Этот протокол описывает, как нарезать и культуры сердечной ткани в физиологических условиях в течение 6 дней. Эта культурная система может быть использована в качестве платформы для тестирования эффективности новых терапевтических препаратов сердечной недостаточности, а также надежного тестирования острой кардиотоксичности в 3D-модели сердца.
Многие новые препараты не в клинических исследованиях из-за кардиотоксических побочных эффектов, как в настоящее время доступны в пробирке анализы и in vivo животных моделей плохо предсказать человека сердечной обязательств, что создает многомиллиардное бремя на фармацевтической промышленности. Таким образом, во всем мире существует неудовлетворенная медицинская потребность в более эффективных подходах к выявлению сердечно-токсичности наркотиков, прежде чем проводить дорогостоящие и трудоемкие испытания «первых в людях». В настоящее время, только незрелые сердечные клетки (человек индуцированных плюрипотентных стволовых клеток полученных кардиомиоцитов (hiPSC-CMs) используются для проверки терапевтической эффективности и токсичности наркотиков, поскольку они являются единственными человеческими сердечными клетками, которые могут быть культивированы в течение длительных периодов времени для проверки эффективности и токсичности препарата. Однако один тип клеток не может воспроизвести фенотип сложной 3D-ткани сердца, которая формируется из нескольких типов клеток. Важно отметить, что влияние препаратов необходимо протестировать на взрослых кардиомиоцитов, которые имеют различные характеристики и токсичность реакции по сравнению с незрелыми hiPSC-CMs. Культивирование человеческих ломтиков сердца является перспективной моделью нетронутыми человеческого миокарда. Эта технология обеспечивает доступ к полной многоклеточной системе, которая имитирует ткани сердца человека и отражает физиологические или патологические условия миокарда человека. Недавно, путем оптимизации компонентов культурных медиа и условий культуры, чтобы включить непрерывную электрическую стимуляцию на уровне 1,2 Гц и прерывистую оксигенацию культуры среды, мы разработали новую систему культуры, которая сохраняет жизнеспособность и функциональность человеческих и свиных ломтиков сердца в течение 6 дней в культуре. В текущем протоколе мы подробно описываем метод нарезки и культивирования свиного сердца в качестве примера. Тот же протокол используется для культуры ломтики из человеческих, собак, овец или кошек сердца. Эта культурная система имеет потенциал, чтобы стать мощным прогностическим человеком на месте модели для острого тестирования кардиотоксичности, которая закрывает разрыв между результатами доклинических и клинических испытаний.
Препарат индуцированной кардиотоксичности является основной причиной вывода рынка1. В последнее десятилетие20-го века, восемь не сердечно-сосудистых препаратов были сняты с рынка, поскольку они привели к внезапной смерти из-за желудочковой аритмии2. Кроме того, несколько противораковых методов лечения (в то время как во многих случаях эффективным) может привести к нескольким кардиотоксическим эффектам, включая кардиомиопатию и аритмии. Например, как традиционные (например, антрациклы и радиация), так и целевая (например, трастузумаб) терапия рака молочной железы могут привести к сердечно-сосудистым осложнениям у подмножества пациентов3. Тесное сотрудничество между кардиологами и онкологами (через формирующуюся область “кардиоонкологии”) помогло сделать эти осложнения управляемыми, гарантируя, что пациенты могут быть эффективно лечить2. Менее ясны сердечно-сосудистые эффекты новых агентов, в том числе Her2 и PI3K ингибиторы, особенно когда терапии используются в комбинации. Таким образом, существует растущая потребность в надежных стратегиях доклинического скрининга сердечно-сосудистой токсичности, связанной с возникающими противораковыми методами лечения до клинических испытаний на людях. Отсутствие культурных систем для тканей сердца человека, которые функционально и структурно жизнеспособны для более чем 24 ч является ограничивающим фактором для надежного тестирования кардиотоксичности. Поэтому необходимо срочно разработать надежную систему культивирования тканей сердца человека в физиологических условиях для тестирования токсичности лекарств.
Недавнее движение в направлении использования антропогенных плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов (hiPSC-CMs) в кардиотоксичности тестирования предоставил частичное решение для решения этой проблемы; однако, незрелый характер hiPSC-CMs и потеря целостности ткани по сравнению с многоклеточной природой сердечной ткани являются основными ограничениями этой технологии4. Недавнее исследование частично преодолело это ограничение путем изготовления сердечных тканей из HIPSC-CMs на гидрогелях и подвергая их постепенному увеличению электрической стимуляции с течением времени5. Однако их электромеханические свойства не достигли зрелости, наблюдаемой у взрослого человека миокарда. Кроме того, сердечная ткань структурно сложнее, состоящая из различных типов клеток, включая эндотелиальные клетки, нейроны и различные типы стромальных фибробластов, связанных вместе с очень специфической смесью внеклеточных матричных белков6. Эта неоднородность некардиомиоцитной популяции клеток7,,8,,9 у сердца взрослых млекопитающих является основным препятствием в моделировании сердечной ткани с использованием отдельных типов клеток. Эти основные ограничения подчеркивают важность разработки методов, позволяющих культуре нетронутой сердечной ткани для оптимальных исследований с участием физиологических и патологических состояний сердца5.
Культивирование человеческих ломтиков сердца является перспективной моделью нетронутой человеческой миокарда. Эта технология обеспечивает доступ к полной 3D многоклеточной системе, которая похожа на ткани сердца человека, которые могут надежно отражать физиологические или патологические условия миокарда человека. Тем не менее, его использование было серьезно ограничено коротким периодом жизнеспособности в культуре, который не выходит за пределы 24 ч с использованием самых надежных протоколов сообщили до 201810,11,12. Это ограничение было связано с несколькими факторами, включая использование воздушно-жидкого интерфейса для культуры ломтики, и использование простой среды культуры, которая не поддерживает высокие энергетические требования сердечной ткани. Недавно мы разработали систему подводной культуры, которая способна обеспечить непрерывную электрическую стимуляцию и оптимизировать компоненты культуры средств массовой информации, чтобы сохранить срезы сердечной ткани жизнеспособными на срок до 6 дней13. Эта культурная система имеет потенциал, чтобы стать мощным прогностическим человеком на месте модели для острого тестирования кардиотоксичности, чтобы закрыть разрыв между доклиническими и клиническими результатами тестирования. В текущей статье мы подробно описываем протокол для нарезки и культивирования ломтиков сердца с помощью свиного сердца в качестве примера. Тот же процесс применяется к человеческому, собаке, овце или кошке сердца. С помощью этого протокола мы надеемся распространить технологию в другие лаборатории научного сообщества.
Здесь мы описываем подробный видеопротокол для нашего недавно опубликованного метода для упрощенной средней пропускной способностью (процессы до 48 ломтиков / устройства) метод, который позволяет культуры свиного сердца ломтики в течение периода достаточно долго, чтобы проверить остр…
The authors have nothing to disclose.
TMAM поддерживается грантом NIH P30GM127607 и грантом Американской ассоциации сердца 16SDG29950012. RB поддерживается P01HL78825 и UM1HL113530.
1000ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
500ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
HEPES | Fisher | BP310-1 | |
Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
Oxygen regulator | Praxair | ||
Oxygen tanks – | Praxair | ||
Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |