные щипц, убедитесь, что ткань находится в центре колодца, чтобы крышка пластины не касаться ткани. Убедитесь, что изогнутая сторона крышки пластины совпадает с угловой стороной пластины и что квадратные углы выстраиваются в линию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму загрязнение крышки пластинстимуляции, держите их в чистоте и пустых 6 скважинах после окончания эксперимента.
- Выполните MTT асссс, измерения кальция и сократительных оценок функции на свежих свиных ломтиков сердца (день 0), и после 6 дней в культуре в соответствии с Ou et al.13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя коммерчески доступные клеточной культуры электрического стимулятора, который может вместить восемь 6 хорошо пластин ы сразу, мы эмулировали взрослых сердечных среды, вызывая электрическую стимуляцию на физиологической частоте (1,2 Гц), и скрининг для основных средних компонентов, чтобы продлить продолжительность функциональных свиных ломтиков сердца в культуре13. Так как свинья и человеческие сердца похожи по размеру и анатомии15, мы разработали биомиметическую систему культуры среза сердца с использованием свиных сердец и впоследствии подтвердили его в человеческих срезах сердца. Здесь мы подробно протокол для свиных ломтиков сердца, который является той же процедурой для человеческого сердца нарезки и культивирования. Новая биомиметическая культура установки описано здесь, поддерживается жизнеспособность свиного сердца ломтики в течение 6 дней, как оценивается MTT ассс(Рисунок 1A). Мы подтвердили функциональную жизнеспособность этих ломтиков в течение 6 дней, оценивая их гомеостаз кальция и сократительную силу. В первые 6 дней, нет спонтанных переходных кальция в кардиомиоцитов, и кардиомиоциты ответили на внешнюю электрическую стимуляцию, а также адренергической стимуляции похож на свежие ломтики сердца (Рисунок 1B). Кроме того, контрактная сила и ответы на изопротеренол поддерживаются в культивированных ломтиках сердца на срок до 6 дней, подобно тем, что свежие ломтики сердца(рисунок 1C,D).
Рисунок 1: Проверка жизнеспособности и функциональности культуры свиного сердца. (A) Количественная оценка жизнеспособности сердечного ломтика с течением времени с помощью анализа MTT в либо стимулируемой или нестимулированной системе культуры в оптимизированной среде (n no 5 свиных сердец каждый в тройном, SEM представлен как бары ошибок; двусторонний тест ANOVA был проведен для сравнения между группами, qp qlt; 0.05). (B) Представитель кальция сигнала след от свежего сердца ломтик (день 0) и после 6 дней в культуре (день 6) с и без 1 мкм изопротеренол (Iso) стимуляции. Переходы были зарегистрированы после загрузки ломтиков сердца с помощью красителя кальция Fluo-4 и с использованием 1 Hz/20 V электрической стимуляции во время записи. Количественная оценка амплитуды сигнала кальция с изопротеренолом и без нее показывает аналогичную структуру переходных кальция в день 0 и 6 день в культуре (n no 4 свиных сердец, 10-15 ячеек, проанализированных в каждой, SEM представлен как бары ошибок; двусторонний тест ANOVA был проведен для сравнения между группами, Qp qlt; 0,05 сравнивая базовую линию со стимуляцией Изо в то же время, p-valueD0 против D6 и 0,95, и p-valueD0 Iso против D6 Iso 0,93). (C) Настройка оценки контрактной силы (левая панель); ломтик сердца (HS) висят между преобразователем силы (FT) и стабильным столбом (P) между двумя электрическими электродами (EE) для электрической стимуляции. При стимуляции срезаные контракты и сокращения регистрируются с помощью назначенного программного обеспечения (правая панель). (D) Бар график показывает количественную оценку контрактной силы в присутствии или отсутствии изопротеренола (Iso) порожденных свежих свиных ломтиков сердца (день 0) и после 6 дней в биомиметической культуры (n - 4 свиньи сердца каждый в тройном, SEM представлен в виде баров ошибок; двусторонний тест ANOVA был проведен для сравнения между группами, qp qlt; 0,05 сравнения базового показателя iso стимуляции в то же время точки, подергивание силы: p-значениеD0 против D6 0,96, p-стоимостьD0 Iso против D6 Iso 0,81; время до 50% релаксации: p-значение D0 против D6 0,47, р-значениеD0 Iso против D6 Iso 0,43). Эта цифра была изменена из Ou et al.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Состояние | Фишер и др.16 | Ou et al.13 |
| Видов | Человека | Свинья и человек |
| Болезни | Неудачные сердца | Нормальные здоровые сердца |
| Сохранение | Сохраненные ткани | Свежие ткани |
| Толщина нарезана | 300 мкм | 300 мкм |
| Средняя оксигенация | Нет | Интермиттирующая оксигенация |
| Культура Средний | M199/ITS | M199/ITS/FBS/VEGF/FGF |
| Агитации | Да | Нет |
| Скорость шага | 0,2 Гц | 1,2 Гц |
| Продолжительность культуры | 4 месяца с компромиссом | 6 дней без компромиссов |
| Температура кутюр | 37 | 37 |
| Механическая загрузка | auxotonic нагрузка | без погрузки |
| Проверенные временные точки без изменения экспрессии генов по сравнению со свежим срезом сердца | N/A | 2 и 6 дней |
| Первый испытанный временной момент, чтобы показать изменения в экспрессии генов | День 8 | День 10 |
Таблица 1: Сравнение между условиями нарезки и культивирования, используемыми в Фишери и др.16 и Ou et al.13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем подробный видеопротокол для нашего недавно опубликованного метода для упрощенной средней пропускной способностью (процессы до 48 ломтиков / устройства) метод, который позволяет культуры свиного сердца ломтики в течение периода достаточно долго, чтобы проверить острой кардиотоксичности13. Предлагаемые условия имитируют окружающую среду сердца, включая частоту электрической стимуляции, наличие питательных веществ и прерывистую оксигенацию. Мы приписываем длительную жизнеспособность сердечных ломтиков в нашей биомиметической стимулируемой культуре к нашему сосредоточению на воссоздании физиологических условий, испытываемых нетронутым сердцем. Эта концепция поддерживается нашими данными, показывающими, что электрическая стимуляция сама по себе, без предоставления необходимых питательных веществ, не является достаточной для поддержания жизнеспособности сердечного ломтика13. Таким образом, новые компоненты среды культуры являются основным фактором для продления жизнеспособности и функциональности сердечного среза в культуре. Мы обнаружили, что важно включить FBS в среде для поддержания жизнеспособности, которая, вероятно, из-за требования для различных жирных кислот, микроэлементов, ферментов, белков, макромолекулы, химические компоненты и гормоны, которые обычно присутствуют в сыворотке и доставлены в ткани сердца in vivo17. Кроме того, мы обнаружили, что добавление FGF и VEGF в среде культуры необходимо для повышения жизнеспособности тканей. FGF и VEGF известны ангиогенные факторы, которые необходимы для поддержания культивированных эндотелиальных клеток18. Таким образом, вполне вероятно, что FGF и VEGF необходимы для поддержания эндотелиальных клеток и соединительных тканей в культуре для поддержки жизнеспособности тканей. Наша работа является первой модификацией упрощенной среды культуры, о которых ранее сообщалось для культивирования срезов сердца, и открывает возможность для дальнейшей оптимизации компонентов мультимедиа в последующих исследованиях.
Своевременно с нашим новым методом, было три других исследований, которые продемонстрировали важность непрерывной электромеханической стимуляции в поддержании ломтиков в культуре в биоинженерных систем16,19,20. Тем не менее, эти исследования использовали базальную среду M199/ITS, которая не достаточна для поддержания метаболических потребностей ломтиков сердца. Это привело к нескольким компромиссам в срез контрактности и кальция гомеостаза рано во время культуры16,19,20. Цяо и др.19 разработали высокосложные биоинженерные чипы, которые могут поддерживать электрофизиологические свойства срезов сердца в течение 4 дней, но оценка контрактной функции не была предоставлена. Watson et al.20 биоинженерировали систему низкой пропускной энергии (обрабатывает до 4 ломтиков/устройства), чтобы продемонстрировать важность длины диастолического саркомера для поддержания свойств сердечной мышцы в течение 24 ч. Наконец, Фишер и др.16 показали, что не удалось человеческого сердца ломтики могут поддерживаться в пробирке в течение 4 месяцев, когда культивируется под 0,2 Гц стимуляции, auxotonic нагрузки и медиа агитации в биоинженерии устройства. Тем не менее, эти условия индуцированных различные изменения в сердце ломтики, как это отражено в их данных RNAseq, которые показали более 10 раз downregulation сердечного экспрессии генов уже в первый раз точки оценки (день 8)16. Тем не менее, в нашей оптимизированной системе культуры, только 2 и 5 стенограммы были значительно дифференциально выражены после 2 и 6 дней в культуре по сравнению со свежей ткани сердца, соответственно. Однако после 10 дней в культуре произошли значительные изменения в выражении более 500 стенограмм. Даунрегулируемые гены после 10 дней в культуре были в основном связаны с сердечной мышцей, в то время как upregulated гены связаны с фибробластами, внеклеточной матрицы, и воспаление13. Таблица 1 включает полное сравнение протоколов нарезки и культуры между Фишером и др.16 и Ou et al.13. Таким образом, наша биомиметическая стимулируемая культурная система эмулирует контролируемые условия, испытываемые сердцем на месте, и, следовательно, должна обеспечить надежное считывание функционального и структурного исхода медикаментозного лечения в связи с острой кардиотоксичностью или эффективностью по сравнению с скомпрометированными системами культуры.
Одним из основных ограничений этой культурной системы является то, что, хотя наша культурная система может подражать нескольким физиологическим условиям, она не может имитировать изменения в механической нагрузке и стрессе сдвига во время сердечного контрактного цикла. Дальнейшая оптимизация физиологических и метаболических факторов может помочь продлить жизнеспособность и функцию сердечного среза. Кроме того, мы заметили раннюю адаптацию, которая приводит к уменьшению окислительного фосфорилирования, которые могут спровоцировать ухудшение жизнеспособности сердечного ломтика13. К сожалению, до сих пор нам не удалось определить оптимальный метод поддержания окислительного фосфорилирования. Вполне вероятно, что повышение метаболизма жирных кислот в срезах сердца не так просто, как добавление жирных кислот в среду роста, и потребует дальнейшей оптимизации, которая может быть рассмотрена в будущих исследованиях. Кроме того, общей слабостью этого подхода является отсутствие измерения потенциалов действия на одиночных кардиомиоцитах в срезе сердца, что необходимо для демонстрации нарушения электрокардиограммы и желудочковой аритмии. Поэтому необходимо оптимизировать протоколы для изоляции отдельных кардиомиоцитов от срезов сердца после лечения кардиотоксинами, которые вызывают нарушение электрокардиограммы, и оценить их влияние на потенциал действия на изолированные кардиомиоциты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
TMAM владеет акциями Tenaya Therapeutics. Другие авторы не сообщают о каких-либо конфликтах.
Acknowledgments
TMAM поддерживается грантом NIH P30GM127607 и грантом Американской ассоциации сердца 16SDG29950012. RB поддерживается P01HL78825 и UM1HL113530.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks - | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
- Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature. BMC Medicine. 14, 10 (2016).
- Fermini, B., Fossa, A. A. The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).
- Moslehi, J. J. Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies. The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).
- Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).
- Kretzschmar, K., et al. Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).
- Perbellini, F., et al. Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices. Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Jones, S. P., et al. The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs. Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).
- Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).
- Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts. BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).
- Vuorenpaa, H., et al. Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 50 (4), 275-286 (2014).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).
