Summary
I den nåværende protokollen forklarer vi hvordan man enkelt kan behandle og kultur tonsillar mononukleære celler fra friske mennesker som gjennomgår delvis kirurgisk mandlene for å studere medfødte immunresponser ved aktivering, etterligne virusinfeksjon i slimhinnevev.
Abstract
Ved å studere isolerte celler fra slimhinne-assosiert lymfoidvev (MALT) kan forståelse av immuncellers respons i patologier som involverer slimhinneimmunitet, fordi de kan modellere vertspatogeninteraksjoner i vevet. Mens isolerte celler avledet fra vev var den første cellekulturmodellen, har bruken blitt neglisjert fordi vev kan være vanskelig å få tak i. I den nåværende protokollen forklarer vi hvordan man enkelt kan behandle og kultur tonsillar mononukleære celler (TMCer) fra friske menneskelige mandler for å studere medfødte immunresponser ved aktivering, etterligne virusinfeksjon i slimhinnevev. Isolering av TMCer fra mandlene er rask, fordi mandlene knapt har noe epitel og gir opp til milliarder av alle store immuncelletyper. Denne metoden tillater påvisning av cytokinproduksjon ved hjelp av flere teknikker, inkludert immunanalyser, qPCR, mikroskopi, strømningscytometri, etc., lik bruk av perifere mononukleære celler (PBMCer) fra blod. Videre viser TMCs en høyere følsomhet for narkotikatesting enn PBMCs, som må vurderes for fremtidige toksisitetsanalyser. Dermed er ex vivo TMCs kulturer en enkel og tilgjengelig slimhinnemodell.
Introduction
Studier på menneskelige organer er begrenset på grunn av tilgjengelighet samt åpenbare etiske årsaker. Imidlertid er de avgjørende for å fullt ut forstå kompleksiteten i menneskelig biologi. Kulturer av isolerte celler (primære kulturer eller cellelinjer) er et standardsystem i cellebiologistudier på grunn av deres tilgjengelighet. Mens isolerte cellekulturer har tillatt fremragende funn, har bruken av cellelinjer kommet nærmere gransking fordi de ikke fullt ut etterligner in vivo organbiologi. Imidlertid er kulturen av tredimensjonale celler eller vevsekplanter svært komplekse4,5,6. Faktisk er et stykke vev eller organ svært heterogen fordi cellesammensetningen varierer avhengig av lokaliseringen i vevet. Dermed, ved hjelp av vev blokker krever analyse av mange tekniske og biologiske replikerer, noe som fører til behov for et stort antall donorer eller pasienter.
Slimhinne-assosiert lymfoid vev (MALT) er strukturelt lik lymfeknuter, men har unike funksjoner, fordi deres hovedrolle er å regulere slimhinne immunitet7. I motsetning til lymfeknuter, som vanligvis ligger i en viss avstand fra vevet, er MALT vanligvis plassert umiddelbart under epitelet i slimhinnevevet. Histologisk består de hovedsakelig av høye konsentrasjoner av B- og T-celler, men også antigen-presenterende celler som makrofager og dendrittiske celler. MALT utgjør ca 50% av lymfoidvevet i menneskekroppen. MALT er delt inn i ni grupper avhengig av deres plassering: GALT (gut-), BALT (bronchus-), NALT (nasal-), CALT (konjunktival), LALT (strupehode-), SALT (hud-), VALT (vulvo-), O-MALT (organisert) og D-MALT (diffust). O-MALT består hovedsakelig av mandlene til Waldeyers tonsillarring og er den mest tilgjengelige MALT8,,9. Faktisk utgjør mandler som ligger i oropharynx den store barrieren som beskytter fordøyelses- og luftveiene mot (potensielle) invasive mikroorganismer10. I tillegg er mandlene dekket av en fin stratifisert plateepitel ikke-keratinizing epitel, støttet av en kapsel av bindevev som inneholder blodkar, nerver og lymfekreft, noe som gir enkel tilgang til immuncellene11,12. Videre er mandlene, den kirurgiske handlingen med å fjerne mandler, en vanlig prosedyre utført på barn som har søvnrelatert pust, noe som gjør mandlene til et lett tilgjengelig vev13 i fysiologiske omgivelser.
Mandler tillater studiet av immuncellerespons i patologier som involverer slimhinneimmunitet. Faktisk, i HIV-infeksjon, fordi mandlene består av en høy konsentrasjon av immunceller, er de hovedmålet for viral replikering, men produserer også en stor mengde cytokiner som ikke oppdages i sirkulasjonen14,15. Ved steady states er sjeldne populasjoner av medfødte celler tilstede i ulike slimhinnevev, inkludert mandlene, men er i hovedsak fraværende fra blod.
Mononukleære celler fra mandlene (TMCer) er dermed en mer relevant og kompleks modell enn PBMCs og kan svare på mer dyptgripende spørsmål. På den annen side kan bruken av vevsekplanter være komplisert og ikke alltid relevant for medfødte immunstudier. Dermed etablerte vi en modell for å studere slimhinne immunaktivering ved hjelp av TMCs16. Her beskriver vi en metode for effektiv isolering av TMCer fra friske menneskelige mandler. Denne metoden gjør det mulig å gjenopprette et stort antall immunceller samtidig som de holder sin integritet for ex vivo-studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prøvene samles ikke spesielt inn for forskningsformål, og studien anses ikke som invasiv. Men human mandler samling krever etisk godkjenning av de lokale relevante myndigheter. I vårt tilfelle ble det godkjent av Comité de Protection des Personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). Videre bes samtykke fra hver pasient eller juridisk representant om å innhente giveres personopplysninger (f.eks. kjønn, alder, historie med ENT-infeksjoner) som kan bidra til å tolke eksperimentelle resultater.
1. Håndtering av humant tonsillarvev
- Sett mandler fra hver donor i ett sterilt 50 ml hetteglass som inneholder 25 ml PBS 1x og transport ved romtemperatur (RT) til laboratoriet i henhold til myndighetens anbefalinger (bruk tre beskyttelsesnivåer: hetteglass, en sikkerhetsboks og en pose).
MERK: Hele prosedyren skal utføres i et biologisk sikkerhetsnivå 2 laboratorium. Alle humane prøver skal håndteres med forsiktighet, da de ikke tidligere har vært kvalifisert og kan inneholde smittsomme stoffer. -
Rengjør alle verktøyene mellom hver bruk.
- Etter bruk demonterer du cellesilen og holder med alle de andre instrumentene (f.eks. pestle, tang) i et bad som inneholder et vaskemiddelløsning (1/10 volum vaskemiddel i H2O) over natten.
- Pensle hvert redskap for å fjerne vevet og vaske med klart vann.
- Tørk alle delene godt, og klargjør deretter cellesilen (85 ml, 37 mm diameter) ved å plassere et 60 mesh stålgitter på toppen av et 10 mesh stålgitter og tett lukke ringen.
- Plasser alle verktøyene i sterile poser og autoklav.
2. Disseksjon av humant tonsillarvev og isolering av tonsillar mononukleære celler (TMCer)
- Plasser cellesilen på en 150 x 25 mm2 (SPL150) cellekulturrett og alle instrumentene i en annen SPL150 for å holde dem sterile.
- Overfør mandlene fra hetteglasset til cellesilen ved hjelp av sterile tang. Hell også i alle PBS, som inneholder noen celler som har utgående mandlene. Om nødvendig, legg til flere PBS for å senke rutenettet.
MERK: Vevet bør nedsenkes til enhver tid for å unngå uttørking. - Fjern cauterized, blodig, og fibroid vev ved hjelp av tang og en skalpell.
MERK: Mandler fjernet fra barn trenger ikke dette trinnet. - Skjær vevet i små biter på mindre enn 0, 5 cm i diameter ved hjelp av skalpellen og de buede pinsettene. Klipp alt vevet slik at de små bitene kan nedsenkes til enhver tid.
- Legg noen biter av vev i cellesilen og skrap dem på rutenettet med et glasspesdyr til bare et veldig tynt lag med hvit stroma gjenstår. Fjern og kast stroma for å unngå å tette rutenettet.
- Når alt vevet er presset gjennom rutenettet, bruk en 10 ml pipette for å overføre all cellefjæring på rutenettet og skrap det en siste gang.
- Overfør cellefjæringen med en 10 ml pipette til et sterilt hetteglass. Vask gitteret og cellesilen med PBS 1x. La cellen suspensjon hvile i 5 min ved RT på benken. Dette trinnet tillater nedbør og agglomerering av restene stroma, døde celler, og eventuelle utgitte DNA, og vil lette neste trinn.
- Plasser en steril 70 μm sil på toppen av et nytt 50 ml hetteglass (fjern forsiktig fra konvolutten) og overfør forsiktig cellefjæringen på den med en 10 ml pipette. Ikke bland suspensjonen, fordi en pellet er ofte tilstede. Hvis silen er tilstoppet, bruk baksiden av en steril 1 ml pipettespiss for å skrape cellene gjennom silen. Endre silen så ofte som nødvendig.
- Sentrifuger cellene ved 250 x g i 10 min ved 4 °C.
- Kast supernatanten og resuspend pellet ved å blande hetteglasset forsiktig, og fyll deretter cellene i 35 ml PBS.
- I et nytt hetteglass plasserer du en ny 70 μm sil på toppen og overfører cellefjæringen på den med en 10 ml pipette. Hvis silen er tilstoppet, bruk teknikken som er beskrevet i trinn 2.7.
3. Isolering av TMCs ved cell tetthet gradient
MERK: TMCene kan brukes etter trinn 2.10. Men for å få en klarere celleløsning og for å fjerne andre cellerester og eventuelle røde celler, anbefales det å utføre en celletetthetsgradientisolering av mononukleære celler.
- Tilsett 15 ml tetthetsgradientmedium (d = 1,076 g/ml) i et nytt 50 ml hetteglass. Hell TMCs-løsningen på toppen av tetthetsgradientmediet, vær forsiktig med å minimere blanding av fjæringen med tetthetsgradientmediet.
- Sentrifuger løsningen ved 1000 x g i 30 min ved RT med akselerasjon og avbryt.
- Fjern med en 10 ml pipette og kast det øvre laget (som for det meste inneholder PBS 1x) uten å forstyrre grensesnittet mellom TMCene og tetthetsgradientmediet.
MERK: TMCene inneholder et lavt antall erytrocytter, derfor er løsningen klar. Dermed kan grensesnittet mellom løsningen av TMCer i PBS og tetthetgradient medium være vanskelig å visualisere. Følgelig kan celler brukes på nytt i RPMI 1640 supplert med 20 mM HEPES (uten FBS) før tetthetsgradienten utføres. - Fjern TMCene med en steril 1 ml pipettespiss og plasser den i et nytt 50 ml hetteglass.
- Vask cellene ved å tilsette 50 ml PBS som inneholder 2 % av fosterets storfeserum (FBS) og 2 mM EDTA og sentrifuger røret ved 250 x g i 10 min ved 4 °C for å fjerne de resterende blodplatene.
- Gjenta trinn 3.5, men sentrifuger røret ved 400 x g i 10 min ved 4 °C.
- Forbered kulturmedium (R10) ved å supplere RPMI 1640 med 10 % varmeaktivert FBS, 2 mM L-glutamin og antibiotikaoppløsningen (100 U/ml penicillium og 100 μg/ml streptomycin).
- Bruk TMCene på nytt i 10 ml R10 og telle cellene. I gjennomsnitt gir denne teknikken 5 x 108-2 x 109 TMCer per par mandler. Cellene kan nå brukes til undersøkelser som PBMCs fra fullblod (f.eks rensing av spesifikk celletype, cellekultur, strømningscytometri, RT-qPCR, frysing, etc.).
-
Om nødvendig, fryse cellene for videre bruk ved hjelp av standard teknikker for primær celle frysing.
- Telle antall celler.
- Sentrifuger cellene og fjern supernatanten. Løs opp pelleten i nok 100% FBS for en endelig konsentrasjon på 1 x 108 celler / ml, og legg deretter til samme volum av en 80% FBS + 20% DMSO-løsning. Cellene vil da være på 5 x 107 celler / ml. Dette trinnet bør gjøres ved 4 °C og FBS- og DMSO-oppløsningen bør oppbevares ved 4 °C før bruk.
- Fordel 1 ml celleløsning i kryorør og legg dem i en langsom frysebeholder som har vært ved 4 °C over natten for å kontrollere frekvensen av cellefrysing. Plasser den ved -80 °C.
- For å tine cellene, plasser kryoovialene i et varmt bad ved 37 °C i noen sekunder med konstant agitasjon. Så snart cellene begynner å tine, overføre dem til 49 ml R10 og sentrifuge for å fjerne DMSO. Telle cellene og bruke dem som PBMCs.
MERK: Selv om frysing og tining av TMCs vil fjerne rusk, vil det også skade noen sjeldne celletyper. Hvis klumper eller rusk er tilstede etter tining, er det best å passere cellefjæringen gjennom en steril 70 μm sil før du bruker den.
4. Fenotyping av TMCer av Flow Cytometri
- Hent 5 x 106 celler fra den forrige løsningen for hvert antistoffblandingspanel som må testes og plasseres i et 5 ml cytometrirør. Hent 1 x 106 celler for den ubebodde kontrollen.
- Vask cellene i PBS og sentrifuge ved 400 x g i 5 min ved 4 °C. Resuspend dem i 500 μL PBS (1 x 106 celler/ml) og inkubere med en levedyktighetsflekk i 30 min ved 4 °C i mørket.
- Tilsett 5 μL varmeinaktivert humant AB-serum per 100 μL celleoppheng og inkuber i 15 min ved 4 °C i mørket.
- Vask cellene i PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA (vaskebuffer) og sentrifuge ved 400 x g i 5 min ved 4 °C.
- Resuspend TMCs i 500 μL vaskebuffer som inneholder antistoffene som beskrevet i tabell 1. Inkuber cellene i 30 min ved 4 °C i mørket.
- Vask cellene i vaskebuffer og sentrifuge ved 400 x g i 5 min ved 4 °C. Resuspend TMCs i 500 μL PBS som inneholder 0,5% av paraformaldehyd (PFA). Hold i mørket ved 4 °C til oppkjøpet av strømningscytometri.
MERK: PFA er farlig. Bruk en kommersiell løsning som er klar til bruk for å klargjøre PFA-løsningen på 0,5 %.
| Antistoff | Klone | Fluorokrom | Selskapet |
| Levende død | BV405 (Andre) | ThermoFisher vitenskapelig | |
| Cd3 (andre) | SP34-2 (andre) | V500 (andre) | BD Pharmingen |
| Cd8 (andre) | Sk1 (andre) | Amcyan (andre) | BD Pharmingen |
| Cd8 (andre) | BW135/80 (Andre) | VioBlue (andre betydninger) | Miltenyi Biotec |
| Cd4 (andre) | RPA-T4 (andre) | Pe-Cy7 (andre) | BD Pharmingen |
| Cd45 (andre) | Hi30 (andre) | PerCP-cy5.5 (Andre) | Bd |
| Cd19 (andre) | hd237 | Ecd (andre) | Beckman Coulter |
| Cd20 (andre) | 2H7 (andre) | Alexa Fluor 700 | BD Pharmingen |
| Cd14 (andre) | M5E2 (andre) | Pe-cy7 (andre) | BD Pharmingen |
| Cd14 (andre) | M5E2 (andre) | Apc | BD Pharmingen |
| Cd16 (andre) | 3G8 (andre) | APC-H7 (andre) | BD Pharmingen |
| Cd56 (andre) | MEM188 (Andre) | Pe | BD Pharmingen |
| Cd123 (andre) | 7G3 (andre) | Pe | BD Pharmingen |
| BDCA-1 (Andre) | L161 (andre) | Stillehavet Blå | BD Pharmingen |
| BDCA-3 (Andre) | AD5-14H12 (Andre) | FITC (andre) | Miltenyi Biotec |
| BDCA-4 (Andre) | AD5-17F6 (Andre) | Apc | Miltenyi Biotec |
| HLA-DR (andre) | G646-6 (Andre) | PerCP-cy5.5 (Andre) | BD Pharmingen |
| Cd11c (andre) | 3.9 | Alexa Fluor 700 | ebiovitenskap |
Tabell 1: Liste over antistoffer for cellekarakterisering etter strømningscytometri.
5. Eksempel på aktivering av TMCer og måling av cytokinproduksjon
- Fortynn TMCene i R10 medium for å få en konsentrasjon på 2 x 106 celler/ml.
- Fordel 400 000 TMCer i 200 μL R10 i en 96 godt rund bunnplate.
- For å aktivere cellene, tilsett 5 μg/ml av TLR7/8 agonist resiquimod (R848) over natten.
- Sentrifuger platene og hent TMCs supernatant og frys den for videre analyse. Cytokinproduksjonen vil bli vurdert ved hjelp av perlebaserte immunoassays for å kvantifisere flere løselige cytokiner samtidig ved hjelp av et strømningscytometer etter produsentens protokoll.
- Vurder levedyktigheten til cellene ved hjelp av en selvlysende celle levedyktighet analyse etter produsentens protokoll. Kort sagt, tilsett 60 μL celle levedyktighet løsning til brønnene og måle luminescens innen 10 min (oppkjøp for 1 s / brønn).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi karakteriserte først immunprofilen til celler som finnes i kulturen og analyserte mengden TMCer. Vi fenotypet TMCs fra mandler med strømningscytometri. Som vist i figur 1var alle store immuncelletyper til stede i PBMCer fra blod representert i TMCene fra mandler. I TMCer var imidlertid frekvensen av alle celletyper, unntatt B-celler, lavere enn i PBMCer.
Figur 1: Fenotyping av TMCer i mandler. TMCer fra friske donorer ble oppnådd etter disseksjon av humant tonsillarvev og isolering av celler. (A)Celler ble farget, og data ble anskaffet av strømningscytometri. Data representerer et representativt eksperiment. (B) Tabellen oppsummerer prosentandelen av hver celletype i levende TMCer i mandler fra seks forskjellige friske donorer og sammenligner hver med prosentandelen av hver celletype i PBMCer fra blod, som definert i litteraturen18,19. Data vises som prosentandelen av live celler SD. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Vi testet deretter de immunologiske reaksjonene til TMCene. En måte å reprodusere en celle aktivering mot et patogen er å stimulere de medfødte immunsensorer fra Toll-Like Reseptorer (TLRs) familie. TLRs er hovedsakelig til stede i monocytter / makrofager, alle dendrittiske celle (DC) undertyper, plasmacytoide dendrittiske celler (pDC), og også i B-celler. I dette eksemplet studerte vi TLR7 og TLR8, fordi de spesialiserer seg på antivirale responser og de fleste tilfeller av tonsillitt (dvs. mandlene infeksjoner) er forårsaket av en virusinfeksjon. TMCs fra mandlene (graf i blått) fra syv friske donorer ble stimulert over natten med TLR7/8 ligand resiquimod (R848). Som i PBMCs (graf i grønt), aktivering gjennom TLR7/8 signalering utløst produksjon av type I interferons (IFN) og pro-inflammatoriske cytokiner. Faktisk var cytokinen mest produsert i TMCs ved aktivering IFNα, et medlem av typen I IFN-familie som hovedsakelig er involvert i medfødt immunitet mot virusinfeksjon og produseres hovedsakelig av pDCene. Alle cytokiner testet, unntatt IFN2/3 og IL-8, ble produsert av TMCs, men på lavere nivåer enn i PBMCs. Interessant, noen cytokiner (hovedsakelig IL-8, men også IL-6, IL-10, og TNFα) var til stede i større mengde på basale nivåer. Videre sammenlignet vi cytokin produsert av isolerte TMCer eller av tonsillar vev blokker utarbeidet som beskrevet tidligere6. Vi målte alle typer IFN produsert i supernatanten av begge cellekulturene ved hjelp av STING-37 cellelinjereporteranalysen som beskrevet tidligere17 og viste at vi bare kunne måle IFN-nivåer i de isolerte TMCene.
Figur 2: TMCer produserte cytokiner ved stimulering. (A) Rensede og isolerte TMCer (blå) og PBMCer (grønn) ble stimulert over natten med R848 (5 μg/ml). Supernatanter ble hentet og frosset til bruk. En perlebasert immunoassay ble utført for å kvantifisere flere løselige cytokiner samtidig ved hjelp av et strømningscytometer. Grafene representerer konsentrasjonen i pikgram per milliliter av hvert målte cytokin. Folden øker er kommentert i rødt på grafene. Mann-Whitney U test. (B) Renset og isolerte TMCer fra mandler (blå) og tonsillar vev blokker (oransje) ble stimulert i 24 timer med influensa A virus (IAV). En STING-37 reporter celle linje analyse ble brukt til å måle IFN produksjon i supernatant. Eske og whisker tomter med median ± minimum til maksimum. Mann-Whitney U test. P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05. NS = ikke-stimulert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Til slutt testet vi levedyktigheten til TMCene. Flere teknikker er tilgjengelige for å måle celle levedyktighet. Her brukte vi en selvlysende celle levedyktighet analyse, en enkel og rask to-trinns analyse. Som vist i figur 3oppdaget vi tydelig cytotoksisiteten indusert av forbindelse 1 i TMCer, som ikke var giftig for PBMCer. Dermed viste TMCs en høyere følsomhet for stoffet testet.
Figur 3: Sammensatt 1 var giftig for TMCer. Rensede og isolerte TMCer og PBMCer ble preincubated med sammensatt 1 (C1) ved ulike konsentrasjoner i 1 time og deretter stimulert over natten med R848 (5 μg/ml). Supernatanter ble hentet, 60 μL celle levedyktighet løsning ble lagt, og luminescens ble målt. Den * representerer den statistiske analysen som sammenligner C1 med NS. Eske og whisker tomter med median ± minimum til maksimum. Kruskal-Wallis test med Dunn sin post hoc korreksjon. P < 0,0001, ***P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05. NS = ikke-stimulert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Menneskelige mandler representerer en integrerende og fysiologisk ex vivo modell for å studere medfødte immunresponser ved slimhinnegrensesnittet, fordi de etterligner rollen som et sekundært lymfoid organ. Interessant, den cellulære sammensetningen av TMCs er lik PBMCs og inkluderer alle de store cellepopulasjonene, selv om deres prosentandel kan være forskjellig fra PBMCs fra blod (Figur 1). Ytterligere populasjoner kan også bli funnet, da alle immunresponser initieres i vev (slimhinne eller sekundære lymfoide organer) og ikke i blod.
Bruken av humane vevsekplanter samt bruk av cellekultur eller blodceller har hver sine fordeler. Men for av studien cytokin sekresjon og celleaktivering, vev explants var ikke den beste modellen. Faktisk kunne vi ikke oppdage noen IFN-produksjon i supernatanten av vevsekplanter (figur 2B). Vi spekulerer i at det er direkte konsumert av de omkringliggende cellene. På den annen side kan stimulering av blodceller (PBMCs) etterligne den primære responsen på infeksjon, men ikke etterligne hva som skjer i vevet, hvor de fleste cytokinene produseres og hvor virus replikerer. Derfor setter vi opp en protokoll for å isolere og rense celler som oppstår fra et sekundært lymfoidvev, mandlene. Vi renset TMCer fra friske menneskelige mandler, som tillater oss å undersøke immuncelleaktivering ved stimulering. Imidlertid er en av begrensningene i denne modellen at TMCs ikke produserer så mange pro-inflammatoriske cytokiner som PBMCs ex vivo ved TLR7/8 stimulering, selv om nivåer av IFNα, den store antivirale cytokin, er lik i begge kulturer.
Studien av sammensatt toksisitet på TMCer versus PBMCs viste at TMCer er mer følsomme for et giftig stoff (figur 3). Dermed bør toksisiteten av nye legemidler og fremtidige behandlinger testes i celler fra vev og ikke bare på cellelinjer, PBMCer eller vevsekplanter. Derfor synes bruk av TMCs for narkotikatesting å være en fremtidig anvendelse av metoden som er beskrevet.
Mandler fra voksne eller barn kan fås og behandles som beskrevet. Vi anbefaler imidlertid å skaffe mandler fra barn av to hovedgrunner: 1) Barnas mandler inneholder flere celler enn de voksnes20. Faktisk er tonsillar hypertrofi spesielt vanlig hos barn, fordi de bekjemper flere barndomsvirus. Dermed kan disse store mandlene bli obstruktive mandler og må fjernes av en delvis mandlene for å unngå komplikasjoner som søvnapné13; 2) Fordi voksnes mandler vanligvis fjernes etter flere episoder av øre-nese-hals (ENT) infeksjoner, disse mandlene er mindre naive og inneholder færre celler.
Det er viktig å jobbe med mandlene så snart som mulig etter fjerningsoperasjonen, ideelt <3 timer etter innsamling. Faktisk, rett etter fjerning og til disseksjon, mandlene fra hver side holdes sammen i en 50 ml sterilt hetteglass som inneholder rundt 20 ml PBS, slik at de er helt nedsenket.
Interdonor variabilitet kan representere et stort problem for reproduserbarhet. Faktisk kan variasjon i cellulær sammensetning mellom givere være betydelig. Vår protokoll, ved hjelp av TMCer og ikke vev explants, begrenser denne variasjonen fordi cellene fra hele mandlene blandes før de blir belagt og plassert i kultur, mens vev explants bringe intradonor variabilitet i cellulær sammensetning fordi bitene kommer fra forskjellige områder innenfor samme prøve. Delvis mandlene kan bare utføres på ikke-betent mandler, noe som begrenser den inflammatoriske statusvariasjonen mellom pasientene. Vi anbefaler også å samle mandler kirurgisk fjernet på forskjellige dager. Vi har tydelig lagt merke til at inter-kirurg og inter-day variasjoner er høyere enn interdonor variasjon (data ikke vist).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) for eksperimenter og N.B. fellesskap (AAP 2017 166). N.S. anerkjenner støtte fra ANRS for fellesskap (AAP 2016 1), European Molecular Biology Organization EMBO for Fellowship (LT 834 2017), oppstartsfinansieringsprogrammet "Baustein" ved Det medisinske fakultet ved Ulm University (LSBN.0147) og Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 meshes steel grid - 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid - 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin - to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1 M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 mm x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
References
- Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
- Jones, H. W. Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection. The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).
- Elmore, S. A. Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).
- Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants. Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).
- Bachert, C., Möller, P. Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut. Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).
- Perry, M. E. The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance. Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).
- Cesta, M. F. Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).
- Kaditis, A. G., et al. Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT. European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).
- Herbeuval, J. P., et al. HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques. AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).
- Herbeuval, J. P., et al. Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).
- Smith, N., et al. Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment. Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).
- Lucas-Hourani, M., et al. Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).
- Kleiveland, C. R. Peripheral Blood Mononuclear Cells. The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).
- Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua. Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).
- Papaioannou, G., et al. Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing. The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).
