Summary

Нарезка и культивирование свиных сердец в физиологических условиях

Published: March 20, 2020
doi:

Summary

Этот протокол описывает, как нарезать и культуры сердечной ткани в физиологических условиях в течение 6 дней. Эта культурная система может быть использована в качестве платформы для тестирования эффективности новых терапевтических препаратов сердечной недостаточности, а также надежного тестирования острой кардиотоксичности в 3D-модели сердца.

Abstract

Многие новые препараты не в клинических исследованиях из-за кардиотоксических побочных эффектов, как в настоящее время доступны в пробирке анализы и in vivo животных моделей плохо предсказать человека сердечной обязательств, что создает многомиллиардное бремя на фармацевтической промышленности. Таким образом, во всем мире существует неудовлетворенная медицинская потребность в более эффективных подходах к выявлению сердечно-токсичности наркотиков, прежде чем проводить дорогостоящие и трудоемкие испытания «первых в людях». В настоящее время, только незрелые сердечные клетки (человек индуцированных плюрипотентных стволовых клеток полученных кардиомиоцитов (hiPSC-CMs) используются для проверки терапевтической эффективности и токсичности наркотиков, поскольку они являются единственными человеческими сердечными клетками, которые могут быть культивированы в течение длительных периодов времени для проверки эффективности и токсичности препарата. Однако один тип клеток не может воспроизвести фенотип сложной 3D-ткани сердца, которая формируется из нескольких типов клеток. Важно отметить, что влияние препаратов необходимо протестировать на взрослых кардиомиоцитов, которые имеют различные характеристики и токсичность реакции по сравнению с незрелыми hiPSC-CMs. Культивирование человеческих ломтиков сердца является перспективной моделью нетронутыми человеческого миокарда. Эта технология обеспечивает доступ к полной многоклеточной системе, которая имитирует ткани сердца человека и отражает физиологические или патологические условия миокарда человека. Недавно, путем оптимизации компонентов культурных медиа и условий культуры, чтобы включить непрерывную электрическую стимуляцию на уровне 1,2 Гц и прерывистую оксигенацию культуры среды, мы разработали новую систему культуры, которая сохраняет жизнеспособность и функциональность человеческих и свиных ломтиков сердца в течение 6 дней в культуре. В текущем протоколе мы подробно описываем метод нарезки и культивирования свиного сердца в качестве примера. Тот же протокол используется для культуры ломтики из человеческих, собак, овец или кошек сердца. Эта культурная система имеет потенциал, чтобы стать мощным прогностическим человеком на месте модели для острого тестирования кардиотоксичности, которая закрывает разрыв между результатами доклинических и клинических испытаний.

Introduction

Препарат индуцированной кардиотоксичности является основной причиной вывода рынка1. В последнее десятилетие20-го века, восемь не сердечно-сосудистых препаратов были сняты с рынка, поскольку они привели к внезапной смерти из-за желудочковой аритмии2. Кроме того, несколько противораковых методов лечения (в то время как во многих случаях эффективным) может привести к нескольким кардиотоксическим эффектам, включая кардиомиопатию и аритмии. Например, как традиционные (например, антрациклы и радиация), так и целевая (например, трастузумаб) терапия рака молочной железы могут привести к сердечно-сосудистым осложнениям у подмножества пациентов3. Тесное сотрудничество между кардиологами и онкологами (через формирующуюся область “кардиоонкологии”) помогло сделать эти осложнения управляемыми, гарантируя, что пациенты могут быть эффективно лечить2. Менее ясны сердечно-сосудистые эффекты новых агентов, в том числе Her2 и PI3K ингибиторы, особенно когда терапии используются в комбинации. Таким образом, существует растущая потребность в надежных стратегиях доклинического скрининга сердечно-сосудистой токсичности, связанной с возникающими противораковыми методами лечения до клинических испытаний на людях. Отсутствие культурных систем для тканей сердца человека, которые функционально и структурно жизнеспособны для более чем 24 ч является ограничивающим фактором для надежного тестирования кардиотоксичности. Поэтому необходимо срочно разработать надежную систему культивирования тканей сердца человека в физиологических условиях для тестирования токсичности лекарств.

Недавнее движение в направлении использования антропогенных плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов (hiPSC-CMs) в кардиотоксичности тестирования предоставил частичное решение для решения этой проблемы; однако, незрелый характер hiPSC-CMs и потеря целостности ткани по сравнению с многоклеточной природой сердечной ткани являются основными ограничениями этой технологии4. Недавнее исследование частично преодолело это ограничение путем изготовления сердечных тканей из HIPSC-CMs на гидрогелях и подвергая их постепенному увеличению электрической стимуляции с течением времени5. Однако их электромеханические свойства не достигли зрелости, наблюдаемой у взрослого человека миокарда. Кроме того, сердечная ткань структурно сложнее, состоящая из различных типов клеток, включая эндотелиальные клетки, нейроны и различные типы стромальных фибробластов, связанных вместе с очень специфической смесью внеклеточных матричных белков6. Эта неоднородность некардиомиоцитной популяции клеток7,,8,,9 у сердца взрослых млекопитающих является основным препятствием в моделировании сердечной ткани с использованием отдельных типов клеток. Эти основные ограничения подчеркивают важность разработки методов, позволяющих культуре нетронутой сердечной ткани для оптимальных исследований с участием физиологических и патологических состояний сердца5.

Культивирование человеческих ломтиков сердца является перспективной моделью нетронутой человеческой миокарда. Эта технология обеспечивает доступ к полной 3D многоклеточной системе, которая похожа на ткани сердца человека, которые могут надежно отражать физиологические или патологические условия миокарда человека. Тем не менее, его использование было серьезно ограничено коротким периодом жизнеспособности в культуре, который не выходит за пределы 24 ч с использованием самых надежных протоколов сообщили до 201810,11,12. Это ограничение было связано с несколькими факторами, включая использование воздушно-жидкого интерфейса для культуры ломтики, и использование простой среды культуры, которая не поддерживает высокие энергетические требования сердечной ткани. Недавно мы разработали систему подводной культуры, которая способна обеспечить непрерывную электрическую стимуляцию и оптимизировать компоненты культуры средств массовой информации, чтобы сохранить срезы сердечной ткани жизнеспособными на срок до 6 дней13. Эта культурная система имеет потенциал, чтобы стать мощным прогностическим человеком на месте модели для острого тестирования кардиотоксичности, чтобы закрыть разрыв между доклиническими и клиническими результатами тестирования. В текущей статье мы подробно описываем протокол для нарезки и культивирования ломтиков сердца с помощью свиного сердца в качестве примера. Тот же процесс применяется к человеческому, собаке, овце или кошке сердца. С помощью этого протокола мы надеемся распространить технологию в другие лаборатории научного сообщества.

Protocol

Все процедуры для животных были в соответствии с институциональными руководящими принципами Университета Луисвилла и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию. 1. Подготовка к нарезке (за день до нарезки) Подготовка вибрирующ?…

Representative Results

Используя коммерчески доступные клеточной культуры электрического стимулятора, который может вместить восемь 6 хорошо пластин ы сразу, мы эмулировали взрослых сердечных среды, вызывая электрическую стимуляцию на физиологической частоте (1,2 Гц), и скрининг для основн?…

Discussion

Здесь мы описываем подробный видеопротокол для нашего недавно опубликованного метода для упрощенной средней пропускной способностью (процессы до 48 ломтиков / устройства) метод, который позволяет культуры свиного сердца ломтики в течение периода достаточно долго, чтобы проверить остр…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

TMAM поддерживается грантом NIH P30GM127607 и грантом Американской ассоциации сердца 16SDG29950012. RB поддерживается P01HL78825 и UM1HL113530.

Materials

1000ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems VWR 28199-812
2,3-Butanedione monoxime (BDM) Fisher AC150375000
500ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems VWR 28199-788
6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) Ion Optix CLD6WFC
6-well plates Fisher 08-772-1B
Agarose Bioline USA BIO-41025
Antibiotic-Antimycotic Thermo 15-240-062
C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) Ion Optix CEP100
Calcium Chloride (CaCl2) Fisher C79-500
Ceramic Blades for Vibrating Microtome Campden Instruments 7550-1-C
Cooley Chest Retractor Millennium Surgical 63-G5623
D-Glucose Fisher D16-1
Disposable Scalpel #20 Biologyproducts.com DS20X
Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning VWR 21008-952
Fetal Bovine Serum Thermo A3160502
Graefe Forceps Fisher NC9475675
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3149-50KU
HEPES Fisher BP310-1
Histoacryl BLUE Tissue glue Amazon https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/
Iris Spring scissors Fisher NC9019530
Iris Straight Scissors Fisher 731210
Isoflurane, USP Piramal NDC 66794-017-25
ITS Liquid Media Supplement Sigma-Aldrich I3146-5ML
Ketamine HCl (500 mg/10 mL) West-Ward NDC 0143-9508
Magnesium Chloride (MgCl2) Fisher M33-500
Mayo SuperCut Surgical Scissors AROSurgical Instruments Corporation AROSuperCut™ 07.164.17
Medium 199, Earle's Salts Thermo 11-150-059
Oxygen regulator Praxair
Oxygen tanks – Praxair
Plastic Pasteur pipettes Fisher 13-711-48
Potassium Chloride (KCl) Fisher AC193780010
Printer Timing Belt Amazon https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/
Razor rectangle blades Fisher 12-640
Recombinant Human FGF basic R&D Systems 233-FB-025/CF
Recombinant Human VEGF R&D Systems 293-VE-010/CF
Retractable scalpels Fisher 22-079-716
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher AC217125000
Sodium Chloride (NaCl) Fisher AC327300010
Vibrating Microtome Campden Instruments 7000 SMZ-2
Xylazine HCl (100 mg/mL) Heartland Veterinary Supply NADA 139-236

References

  1. Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature. BMC Medicine. 14, 10 (2016).
  2. Fermini, B., Fossa, A. A. The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).
  3. Moslehi, J. J. Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies. The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).
  4. Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).
  5. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  6. Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
  7. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
  8. Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).
  9. Kretzschmar, K., et al. Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).
  10. Perbellini, F., et al. Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices. Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).
  11. Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
  12. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
  13. Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
  14. Jones, S. P., et al. The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs. Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).
  15. Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
  16. Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).
  17. Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts. BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).
  18. Vuorenpaa, H., et al. Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 50 (4), 275-286 (2014).
  19. Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).
  20. Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).

Play Video

Cite This Article
Ou, Q., Abouleisa, R. R., Tang, X., Juhardeen, H. R., Meki, M. H., Miller, J. M., Giridharan, G., El-Baz, A., Bolli, R., Mohamed, T. M. Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions. J. Vis. Exp. (157), e60913, doi:10.3791/60913 (2020).

View Video